История молекулярной биологии - History of molecular biology

История молекулярной биологии начинается в 1930 - х годах с конвергенцией различных, ранее различных биологических и физических дисциплин: биохимии , генетики , микробиологии , вирусологии и физики . В надежде понять жизнь на самом фундаментальном уровне многие физики и химики также интересовались тем, что впоследствии станет молекулярной биологией .

В современном смысле молекулярная биология пытается объяснить явления жизни, исходя из макромолекулярных свойств, которые их порождают. Две категории макромолекул, в частности, находятся в центре внимания молекулярного биолога: 1) нуклеиновые кислоты , среди которых наиболее известна дезоксирибонуклеиновая кислота (или ДНК), составляющая генов , и 2) белки , которые являются активными агентами живых организмов. . Поэтому одно определение области молекулярной биологии состоит в том, чтобы охарактеризовать структуру, функцию и отношения между этими двумя типами макромолекул. Этого относительно ограниченного определения будет достаточно, чтобы позволить нам установить дату так называемой «молекулярной революции» или, по крайней мере, установить хронологию ее наиболее фундаментальных событий.

Общий обзор

В своих самых ранних проявлениях молекулярная биология - название было придумано Уорреном Уивером из Фонда Рокфеллера в 1938 году - была идеей физических и химических объяснений жизни, а не последовательной дисциплиной. После появления теории наследственности на основе менделевских хромосом в 1910-х годах и развития атомной теории и квантовой механики в 1920-х годах такие объяснения казались вполне достижимыми. Уивер и другие поощряли (и финансировали) исследования на стыке биологии, химии и физики, в то время как выдающиеся физики, такие как Нильс Бор и Эрвин Шредингер, обратили свое внимание на биологические спекуляции. Однако в 1930-х и 1940-х годах было непонятно, какие междисциплинарные исследования принесут плоды, если таковые будут; работа в области коллоидной химии , биофизики и радиационной биологии , кристаллографии и других новых областях казалась многообещающей.

В 1940 году Джордж Бидл и Эдвард Татум продемонстрировали существование точной взаимосвязи между генами и белками. В ходе своих экспериментов, соединяющих генетику с биохимией, они переключились с генетической основы Drosophila на более подходящий модельный организм , гриб Neurospora ; создание и использование новых модельных организмов станет постоянной темой в развитии молекулярной биологии. В 1944 году Освальд Эйвери , работающий в Институте Рокфеллера в Нью-Йорке , продемонстрировал, что гены состоят из ДНК (см. Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти ). В 1952 году Альфред Херши и Марта Чейз подтвердили, что генетический материал бактериофага , вируса, поражающего бактерии, состоит из ДНК (см. Эксперимент Херши-Чейза ). В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик открыли двойную спиральную структуру молекулы ДНК на основе открытий, сделанных Розалинд Франклин . В 1961 году Франсуа Жакоб и Жак Моно продемонстрировали, что продукты определенных генов регулируют экспрессию других генов, воздействуя на определенные сайты на краю этих генов. Они также выдвинули гипотезу о существовании посредника между ДНК и ее белковыми продуктами, который они назвали информационной РНК . Между 1961 и 1965 годами была определена взаимосвязь между информацией, содержащейся в ДНК, и структурой белков: существует код, генетический код , который создает соответствие между последовательностью нуклеотидов в последовательности ДНК и серией аминокислот в белки.

Основные открытия молекулярной биологии произошли всего за двадцать пять лет. Потребовалось еще пятнадцать лет, прежде чем новые и более сложные технологии, объединенные сегодня под названием генная инженерия , позволили бы изолировать и охарактеризовать гены, в частности, очень сложных организмов.

Исследование молекулярного доминиона

Если мы оценим молекулярную революцию в контексте биологической истории, легко заметить, что это кульминация длительного процесса, начавшегося с первых наблюдений в микроскоп. Целью этих ранних исследователей было понять функционирование живых организмов, описав их организацию на микроскопическом уровне. С конца 18 века характеристика химических молекул, из которых состоят живые существа, привлекала все большее внимание, наряду с рождением физиологической химии в 19 ​​веке, разработанной немецким химиком Юстусом фон Либихом и после рождения биохимии. в начале 20-го, благодаря другому немецкому химику Эдуарду Бюхнеру . Между молекулами, изучаемыми химиками, и крошечными структурами, видимыми в оптический микроскоп, такими как клеточное ядро ​​или хромосомы, была неясная зона, «мир игнорируемых измерений», как его называл физик-химик Вольфганг. Оствальд . Этот мир населен коллоидами , химическими соединениями, структура и свойства которых не были точно определены.

Успехи молекулярной биологии явились результатом исследования этого неизведанного мира с помощью новых технологий, разработанных химиками и физиками: дифракция рентгеновских лучей , электронная микроскопия , ультрацентрифугирование и электрофорез . Эти исследования выявили структуру и функцию макромолекул.

Важный этап в этом процессе , была работой Полинг в 1949 году, который впервые связана специфическая генетическую мутацию у пациентов с серповидно - клеточной анемии в продемонстрированных изменения в индивидуальной белке, то гемоглобин в эритроцитах из гетерозиготных или гомозиготных особей.

Встреча биохимии и генетики

Развитие молекулярной биологии - это также столкновение двух дисциплин, добившихся значительного прогресса в течение первых тридцати лет двадцатого века: биохимии и генетики. Первый изучает структуру и функции молекул, из которых состоят живые существа. Между 1900 и 1940 годами были описаны основные процессы метаболизма : процесс пищеварения и абсорбция питательных элементов, полученных из пищи, таких как сахар. Каждый из этих процессов катализируется определенным ферментом . Ферменты - это белки, такие как антитела, присутствующие в крови, или белки, ответственные за сокращение мышц. Как следствие, изучение белков, их структуры и синтеза стало одной из основных задач биохимиков.

Вторая дисциплина биологии, появившаяся в начале ХХ века, - это генетика. После повторного открытия законов Менделя в результате исследований Гуго де Фриса , Карла Корренса и Эриха фон Чермака в 1900 году, эта наука начала формироваться благодаря принятию Томасом Хантом Морганом в 1910 году модельного организма для генетических исследований. , знаменитая плодовая муха ( Drosophila melanogaster ). Вскоре после этого Морган показал, что гены локализованы на хромосомах. После этого открытия он продолжил работу с дрозофилой и вместе с многочисленными другими исследовательскими группами подтвердил важность гена для жизни и развития организмов. Тем не менее химическая природа генов и механизмы их действия оставались загадкой. Молекулярные биологи взяли на себя обязательство определить структуру и описание сложных отношений между генами и белками.

Развитие молекулярной биологии было не просто плодом какой-то внутренней «необходимости» в истории идей, но было характерным историческим феноменом со всеми его неизвестными, непредсказуемыми и случайными: замечательными достижениями в физике в начале XX век высветил относительную задержку в развитии биологии, которая стала «новым рубежом» в поисках знаний об эмпирическом мире. Более того, развитие теории информации и кибернетики в 1940-х годах в ответ на военные нужды принесло в новую биологию значительное количество плодотворных идей и, особенно, метафор.

Выбор бактерий и их вируса, бактериофага, в качестве моделей для изучения фундаментальных механизмов жизни был почти естественным - это самые маленькие живые организмы, о которых известно, - и в то же время плод индивидуального выбора. Эта модель обязана своим успехом, прежде всего, известности и чувству организованности Макса Дельбрюка , немецкого физика, который смог создать динамичную исследовательскую группу, базирующуюся в Соединенных Штатах, исключительной сферой деятельности которой было изучение бактериофага. : фаговая группа .

Географическая панорама развития новой биологии была обусловлена ​​прежде всего предыдущими работами. США, где генетика развивалась наиболее быстрыми темпами, и Великобритания, где сосуществовали генетика и биохимические исследования высокого уровня, были в авангарде. Германия, колыбель революций в физике, с лучшими умами и самыми передовыми лабораториями генетики в мире, должна была сыграть первостепенную роль в развитии молекулярной биологии. Но история решила иначе: приход нацистов в 1933 году - и, в меньшей степени, ужесточение тоталитарных мер в фашистской Италии - вызвал эмиграцию большого количества еврейских и нееврейских ученых. Большинство из них бежало в США или Великобританию, что придало дополнительный импульс научному динамизму этих стран. Эти движения в конечном итоге с самого начала сделали молекулярную биологию поистине международной наукой.

История биохимии ДНК

Изучение ДНК - центральная часть молекулярной биологии.

Первое выделение ДНК

Работая в 19 веке, биохимики первоначально выделили ДНК и РНК (смешанные вместе) из ядер клеток. Они относительно быстро оценили полимерную природу своих изолятов «нуклеиновых кислот», но только позже поняли, что нуклеотиды бывают двух типов: один содержит рибозу, а другой дезоксирибозу . Именно это последующее открытие привело к идентификации и названию ДНК как вещества, отличного от РНК.

Фридрих Мишер (1844–1895) в 1869 году открыл вещество, которое он назвал «нуклеином». Несколько позже он выделил чистый образец материала, теперь известного как ДНК, из спермы лосося, а в 1889 году его ученик Ричард Альтманн назвал его "нуклеиновая кислота". Было обнаружено, что это вещество существует только в хромосомах.

В 1919 году Фебус Левен из Института Рокфеллера идентифицировал компоненты (четыре основания, сахар и фосфатную цепь) и показал, что компоненты ДНК связаны в порядке фосфат-сахар-основание. Он назвал каждую из этих единиц нуклеотидом и предположил, что молекула ДНК состоит из цепочки нуклеотидных единиц, связанных вместе через фосфатные группы, которые составляют «основу» молекулы. Однако Левен думал, что цепочка короткая и что основания повторяются в том же фиксированном порядке. Торбьорн Касперссон и Эйнар Хаммерстен показали, что ДНК представляет собой полимер.

Хромосомы и унаследованные черты

В 1927 году Николай Кольцов предположил, что унаследованные признаки будут унаследованы через «гигантскую наследственную молекулу», которая будет состоять из «двух зеркальных цепей, которые будут реплицироваться полуконсервативным образом, используя каждую цепочку в качестве шаблона». Макс Дельбрюк , Николай Тимофеев-Ресовский и Карл Г. Циммер опубликовали в 1935 году результаты, предполагающие, что хромосомы представляют собой очень большие молекулы, структура которых может быть изменена путем обработки рентгеновскими лучами , и что, изменяя их структуру, можно изменить наследственные характеристики, определяемые этими хромосомами. В 1937 году Уильям Эстбери создал первые дифракционные рентгеновские лучи ДНК. Он не смог предложить правильную структуру, но образцы показали, что ДНК имеет регулярную структуру, и поэтому можно было бы вывести, что это за структура.

В 1943 году Освальд Теодор Эйвери и группа ученых обнаружили, что признаки, присущие «гладкой» форме пневмококка, могут быть переданы «грубой» форме тех же бактерий, просто сделав убитую «гладкую» (S) форму доступной. к живой «грубой» (R) форме. Совершенно неожиданно живые бактерии R Pneumococcus трансформировались в новый штамм S-формы, и перенесенные S-характеристики оказались наследственными. Эйвери называл средство передачи черт преобразующим принципом ; он определил ДНК как трансформирующий принцип, а не белок, как считалось ранее. Он существенно переделал эксперимент Фредерика Гриффита . В 1953 году Альфред Херши и Марта Чейз провели эксперимент (эксперимент Херши-Чейза ), который показал на фаге Т2 , что ДНК является генетическим материалом (Херши разделил Нобелевскую премию с Лурией).

Открытие структуры ДНК

В 1950-х годах три группы поставили перед собой цель определить структуру ДНК. Первая группа, которая начала работать в Королевском колледже Лондона, возглавлялась Морисом Уилкинсом, а позже к ней присоединилась Розалинд Франклин . Другая группа, состоящая из Фрэнсиса Крика и Джеймса Уотсона, находилась в Кембридже . Третья группа работала в Калифорнийском технологическом институте и возглавлялась Линусом Полингом . Крик и Ватсон построили физические модели, используя металлические стержни и шары, в которые они включили известные химические структуры нуклеотидов, а также известное положение связей, соединяющих один нуклеотид с другим вдоль полимера. В Королевском колледже Морис Уилкинс и Розалинда Франклин исследовали дифракционные рентгеновские лучи волокон ДНК. Из трех групп только лондонская группа смогла получить дифракционные картины хорошего качества и, таким образом, получить достаточные количественные данные о структуре.

Структура спирали

В 1948 году Полинг обнаружил, что многие белки имеют спиралевидную (см. Альфа-спираль ) форму. Полинг вывел эту структуру из рентгеновских снимков и попыток физически смоделировать структуры. (Позже Полинг также предположил неправильную трехцепочечную спиральную структуру ДНК на основе данных Эстбери.) Даже в первоначальных данных дифракции ДНК, полученных Морисом Уилкинсом, было очевидно, что структура включает спирали. Но это озарение было только началом. Оставались вопросы о том, сколько нитей сошлось, было ли это число одинаковым для каждой спирали, указывали ли основания к оси спирали или от нее, и, в конечном счете, каковы явные углы и координаты всех связей и атомов. Такие вопросы мотивировали усилия Уотсона и Крика по моделированию.

Дополнительные нуклеотиды

В своем моделировании Уотсон и Крик ограничились тем, что они считали химически и биологически разумными. Тем не менее, спектр возможностей был очень широк. Прорыв произошел в 1952 году, когда Эрвин Чаргафф посетил Кембридж и вдохновил Крика описанием экспериментов, которые Чаргафф опубликовал в 1947 году. Чаргафф заметил, что пропорции четырех нуклеотидов варьируются от одного образца ДНК к другому, но для определенных пар нуклеотидов различаются. нуклеотиды - аденин и тимин, гуанин и цитозин - эти два нуклеотида всегда присутствуют в равных пропорциях.

Модель ДНК Крика и Ватсона, построенная в 1953 году, была реконструирована по большей части из оригинальных частей в 1973 году и передана в дар Национальному музею науки в Лондоне.

Используя дифракцию рентгеновских лучей , а также другие данные Розалинды Франклин и ее информацию о том, что основания были спарены, Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик в 1953 году пришли к первой точной модели молекулярной структуры ДНК, которая была принята после проверки Розалинд Франклин. Об открытии было объявлено 28 февраля 1953 года; первая статья Уотсона / Крика появилась в журнале Nature 25 апреля 1953 года. Сэр Лоуренс Брэгг , директор Кавендишской лаборатории , где работали Уотсон и Крик, выступил с докладом в Медицинской школе Гая в Лондоне в четверг, 14 мая 1953 года. В результате в пятницу, 15 мая 1953 г., в лондонской « Ньюс Хроникл» появилась статья Ричи Колдера под названием «Почему ты. Новости достигли читателей The New York Times на следующий день; Виктор К. МакЭлхени , исследуя свою биографию «Ватсон и ДНК: совершая научную революцию», обнаружил вырезку из статьи из шести абзацев New York Times, написанной из Лондона и датированной 16 мая 1953 года с заголовком «Форма жизни». Сканируется блок в ячейке ". Статья вышла в раннем выпуске, а затем была удалена, чтобы освободить место для новостей, которые считались более важными. ( Впоследствии 12 июня 1953 г. в New York Times была опубликована более длинная статья). В субботу, 30 мая 1953 года, студенческая газета Кембриджского университета также опубликовала свою короткую статью об открытии. Первоначальное заявление Брэгга на Сольвеевской конференции по белкам в Бельгии 8 апреля 1953 года осталось незамеченным в прессе. В 1962 году Уотсон, Крик и Морис Уилкинс совместно получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за определение структуры ДНК.

«Центральная догма»

Модель Уотсона и Крика сразу же после презентации вызвала большой интерес. Придя к выводу 21 февраля 1953 года, Уотсон и Крик сделали свое первое объявление 28 февраля. В влиятельной презентации 1957 года Крик изложил « центральную догму молекулярной биологии », которая предсказала взаимосвязь между ДНК, РНК и белков и сформулировал «гипотезу последовательности». Критическое подтверждение механизма репликации, подразумеваемого двойной спиральной структурой, последовавшей в 1958 г. в форме эксперимента Мезельсона – Шталя . Работа Крика с соавторами показала, что генетический код основан на неперекрывающихся триплетах оснований, называемых кодонами, и Хар Гобинд Хорана и другие вскоре после этого расшифровали генетический код (1966). Эти открытия представляют собой рождение молекулярной биологии .

История третичной структуры РНК

Предыстория: спиральная структура РНК

Самые ранние работы в области структурной биологии РНК более или менее совпадали с работами, проводившимися в области ДНК в начале 1950-х годов. В своей основополагающей статье 1953 года Уотсон и Крик предположили, что скопление ван-дер-Ваальса группой 2`OH рибозы не позволит РНК принять двойную спиральную структуру, идентичную предложенной ими модели - то, что мы теперь знаем как B-форму ДНК. Это вызвало вопросы о трехмерной структуре РНК: может ли эта молекула образовывать какой-то тип спиральной структуры, и если да, то как? Как и в случае с ДНК, ранние структурные работы по РНК были сосредоточены вокруг выделения полимеров нативной РНК для дифракционного анализа волокон. Частично из-за неоднородности тестируемых образцов, дифракционные картины ранних волокон обычно были неоднозначными и их трудно было интерпретировать. В 1955 году Марианна Грюнберг-Манаго и его коллеги опубликовали статью, описывающую фермент полинуклеотидфосфорилазу , который отщепляет фосфатную группу от нуклеотиддифосфатов, чтобы катализировать их полимеризацию. Это открытие позволило исследователям синтезировать гомогенные нуклеотидные полимеры, которые они затем объединили для получения двухцепочечных молекул. Эти образцы дали наиболее легко интерпретируемые картины дифракции волокон, которые когда-либо были получены, что свидетельствует об упорядоченной спиральной структуре родственной двухцепочечной РНК, которая отличается от наблюдаемой в ДНК. Эти результаты проложили путь к серии исследований различных свойств и склонностей РНК. В конце 1950-х - начале 1960-х годов было опубликовано множество статей по различным темам в структуре РНК, включая гибридизацию РНК-ДНК, трехцепочечную РНК и даже мелкомасштабную кристаллографию динуклеотидов РНК - GC и AU - в примитивной спирали. вроде аранжировки. Для более глубокого обзора ранних работ в области структурной биологии РНК см. Статью Александра Рича «Эра пробуждения РНК: структурная биология РНК в первые годы » .

Начало: кристаллическая структура тРНК ^ПТО

В середине 1960-х годов интенсивно изучалась роль тРНК в синтезе белка. К этому моменту рибосомы участвовали в синтезе белка, и было показано, что цепь мРНК необходима для образования этих структур. В публикации 1964 года Уорнер и Рич показали, что рибосомы, активные в синтезе белка, содержат молекулы тРНК, связанные в сайтах A и P, и обсудили идею о том, что эти молекулы участвуют в реакции пептидилтрансферазы . Однако, несмотря на значительную биохимическую характеристику, структурные основы функции тРНК оставались загадкой. В 1965 году Холли и др. очистил и секвенировал первую молекулу тРНК, первоначально предполагая, что она приняла структуру клеверного листа, основанную в значительной степени на способности определенных участков молекулы образовывать структуры петли стебля. Выделение тРНК оказалось первой крупной удачей в структурной биологии РНК. После публикации Роберта У. Холли многочисленные исследователи начали работу по выделению тРНК для кристаллографических исследований, разрабатывая улучшенные методы выделения молекулы в процессе работы. К 1968 году несколько групп производили кристаллы тРНК, но они оказались ограниченного качества и не дали данных с разрешением, необходимым для определения структуры. В 1971 году Ким и др. совершил еще один прорыв, создав кристаллы дрожжевой тРНК ^PHE, которые дифрагировали до разрешения 2-3 Ангстремов, с помощью спермина , природного полиамина , который связывается с тРНК и стабилизирует ее. Однако, несмотря на наличие подходящих кристаллов, структура тРНК ^PHE не была сразу решена с высоким разрешением; скорее, потребовались новаторские работы по использованию производных тяжелых металлов и гораздо больше времени, чтобы получить высококачественную карту плотности всей молекулы. В 1973 году Ким и др. создали карту 4 Ангстрема молекулы тРНК, в которой они могли однозначно проследить весь остов. За этим решением последуют многие другие, поскольку различные исследователи работали над уточнением структуры и, таким образом, более тщательно выясняли детали спаривания оснований и взаимодействий стэкинга, а также проверяли опубликованную архитектуру молекулы.

Структура тРНК ^PHE примечательна в области структуры нуклеиновых кислот в целом, поскольку она представляет собой первое решение длинноцепочечной структуры нуклеиновой кислоты любого типа - РНК или ДНК - предшествующее решению Ричарда Э. Дикерсона B- сформировать додекамер почти на десять лет. Кроме того, тРНК ^PHE продемонстрировала многие из третичных взаимодействий, наблюдаемых в архитектуре РНК, которые не подлежат категоризации и более глубокому пониманию в ближайшие годы, обеспечивая основу для всех будущих исследований структуры РНК.

Возрождение: рибозим в форме головки молотка и интрон группы I: P _4-6

В течение значительного времени после появления первых структур тРНК область структуры РНК не претерпевала значительных успехов. Возможность изучения структуры РНК зависела от возможности выделить РНК-мишень. Это оказалось ограничивающим поле в течение многих лет, отчасти потому, что другие известные мишени - например, рибосомы - было значительно труднее изолировать и кристаллизовать. Кроме того, поскольку другие интересные мишени РНК просто не были идентифицированы или недостаточно изучены, чтобы считаться интересными, просто не хватало вещей для структурного изучения. Таким образом, в течение примерно двадцати лет после первоначальной публикации структуры тРНК ^PHE были решены структуры только нескольких других РНК-мишеней, причем почти все они принадлежали семейству транспортной РНК. Этот досадный недостаток возможностей в конечном итоге будет преодолен в значительной степени благодаря двум основным достижениям в исследованиях нуклеиновых кислот: идентификации рибозимов и способности продуцировать их посредством транскрипции in vitro .

После публикации Тома Чеха, в котором интрон группы I Tetrahymena является автокаталитическим рибозимом, и отчета Сидни Альтмана о катализе рибонуклеазой Р РНК, в конце 1980-х были идентифицированы несколько других каталитических РНК, включая рибозим «голова молотка» . В 1994 году McKay et al. опубликовали структуру «комплекса РНК-ДНК-рибозим- ингибитор в форме головки молотка» с разрешением 2,6 Ангстрема, в котором автокаталитическая активность рибозима была нарушена посредством связывания с ДНК-субстратом. Конформация рибозима, опубликованная в этой статье, в конечном итоге была показана как одно из нескольких возможных состояний, и хотя этот конкретный образец был каталитически неактивным, последующие структуры выявили его архитектуру активного состояния. Эта структура была затем Дженнифер Даудна публикацией «ы структуры из Р4-Р6 доменов Tetrahymena группы I интрона, фрагмент рибозимы , первоначально сделанный известным Чеха. Второй пункт в названии этой публикации - Принципы упаковки РНК - кратко демонстрирует ценность этих двух структур: впервые можно было провести сравнения между хорошо описанными структурами тРНК и структурами глобулярных РНК вне семейства передачи. Это позволило построить структуру категоризации для третичной структуры РНК. Теперь стало возможным предложить сохранение мотивов, складок и различных локальных стабилизирующих взаимодействий. Для более раннего обзора этих структур и их значения см. РНК FOLDS: Insights from Recent Crystal Structures, by Doudna and Ferre-D'Amare.

В дополнение к успехам, достигнутым в определении глобальной структуры с помощью кристаллографии, в начале 1990-х годов также была внедрена реализация ЯМР как мощного метода в структурной биологии РНК. Наряду с крупномасштабными структурами рибозимов, решаемых кристаллографически, ряд структур малых РНК и РНК, образующих комплекс с лекарствами и пептидами, был решен с помощью ЯМР. Кроме того, в настоящее время ЯМР используется для исследования и дополнения кристаллических структур, что подтверждается определением изолированной структуры мотива тетрапетли-рецептора, опубликованным в 1997 году. Подобные исследования позволили более точно охарактеризовать взаимодействия спаривания оснований и укладки оснований, которые стабилизировал глобальные складки больших молекул РНК. Важность понимания третичных структурных мотивов РНК была пророчески хорошо описана Мишелем и Коста в их публикации, идентифицирующей мотив тетрапетли : «... не должно быть сюрпризом, если самосворачивающиеся молекулы РНК будут интенсивно использовать только относительно небольшие набор третичных мотивов. Идентификация этих мотивов очень поможет модельным предприятиям, которые будут оставаться важными до тех пор, пока кристаллизация больших РНК остается сложной задачей ».

Современная эпоха: эпоха структурной биологии РНК

Возрождение структурной биологии РНК в середине 1990-х годов вызвало настоящий взрыв в области структурных исследований нуклеиновых кислот. С момента публикации структур «головка молота» и P _4-6 были внесены многочисленные важные вклады в эту область. Некоторые из наиболее примечательных примеров включают структуры интронов Группы I и Группы II , а также Рибосомы, решенные Ненадом Баном и его коллегами в лаборатории Томаса Стейтца . Первые три структуры были получены с использованием транскрипции in vitro , и этот ЯМР сыграл роль в исследовании частичных компонентов всех четырех структур - свидетельство необходимости обоих методов для исследования РНК. Совсем недавно Нобелевская премия по химии 2009 г. была присуждена Аде Йонат , Венкатраману Рамакришнану и Томасу Стейтцу за их структурные работы над рибосомой, демонстрирующие выдающуюся роль структурной биологии РНК в современной молекулярной биологии.

История биохимии белков

Первая изоляция и классификация

Белки были признаны отдельным классом биологических молекул в восемнадцатом веке Антуаном Фуркроем и другими. Члены этого класса (называемые «альбуминоиды», Eiweisskörper или matières albuminoides ) были признаны по их способности коагулировать или флокулировать при различных воздействиях, таких как нагревание или кислота; хорошо известные примеры в начале ХIХ века включали белке из яичного белка , крови сывороточного альбумина , фибрина и пшеничной клейковины . Сходство между приготовлением яичных белков и свертыванием молока было признано еще в древние времена; например, название « белок» для белка яичного белка было придумано Плинием Старшим от латинского albus ovi (яичный белок).

По совету Йенса Якоба Берцелиуса голландский химик Герхардус Йоханнес Малдер провел элементный анализ обычных животных и растительных белков. К всеобщему удивлению, все белки имели почти одинаковую эмпирическую формулу , примерно C ₄₀₀ H ₆₂₀ N ₁₀₀ O ₁₂₀ с отдельными атомами серы и фосфора. Малдер опубликовал свои открытия в двух статьях (1837,1838) и выдвинул гипотезу, что существует одно основное вещество ( Grundstoff ) белков, и что оно синтезируется растениями и всасывается из них животными при пищеварении. Берцелиус был одним из первых сторонников этой теории и предложил название «белок» для этого вещества в письме от 10 июля 1838 года.

Название «белок», которое он предлагает для органического оксида фибрина и альбумина , я хотел получить от [ греческого слова] πρωτειος, потому что он, по-видимому, является примитивным или основным веществом питания животных.

Малдер продолжал , чтобы идентифицировать продукты деградации белков , такие как аминокислоты , лейцин , для которого он нашел (почти правильную) молекулярную массу 131 Да .

Очистки и измерения массы

Минимальная молекулярная масса, предложенная анализом Малдера, составляла примерно 9 кДа , что в сотни раз больше, чем у других изучаемых молекул. Следовательно, химическая структура белков (их первичная структура ) была активной областью исследований до 1949 года, когда Фред Сэнджер секвенировал инсулин . (Правильная) теория о том, что белки представляют собой линейные полимеры аминокислот, связанных пептидными связями, была предложена независимо и одновременно Францем Хофмайстером и Эмилем Фишером на той же конференции в 1902 году. Однако некоторые ученые скептически относились к тому, что такие длинные макромолекулы могут быть стабильными в растворе. . Следовательно, были предложены многочисленные альтернативные теории первичной структуры белка , например, коллоидная гипотеза о том, что белки представляют собой совокупности небольших молекул, циклоловая гипотеза Дороти Ринч , дикетопиперазиновая гипотеза Эмиля Абдерхолдена и пиррол / пиперидиновая гипотеза Тренсгарда (1942). . Большинство этих теорий затрудняло объяснение того факта, что переваривание белков давало пептиды и аминокислоты . Наконец, Теодор Сведберг показал, что белки являются макромолекулами четко определенного состава (а не коллоидными смесями) с помощью аналитического ультрацентрифугирования . Возможность того, что некоторые белки являются нековалентными ассоциациями таких макромолекул показали Gilbert Смитсона Adair (путем измерения осмотического давления из гемоглобина ), а затем, с помощью Фредерика М. Ричардс в своих исследованиях рибонуклеазы С. масс - спектрометрии белков обладают долгое время был полезным методом для выявления посттрансляционных модификаций и, в последнее время, для исследования структуры белка.

Большинство белков трудно очистить в количествах, превышающих миллиграммы, даже с использованием самых современных методов. Следовательно, ранние исследования были сосредоточены на белках, которые можно было очищать в больших количествах, например, белков крови , яичного белка , различных токсинов и пищеварительных / метаболических ферментов, полученных на бойнях . Многие методы очистки белков были разработаны во время Второй мировой войны в рамках проекта под руководством Эдвина Джозефа Кона по очистке белков крови, чтобы помочь солдатам выжить. В конце 1950-х годов компания Armor Hot Dog Co. очистила 1 кг (= один миллион миллиграммов) чистой бычьей панкреатической рибонуклеазы А и сделала ее доступной по низкой цене для ученых всего мира. Этот щедрый поступок сделал РНКазу А основным белком для фундаментальных исследований на следующие несколько десятилетий, что привело к нескольким Нобелевским премиям.

Сворачивание белка и первые структурные модели

Изучение сворачивания белка началось в 1910 году со знаменитой статьи Харриет Чик и К. Дж. Мартина , в которой они показали, что флокуляция белка состоит из двух различных процессов: осаждению белка из раствора предшествовал другой процесс, называемый денатурацией. , в котором белок стал намного менее растворимым, потерял свою ферментативную активность и стал более химически реактивным. В середине 1920-х годов Тим Энсон и Альфред Мирски предположили, что денатурация - это обратимый процесс. Это правильная гипотеза, которую некоторые ученые первоначально высмеивали как «вскипание яйца». Ансон также предположил, что денатурация представляет собой процесс с двумя состояниями («все или ничего»), в котором один фундаментальный молекулярный переход приводит к резким изменениям растворимости, ферментативной активности и химической реактивности; он далее отметил, что изменения свободной энергии при денатурации были намного меньше, чем те, которые обычно участвуют в химических реакциях. В 1929 году Сянь Ву предположил, что денатурация - это разворачивание белка, чисто конформационное изменение, которое привело к воздействию растворителя на боковые цепи аминокислот. Согласно этой (правильной) гипотезе, воздействие растворителя на алифатические и реактивные боковые цепи делает белок менее растворимым и более реактивным, тогда как потеря определенной конформации вызывает потерю ферментативной активности. Гипотеза Ву, хотя и считалась правдоподобной, не была сразу принята, поскольку о структуре и энзимологии белка было известно очень мало, а другие факторы могли объяснить изменения растворимости, ферментативной активности и химической реактивности. В начале 1960-х Крис Анфинсен показал, что сворачивание рибонуклеазы А было полностью обратимым без необходимости в внешних кофакторах, подтвердив «термодинамическую гипотезу» сворачивания белка, согласно которой свернутое состояние представляет собой глобальный минимум свободной энергии для белка.

За гипотезой о сворачивании белка последовали исследования физических взаимодействий, которые стабилизируют свернутые белковые структуры. Решающая роль гидрофобных взаимодействий была выдвинута гипотезой Дороти Ринч и Ирвинга Ленгмюра как механизм, который мог бы стабилизировать ее циклольные структуры. Хотя эта (правильная) гипотеза была поддержана Дж. Д. Берналом и другими, она была отвергнута вместе с гипотезой циклона, которая была опровергнута в 1930-х годах Линусом Полингом (среди прочих). Вместо этого Полинг отстаивал идею о том, что структура белка стабилизируется в основном водородными связями , идея, первоначально выдвинутая Уильямом Эстбери (1933). Примечательно, что неверная теория Полинга о водородных связях привела к его правильным моделям для элементов вторичной структуры белков, альфа-спирали и бета-листа . Гидрофобное взаимодействие было восстановлено до его правильного значения в известной статье 1959 года Вальтера Каузманна о денатурации , частично основанной на работе Кая Линдерстрём-Ланга . Ионную природу белков продемонстрировали Бьеррам, Вебер и Арне Тизелиус , но Линдерстром-Ланг показал, что заряды обычно доступны для растворителя и не связаны друг с другом (1949).

Вторичной и низкой разрешающей способностью третичной структуры глобулярных белков была исследована изначально гидродинамическими методами, такими как аналитического ультрацентрифугирования и двойного лучепреломления в потоке . Спектроскопические методы исследования структуры белка (например, кругового дихроизма , флуоресценции, поглощения в ближнем ультрафиолете и инфракрасном диапазоне) были разработаны в 1950-х годах. Первые структуры белков с атомным разрешением были определены с помощью рентгеновской кристаллографии в 1960-х и ЯМР в 1980-х. По состоянию на 2019 год в базе данных о белках содержится более 150000 структур белков с атомарным разрешением. В последнее время криоэлектронная микроскопия больших макромолекулярных ансамблей достигла атомного разрешения, а расчетное предсказание структуры белков малых белковых доменов приближается к атомному разрешению.

Смотрите также

• История биологии
• История биотехнологии
• История генетики

использованная литература

• Фрай, Майкл. Знаковые эксперименты в молекулярной биологии . Амстердам: Elsevier / Academic Press. 2016. ISBN: 978-0-802074-6.