Очистка белков - Protein purification
Очистка белков - это серия процессов, предназначенных для выделения одного или нескольких белков из сложной смеси, обычно клеток , тканей или целых организмов. Очистка белка жизненно важна для определения функции, структуры и взаимодействия интересующего белка. В процессе очистки можно отделить белковые и небелковые части смеси и, наконец, отделить желаемый белок от всех других белков. Отделение одного белка от всех остальных обычно является наиболее трудоемким аспектом очистки белка. На этапах разделения обычно используются различия в размере белков, физико-химических свойствах, аффинности связывания и биологической активности . Чистый результат можно назвать белковым изолятом .
Цель
Очистка белков бывает препаративной или аналитической . Препаративная очистка направлена на получение относительно большого количества очищенных белков для последующего использования. Примеры включают приготовление коммерческих продуктов, таких как ферменты (например, лактаза ), пищевые белки (например, изолят соевого белка ) и некоторые биофармацевтические препараты (например, инсулин ). Для удаления побочных продуктов, таких как белки клетки-хозяина , часто используются несколько этапов препаративной очистки , которые представляют собой потенциальную угрозу для здоровья пациента. Аналитическая очистка дает относительно небольшое количество белка для различных исследовательских или аналитических целей, включая идентификацию, количественную оценку и изучение структуры белка , посттрансляционных модификаций и функций. Пепсин и уреаза были первыми белками, очищенными до такой степени, что они могли кристаллизоваться.
Предварительные шаги
Добыча
Если интересующий белок не секретируется организмом в окружающий раствор, первым шагом каждого процесса очистки является разрушение клеток, содержащих белок. В зависимости от того, насколько хрупким является белок и насколько стабильны клетки, можно, например, использовать один из следующих методов: i) многократное замораживание и оттаивание, ii) обработка ультразвуком , iii) гомогенизация под высоким давлением ( французская пресса ), iv ) гомогенизация путем измельчения (бисерная мельница) и v) проницаемость детергентами (например, Triton X-100 ) и / или ферментами (например, лизоцимом ). Наконец, остатки клеток можно удалить центрифугированием, чтобы белки и другие растворимые соединения оставались в надосадочной жидкости.
Также во время лизиса клеток высвобождаются протеазы , которые начинают переваривать белки в растворе. Если интересующий белок чувствителен к протеолизу , рекомендуется действовать быстро и держать экстракт охлажденным, чтобы замедлить переваривание. Альтернативно, один или несколько ингибиторов протеаз могут быть добавлены в буфер для лизиса непосредственно перед разрушением клеток. Иногда также необходимо добавить ДНКазу , чтобы снизить вязкость клеточного лизата, вызванную высоким содержанием ДНК .
Осаждение и дифференциальная солюбилизация
При очистке белка насыпной, общий первый шаг , чтобы изолировать белков является осаждение с сульфатом аммония (NH 4 ) 2 SO 4 . Это выполняется путем добавления увеличивающегося количества сульфата аммония и сбора различных фракций осажденного белка. Впоследствии сульфат аммония можно удалить с помощью диализа . Во время стадии осаждения сульфатом аммония гидрофобные группы, присутствующие в белках, подвергаются воздействию атмосферы, привлекая другие гидрофобные группы; в результате образуется совокупность гидрофобных компонентов. В этом случае осадок белка обычно виден невооруженным глазом . Одним из преимуществ этого метода является то, что его можно выполнять недорого даже при очень больших объемах.
Первыми очищаемыми белками являются водорастворимые белки. Очистка интегральных мембранных белков требует разрушения клеточной мембраны , чтобы изолировать любой конкретный белок от других, находящихся в том же мембранном отсеке. Иногда сначала может быть выделена определенная мембранная фракция, например, выделение митохондрий из клеток перед очисткой белка, расположенного в митохондриальной мембране. Моющее средство , такие как додецилсульфат натрия (SDS) , может быть использовано для растворения клеточных мембран и сохранить мембранные белки в растворе в процессе очистки; однако, поскольку SDS вызывает денатурацию , можно использовать более мягкие детергенты, такие как Triton X-100 или CHAPS , для сохранения нативной конформации белка во время полной очистки.
Ультрацентрифугирование
Центрифугирование - это процесс, в котором центробежная сила используетсядля разделения смесей частиц различной массы или плотности, взвешенных в жидкости. Когда сосуд (обычно пробирка или бутылка), содержащий смесь белков или других твердых частиц, таких как бактериальные клетки, вращается с высокой скоростью, инерция каждой частицы создает силу в направлении скорости частиц, которая пропорциональна его масса. Тенденция данной частицы перемещаться через жидкость из-за этой силы компенсируется сопротивлением, которое жидкость оказывает частице. Общий эффект «вращения» образца в центрифуге заключается в том, что массивные, маленькие и плотные частицы движутся наружу быстрее, чем менее массивные частицы или частицы с большим «сопротивлением» в жидкости. Когда суспензии частиц «вращаются» в центрифуге, на дне сосуда может образовываться «осадок», который обогащается наиболее массивными частицами с низким сопротивлением жидкости.
Неуплотненные частицы остаются в основном в жидкости, называемой «супернатант», и их можно удалить из сосуда, тем самым отделив супернатант от осадка. Скорость центрифугирования определяется угловым ускорением, приложенным к образцу, обычно измеряемым по сравнению с g . Если образцы центрифугируются достаточно долго, частицы в сосуде достигают равновесия, при котором частицы накапливаются именно в той точке сосуда, где их плавучая плотность уравновешивается центробежной силой. Такое «равновесное» центрифугирование может обеспечить обширную очистку данной частицы.
Центрифугирование в градиенте сахарозы - в пробирке создается линейный градиент концентрации сахара (обычно сахароза, глицерин или среда с градиентом плотности на основе диоксида кремния, такая как Percoll ), так что самая высокая концентрация находится внизу, а самая низкая - вверху. Percoll - торговая марка, принадлежащая компаниям GE Healthcare. Затем образец белка наслаивают поверх градиента и вращают на высоких скоростях в ультрацентрифуге . Это заставляет тяжелые макромолекулы перемещаться к дну пробирки быстрее, чем более легкий материал. Во время центрифугирования в отсутствие сахарозы, поскольку частицы перемещаются все дальше и дальше от центра вращения, они испытывают все большую и большую центробежную силу (чем дальше они движутся, тем быстрее они движутся). Проблема заключается в том, что полезный диапазон разделения внутри емкости ограничен небольшим окном наблюдения. Вращение образца в два раза дольше не означает, что интересующая частица уйдет вдвое дальше, на самом деле, она пойдет значительно дальше. Однако, когда белки движутся через градиент сахарозы, они сталкиваются с жидкостью с увеличивающейся плотностью и вязкостью. Правильно спроектированный градиент сахарозы будет противодействовать возрастающей центробежной силе, поэтому частицы перемещаются пропорционально времени, в течение которого они находились в центробежном поле. Образцы, разделенные этими градиентами, называются центрифугированием с "зональной скоростью". После разделения белка / частиц градиент фракционируют и собирают.
Стратегии очистки
Выбор исходного материала является ключом к разработке процесса очистки. У растений или животных определенный белок обычно неравномерно распределяется по телу; разные органы или ткани имеют более высокие или более низкие концентрации белка. Использование только тканей или органов с наибольшей концентрацией уменьшает объемы, необходимые для производства определенного количества очищенного белка. Если белок присутствует в небольшом количестве или имеет высокую ценность, ученые могут использовать технологию рекомбинантной ДНК для разработки клеток, которые будут производить большие количества желаемого белка (это известно как система экспрессии ). Рекомбинантная экспрессия позволяет пометить белок, например, His-меткой или Strep-меткой, чтобы облегчить очистку, уменьшая количество требуемых стадий очистки.
Аналитическая очистка обычно использует три свойства для разделения белков. Во-первых, белки можно очистить в соответствии с их изоэлектрическими точками, пропустив их через гель с регулируемым pH или ионообменную колонку. Во-вторых, белки можно разделить в соответствии с их размером или молекулярной массой с помощью эксклюзионной хроматографии или анализа SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Белки часто очищают с помощью 2D-PAGE, а затем анализируют с помощью фингерпринта пептидной массы для установления идентичности белка. Это очень полезно для научных целей, а пределы обнаружения белка в настоящее время очень низкие, и количество белка в нанограммах является достаточным для их анализа. В-третьих, белки можно разделить по полярности / гидрофобности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или обращенно-фазовой хроматографии .
Обычно протокол очистки белка содержит одну или несколько хроматографических стадий. Основная процедура хроматографии заключается в пропускании раствора, содержащего белок, через колонку, заполненную различными материалами. Различные белки по-разному взаимодействуют с материалом колонки и, таким образом, могут быть разделены по времени, необходимому для прохождения через колонку, или по условиям, необходимым для элюирования белка из колонки. Обычно белки обнаруживаются по мере их выхода из колонки по их поглощению при 280 нм. Существует множество различных хроматографических методов:
Эксклюзионная хроматография
Хроматографию можно использовать для разделения белка в растворе или в денатурирующих условиях с помощью пористых гелей. Этот метод известен как эксклюзионная хроматография . Принцип состоит в том, что молекулы меньшего размера должны проходить через больший объем пористой матрицы. Следовательно, для белков определенного диапазона размеров потребуется переменный объем элюента (растворителя), прежде чем они будут собраны на другом конце колонки с гелем.
В контексте очистки белка элюент обычно объединяют в разные пробирки. Все пробирки, не содержащие поддающихся измерению следов белка, подлежащего очистке, выбрасывают. Таким образом, оставшийся раствор состоит из очищаемого белка и любых других белков аналогичного размера.
Разделение на основе заряда или гидрофобности
Хроматография гидрофобного взаимодействия
Среда HIC является амфифильной с гидрофобными и гидрофильными областями, что позволяет разделять белки на основе их поверхностной гидрофобности. Целевые белки и их агрегированные виды продуктов, как правило, обладают разными гидрофобными свойствами, и их удаление с помощью HIC дополнительно очищает интересующий белок. Кроме того, в используемой среде обычно используются менее жесткие денатурирующие условия, чем при других методах хроматографии, что помогает сохранить интересующий белок в его естественном и функциональном состоянии. В чистой воде взаимодействия между смолой и гидрофобными участками белка были бы очень слабыми, но это взаимодействие усиливается нанесением образца белка на смолу HIC в буфере с высокой ионной силой. Затем ионная сила буфера снижается для элюирования белков в порядке уменьшения гидрофобности.
Ионообменная хроматография
Ионообменная хроматография разделяет соединения по природе и степени их ионного заряда. Используемая колонка выбирается в зависимости от ее типа и силы заряда. Анионообменные смолы имеют положительный заряд и используются для удержания и разделения отрицательно заряженных соединений (анионов), в то время как катионообменные смолы имеют отрицательный заряд и используются для разделения положительно заряженных молекул (катионов).
Перед началом разделения через колонку прокачивают буфер, чтобы уравновесить противоположно заряженные ионы. После введения образца молекулы растворенного вещества будут обмениваться с ионами буфера, поскольку каждая из них будет бороться за участки связывания на смоле. Продолжительность удержания каждого растворенного вещества зависит от силы его заряда. Сначала элюируются наиболее слабо заряженные соединения, а затем соединения с более сильным зарядом. Из-за характера механизма разделения pH, тип буфера, концентрация буфера и температура - все они играют важную роль в управлении разделением.
Ионообменная хроматография - очень мощный инструмент для очистки белков, который часто используется как для аналитического, так и для препаративного разделения.
Электрофорез в свободном потоке
Электрофорез в свободном потоке (FFE) - это метод электрофореза без носителей, который позволяет препаративное разделение белков в ламинарном буферном потоке с использованием ортогонального электрического поля. Используя градиент pH, который, например, может быть вызван амфолитами , этот метод позволяет разделять изоформы белка с разрешением <0,02 дельта-pI.
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография - это метод разделения, основанный на молекулярной конформации, при котором часто используются смолы, специфичные для конкретного применения. Эти смолы имеют лиганды, прикрепленные к их поверхностям, которые специфичны для разделяемых соединений. Чаще всего эти лиганды действуют аналогично взаимодействиям антитело-антиген. Этот "замок и ключ" между лигандом и его целевым соединением делает его очень специфичным, часто генерируя единственный пик, в то время как все остальное в образце не сохраняется.
Многие мембранные белки являются гликопротеинами и могут быть очищены с помощью лектиновой аффинной хроматографии. Солюбилизированным детергентом белкам можно дать возможность связываться с хроматографической смолой, которая была модифицирована, чтобы иметь ковалентно присоединенный лектин. Белки, которые не связываются с лектином, вымываются, а затем специфически связанные гликопротеины могут быть элюированы путем добавления сахара в высокой концентрации, который конкурирует со связанными гликопротеинами в сайте связывания лектина. Некоторые лектины обладают высокой аффинностью связывания с олигосахаридами гликопротеинов, которые трудно конкурировать с сахарами, и связанные гликопротеины необходимо высвобождать путем денатурирования лектина.
Иммуноаффинная хроматография
Иммуноаффинная хроматография использует специфическое связывание антитела с антигеном для селективной очистки целевого белка. Процедура включает в себя иммобилизацию белка на твердом субстрате (например, пористом шарике или мембране), который затем избирательно связывает цель, в то время как все остальное протекает через него. Целевой белок можно элюировать путем изменения pH или солености . Иммобилизованный лиганд может представлять собой антитело (например, иммуноглобулин G ) или белок (например, белок A ). Поскольку этот метод не требует разработки тегов, его можно использовать для белков из природных источников.
Очистка меченого белка
Другой способ пометить белки - создать антигенную пептидную метку на белке, а затем очистить белок на колонке или инкубировать с рыхлой смолой, покрытой иммобилизованным антителом . Эта конкретная процедура известна как иммунопреципитация . Иммунопреципитация вполне способна вызвать чрезвычайно специфическое взаимодействие, которое обычно приводит к связыванию только желаемого белка. Очищенные меченые белки затем можно легко отделить от других белков в растворе, а затем элюировать обратно в чистый раствор.
Когда теги больше не нужны, их можно отщепить протеазой. Это часто включает конструирование сайта расщепления протеазой между меткой и белком.
ВЭЖХ
Высокоэффективная жидкостная хроматография или жидкостная хроматография высокого давления - это форма хроматографии, в которой применяется высокое давление для более быстрого прохождения растворенных веществ через колонку. Это означает, что диффузия ограничена, а разрешение улучшено. Наиболее распространенной формой является ВЭЖХ с «обращенной фазой», где материал колонки является гидрофобным . Белки элюируются градиентом возрастающих количеств органического растворителя , такого как ацетонитрил. Белки элюируются в соответствии с их гидрофобностью. После очистки с помощью ВЭЖХ белок находится в растворе, который содержит только летучие соединения, и его можно легко лиофилизировать. Очистка с помощью ВЭЖХ часто приводит к денатурации очищенных белков и, таким образом, неприменима к белкам, которые не подвергаются спонтанной повторной укладке.
Концентрация очищенного протеина
В конце очистки белка часто приходится концентрировать белок. Существуют разные методы.
Лиофилизация
Если раствор не содержит каких-либо других растворимых компонентов, кроме рассматриваемого белка, белок можно лиофилизировать (высушить). Обычно это делается после анализа ВЭЖХ. Это просто удаляет все летучие компоненты, оставляя белки позади.
Ультрафильтрация
Ультрафильтрация концентрирует белковый раствор с использованием селективных проницаемых мембран. Функция мембраны - пропускать воду и небольшие молекулы, сохраняя при этом белок. Раствор прижимается к мембране с помощью механического насоса, давления газа или центрифугирования.
Оценка выхода очистки
Самый общий метод контроля процесса очистки - это выполнение различных этапов SDS-PAGE . Этот метод дает лишь приблизительную оценку количества различных белков в смеси и не позволяет различить белки с похожей кажущейся молекулярной массой .
Если белок имеет отличительную спектроскопическую характеристику или ферментативную активность , это свойство можно использовать для обнаружения и количественной оценки конкретного белка и, таким образом, для выбора фракций разделения, которые содержат белок. Если антитела против белка доступны, то вестерн-блоттинг и ELISA могут специфически обнаружить и количественно определить количество желаемого белка. Некоторые белки действуют как рецепторы и могут быть обнаружены на этапах очистки с помощью анализа связывания лиганда , часто с использованием радиоактивного лиганда .
Чтобы оценить процесс многоступенчатой очистки, количество конкретного белка необходимо сравнить с количеством общего белка. Последний может быть определен с помощью анализа общего белка Брэдфорда или по поглощению света при 280 нм , однако некоторые реагенты, используемые в процессе очистки, могут мешать количественному определению. Например, имидазол (обычно используемый для очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином) является аналогом аминокислоты и в низких концентрациях будет мешать анализу бицинхониновой кислоты (BCA) для количественного определения общего белка. Примеси в имидазоле низкого качества также будут поглощать на длине волны 280 нм, что приведет к неточному измерению концентрации белка по УФ-поглощению.
Другой метод, который следует рассмотреть, - это поверхностный плазмонный резонанс (SPR). SPR может обнаруживать связывание свободных от меток молекул на поверхности чипа. Если желаемый белок представляет собой антитело, связывание может быть напрямую переведено на активность белка. Активную концентрацию белка можно выразить как процент от общего белка. SPR может быть мощным методом для быстрого определения активности белка и общего выхода. Это мощная технология, для работы которой необходим инструмент.
Аналитический
Электрофорез в денатурирующих условиях
Гель-электрофорез - это распространенный лабораторный метод, который можно использовать как препаративный, так и аналитический метод. Принцип электрофореза основан на движении заряженного иона в электрическом поле. На практике белки денатурируют в растворе, содержащем детергент ( SDS ). В этих условиях белки разворачиваются и покрываются отрицательно заряженными молекулами детергента. Белки в SDS-PAGE разделяются только на основании их размера.
В аналитических методах белок перемещается в виде полос в зависимости от размера. Каждую полосу можно обнаружить с помощью пятен, таких как синий краситель Кумасси или серебряное пятно . Препаративные методы очистки большого количества белка требуют экстракции белка из электрофоретического геля. Эта экстракция может включать удаление геля, содержащего полосу, или элюирование полосы непосредственно с геля, когда она стекает с конца геля.
В контексте стратегии очистки электрофорез в денатурирующих условиях обеспечивает улучшенное разрешение по сравнению с эксклюзионной хроматографией, но не масштабируется до большого количества белков в образце, а также на колонках для поздней хроматографии .
Электрофорез в неденатурирующих условиях
Неденатурирующей электрофоретической процедурой выделения биоактивных металлопротеинов в сложных белковых смесях является препаративный нативный PAGE. Целостность или структурная целостность изолированного белка должна быть подтверждена независимым методом.