Электронный микроскоп - Electron microscope

Современный просвечивающий электронный микроскоп
Схема просвечивающего электронного микроскопа
Электронный микроскоп, сконструированный Эрнстом Руска в 1933 году.

Электронный микроскоп является микроскопом , который использует пучок ускоренных электронов в качестве источника освещения. Поскольку длина волны электрона может быть до 100 000 раз короче, чем длина волны фотонов видимого света , электронные микроскопы имеют более высокую разрешающую способность, чем световые микроскопы, и могут обнаруживать структуру более мелких объектов. Передачи сканирующего электронного микроскопа достиг лучше , чем 50  мкм разрешение в кольцевом формирования изображения в темном поле режиме и увеличениях до около 10000000 × тогда как большинство световых микроскопов ограниченыдифракция с разрешением около 200  нм и полезное увеличение менее 2000 ×.

Электронные микроскопы используют магнитные поля определенной формы для формирования систем электронных оптических линз , которые аналогичны стеклянным линзам оптического светового микроскопа.

Электронные микроскопы используются для исследования ультраструктуры широкого спектра биологических и неорганических образцов, включая микроорганизмы , клетки , большие молекулы , образцы биопсии , металлы и кристаллы . В промышленности электронные микроскопы часто используются для контроля качества и анализа отказов . Современные электронные микроскопы создают электронные микрофотографии с помощью специализированных цифровых камер и захватов кадров для захвата изображений.

История

Диаграмма, иллюстрирующая явления, возникающие в результате взаимодействия высокоэнергетических электронов с веществом

В 1926 году Ханс Буш разработал электромагнитную линзу.

По словам Денниса Габора , в 1928 году физик Лео Сцилард пытался убедить его построить электронный микроскоп, на который он подал патент. Первый прототип электронного микроскопа с четырехсоткратным увеличением был разработан в 1931 году физиком Эрнстом Руска и инженером-электриком Максом Кноллем в Берлинском техническом университете или Берлинском техническом университете. Аппарат был первой практической демонстрацией принципов электронной микроскопии. В мае того же года Райнхольд Руденберг , научный руководитель Siemens-Schuckertwerke , получил патент на электронный микроскоп. В 1932 году Эрнст Любке из Siemens & Halske построил и получил изображения с прототипа электронного микроскопа, применяя концепции, описанные в патенте Руденберга.

В следующем, 1933 году, Руска построил первый электронный микроскоп, разрешение которого превышало разрешающую способность оптического (светового) микроскопа. Четыре года спустя, в 1937 году, Сименс профинансировал работу Эрнста Руска и Бодо фон Борриса и нанял Гельмута Руска , брата Эрнста, для разработки приложений для микроскопа, особенно с биологическими образцами. Также в 1937 году Манфред фон Арденн первым изобрел сканирующий электронный микроскоп . Siemens выпустила первый коммерческий электронный микроскоп в 1938 г. Первые североамериканские электронные микроскопы были построены в 1930 году в Университете штата Вашингтон Андерсоном и Фитсиммонсу и Университета Торонто , по Eli Франклин Burton и студентов Cecil Холл, Джеймс Хиллер , и Альберт Пребус. Компания Siemens выпустила просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ) в 1939 году. Хотя современные просвечивающие электронные микроскопы способны увеличивать в два миллиона раз, как научные инструменты, они по-прежнему основаны на прототипе Руска .

Типы

Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)

Принцип работы просвечивающего электронного микроскопа

Первоначальная форма электронного микроскопа, просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ), использует высоковольтный электронный луч для освещения образца и создания изображения. Электронный пучок создается электронной пушкой , обычно оснащенной катодом из вольфрамовой нити в качестве источника электронов. Электронный пучок ускоряется с помощью анода обычно при +100 K эВ ( от 40 до 400 к) по отношению к катоду, фокусировался электростатическими и электромагнитными линзами, и передается через образец , который является частично прозрачным для электронов , так и в части разбросах них из луча. Когда он выходит из образца, электронный луч несет информацию о структуре образца, которая увеличивается с помощью системы линз объектива микроскопа. Пространственное изменение этой информации («изображение») можно увидеть, проецируя увеличенное электронное изображение на флуоресцентный смотровой экран, покрытый люминофором или сцинтилляторным материалом, таким как сульфид цинка . В качестве альтернативы изображение может быть записано фотографическим способом, экспонируя фотопленку или пластину непосредственно под электронным лучом, или люминофор высокого разрешения может быть подключен с помощью оптической системы объектива или волоконно-оптического световода к датчику цифрового камера . Изображение, обнаруженное цифровой камерой, может отображаться на мониторе или компьютере.

Разрешение ПЭМ ограничено в первую очередь сферической аберрацией , но новое поколение аппаратных корректоров может уменьшить сферическую аберрацию, чтобы увеличить разрешение просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) до менее 0,5 ангстрема (50 пикометров ), что обеспечивает увеличение более 50 миллионов. раз. Способность HRTEM определять положения атомов в материалах полезна для исследований и разработок в области нанотехнологий.

Просвечивающие электронные микроскопы часто используются в режиме дифракции электронов . Преимущества электронной дифракции перед рентгеновской кристаллографией заключаются в том, что образец не обязательно должен быть монокристаллом или даже поликристаллическим порошком, а также то, что реконструкция увеличенной структуры объекта с преобразованием Фурье происходит физически и, таким образом, устраняет необходимость в решении фазовой проблемы. перед рентгеновскими кристаллографами после получения их дифрактограмм.

Одним из основных недостатков просвечивающего электронного микроскопа является необходимость получения очень тонких срезов образцов, обычно около 100 нанометров. Создание этих тонких срезов для биологических образцов и образцов материалов технически очень сложно. Тонкие срезы полупроводников можно изготавливать с помощью сфокусированного ионного пучка . Образцы биологических тканей химически фиксируются, обезвоживаются и заделываются в полимерную смолу, чтобы стабилизировать их в достаточной степени, чтобы можно было делать ультратонкие срезы. Срезы биологических образцов, органических полимеров и подобных материалов могут потребовать окрашивания метками тяжелых атомов для достижения требуемого контраста изображения.

Электронный микроскоп с последовательным сечением (ssEM)

Одним из применений ПЭМ является электронная микроскопия последовательных срезов (ssEM), например, для анализа связности в объемных образцах ткани головного мозга путем последовательной визуализации множества тонких срезов. Это может быть достигнуто путем введения метода фрезерования в конвейер формирования изображений, с помощью которого последовательные срезы трехмерного объема подвергаются воздействию луча и отображаются. Эти методы включают СЭМ с последовательным блоком граней (SB-SEM) и СЭМ с фокусированными ионами ( FIB-SEM ). Предварительная обработка объемов для создания множества срезов, которые отображаются в автоматическом режиме, недавно позволила достичь высокой пропускной способности изображения объемов до 1 мм 3 . Используя этот метод, можно разрешить целые локальные нейронные микросхемы, хотя требования к оборудованию и времени для этого все еще значительны: для получения изображения блока ткани мозга размером 1 мм 3 потребовалось 6 месяцев почти непрерывной визуализации с помощью шести параллельно работающих ПЭМ.

Сканирующий просвечивающий электронный микроскоп (STEM)

STEM растрирует сфокусированный падающий зонд через образец, который (как и в случае с TEM) был утончен, чтобы облегчить обнаружение электронов, рассеянных через образец. Таким образом, в STEM возможно высокое разрешение ПЭМ. Действие фокусировки (и аберрации) происходит до того, как электроны попадают в образец в STEM, но после этого в TEM. Использование в STEM растрирования луча, подобного SEM, упрощает формирование кольцевых изображений в темном поле и другие аналитические методы, но также означает, что данные изображения собираются последовательно, а не параллельно. Часто ПЭМ может быть оснащен опцией сканирования, и тогда он может работать как ПЭМ, так и STEM.

Растровый электронный микроскоп (СЭМ)

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа
Изображение Bacillus subtilis, полученное с помощью электронного микроскопа 1960-х годов.

СЭМ создает изображения путем зондирования образца сфокусированным электронным лучом, который сканируется по прямоугольной области образца ( растровое сканирование ). Когда электронный луч взаимодействует с образцом, он теряет энергию за счет множества механизмов. Потерянная энергия преобразуется в альтернативные формы, такие как тепло, излучение вторичных электронов с низкой энергией и электроны, рассеянные обратно с высокой энергией, излучение света ( катодолюминесценция ) или рентгеновское излучение, все из которых предоставляют сигналы, несущие информацию о свойствах образца. поверхность, например ее топография и состав. Изображение, отображаемое с помощью SEM, отображает изменяющуюся интенсивность любого из этих сигналов в изображение в положении, соответствующем положению луча на образце, когда сигнал был сгенерирован. На СЭМ-изображении муравья, показанном ниже и справа, изображение было построено из сигналов, произведенных детектором вторичных электронов, нормальным или обычным режимом визуализации в большинстве СЭМ.

Как правило, разрешение изображения SEM ниже, чем у TEM. Однако, поскольку СЭМ отображает поверхность образца, а не его внутреннюю часть, электроны не должны проходить через образец. Это снижает потребность в обширной подготовке образца для его утонения до электронной прозрачности. СЭМ может отображать объемные образцы, которые могут поместиться на его предметном столике и по-прежнему маневрировать, включая высоту, меньшую, чем используемое рабочее расстояние, часто 4 миллиметра для изображений с высоким разрешением. SEM также имеет большую глубину резкости и поэтому может создавать изображения, которые хорошо отражают трехмерную форму поверхности образца. Еще одним преимуществом SEM являются сканирующие электронные микроскопы для окружающей среды (ESEM), которые могут создавать изображения хорошего качества и разрешения с гидратированными образцами или в низком, а не высоком вакууме или в газах под камерой. Это облегчает визуализацию незакрепленных биологических образцов, которые нестабильны в высоком вакууме обычных электронных микроскопов.

Изображение муравья в растровом электронном микроскопе

Отражательный электронный микроскоп (РЭМ)

В отражательном электронном микроскопе (REM), как и в TEM, электронный луч падает на поверхность, но вместо использования пропускания (TEM) или вторичных электронов (SEM) обнаруживается отраженный луч упруго рассеянных электронов . Этот метод обычно сочетается с дифракцией электронов высоких энергий на отражение (RHEED) и спектроскопией потерь высоких энергий на отражение (RHELS) . Другой вариант - спин-поляризованная электронная микроскопия низких энергий ( SPLEEM ), которая используется для изучения микроструктуры магнитных доменов .

Сканирующая туннельная микроскопия (СТМ)

В СТМ проводящий наконечник, удерживаемый под напряжением, приближается к поверхности, и профиль может быть получен на основе вероятности туннелирования электрона от наконечника к образцу, поскольку это функция расстояния.

Цвет

В наиболее распространенных конфигурациях электронные микроскопы создают изображения с одним значением яркости на пиксель, при этом результаты обычно отображаются в оттенках серого . Однако часто эти изображения затем окрашиваются с помощью программного обеспечения для обнаружения признаков или просто путем ручного редактирования с использованием графического редактора. Это может быть сделано для уточнения структуры или для эстетического эффекта и, как правило, не добавляет новой информации об образце.

В некоторых конфигурациях информация о нескольких свойствах образца собирается на пиксель, обычно с помощью нескольких детекторов. В SEM атрибуты топографии и контраста материала могут быть получены с помощью пары детекторов обратно рассеянных электронов, и такие атрибуты могут быть наложены на одноцветное изображение путем присвоения разного основного цвета каждому атрибуту. Точно так же комбинацию сигналов обратно рассеянных и вторичных электронов можно присвоить разным цветам и наложить на одноцветную микрофотографию, одновременно отображающую свойства образца.

Некоторые типы детекторов, используемые в SEM, обладают аналитическими возможностями и могут предоставлять несколько элементов данных для каждого пикселя. Примерами являются детекторы энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS), используемые в элементном анализе, и системы катодолюминесцентного микроскопа (CL), которые анализируют интенсивность и спектр электронно-индуцированной люминесценции (например) в геологических образцах. В системах SEM, использующих эти детекторы, принято кодировать сигналы цветом и накладывать их на одно цветное изображение, чтобы можно было четко увидеть и сравнить различия в распределении различных компонентов образца. При желании стандартное вторичное электронное изображение может быть объединено с одним или несколькими композиционными каналами, чтобы можно было сравнить структуру и состав образца. Такие изображения можно делать с сохранением полной целостности исходного сигнала, который никак не изменяется.

Базовые приготовления

Насекомое, покрытое золотом для просмотра в сканирующий электронный микроскоп.

Материалы, которые будут рассматриваться под электронным микроскопом, могут потребовать обработки для получения подходящего образца. Требуемый метод варьируется в зависимости от образца и требуемого анализа:

  • Химическая фиксация - для биологических образцов направлена ​​на стабилизацию подвижной макромолекулярной структуры образца путем химического сшивания белков с альдегидами, такими как формальдегид и глутаральдегид , и липидов с тетроксидом осмия .
  • Отрицательное окрашивание - суспензии, содержащие наночастицы или тонкий биологический материал (например, вирусы и бактерии), на короткое время смешивают с разбавленным раствором электронно-непрозрачного раствора, такого как молибдат аммония, уранилацетат (или формиат) или фосфорновольфрамовая кислота. Эту смесь наносят на ЭМ сетку с соответствующим покрытием, промокают и дают высохнуть. Для получения наилучших результатов просмотр этого препарата в ТЕА следует проводить незамедлительно. Этот метод важен в микробиологии для быстрой, но грубой морфологической идентификации, но также может использоваться в качестве основы для трехмерной реконструкции с высоким разрешением с использованием методологии ЭМ томографии, когда углеродные пленки используются в качестве основы. Отрицательное окрашивание также используется для наблюдения за наночастицами.
  • Криофиксация - замораживание образца в жидком этане настолько быстро,что вода образует стекловидный (некристаллический) лед . Это сохраняет образец на снимке состояния раствора. Целая область, называемая криоэлектронной микроскопией, стала ответвлением этой техники. С развитием криоэлектронной микроскопии срезов стекловидного тела (CEMOVIS) теперь можно наблюдать образцы практически любого биологического образца, близкого к его естественному состоянию.
  • Обезвоживание - или замена воды органическими растворителями, такими как этанол или ацетон , с последующей сушкой до критической точки или пропиткой смолами для заливки . Также сублимационная сушка .
  • Заливка, биологические образцы - после обезвоживания ткань для наблюдения в просвечивающем электронном микроскопе заделывается так, чтобы ее можно было разделить и подготовить для просмотра. Для этого ткань пропускают через «переходный растворитель», такой как оксид пропилена (эпоксипропан) или ацетон, а затем пропитывают эпоксидной смолой, такой как аралдит , эпон или дуркупан ; ткани также могут быть непосредственно залиты водорастворимой акриловой смолой . После полимеризации (затвердевания) смолы образец делится на тонкие (ультратонкие) срезы и окрашивается , после чего он готов для просмотра.
  • Заливка, материалы - после заливки смолой образец обычно шлифуется и полируется до зеркального блеска с использованием ультратонких абразивов. Процесс полировки должен выполняться осторожно, чтобы минимизировать царапины и другие артефакты полировки, снижающие качество изображения.
  • Затенение металла - металл (например, платина ) испаряется с верхнего электрода и наносится на поверхность биологического образца под углом. Топография поверхности приводит к вариациям толщины металла, которые видны как вариации яркости и контраста на изображении, полученном с помощью электронного микроскопа.
  • Репликация - поверхность, затененная металлом (например, платиной или смесью углерода и платины) под углом, покрывается чистым углеродом, испаренным с угольных электродов под прямым углом к ​​поверхности. За этим следует удаление материала образца (например, в кислотной ванне, с использованием ферментов или путем механического разделения) для создания копии поверхности, которая фиксирует ультраструктуру поверхности и может быть исследована с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
  • Секционирование - получение тонких срезов образца, полупрозрачных для электронов. Их можно разрезать на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом, чтобы получить ультратонкие срезы толщиной около 60–90 нм. Также используются одноразовые стеклянные ножи , потому что они могут быть изготовлены в лаборатории и намного дешевле.
  • Окрашивание - использует тяжелые металлы, такие как свинец , уран или вольфрам, для рассеивания электронов на изображении и, таким образом, создания контраста между различными структурами, поскольку многие (особенно биологические) материалы почти «прозрачны» для электронов (объекты со слабой фазой). В биологии образцы можно окрашивать «единым блоком» перед заделкой, а также позже после разделения на срезы. Обычно тонкие срезы окрашивают в течение нескольких минут водным или спиртовым раствором уранилацетата, а затем водным цитратом свинца.
  • Замораживание-перелом или замораживание-травление - метод подготовки, особенно полезный для исследования липидных мембран и включенных в них белков при взгляде «лицом к лицу».
    Замораживание-разрушение помогает отслаивать открытые мембраны, позволяя визуализировать то, что находится внутри
    На внешней стороне мембраны пекарских дрожжей видны небольшие отверстия, в которых белки выламываются, иногда в виде небольших кольцевых структур.
    Свежую ткань или клеточную суспензию быстро замораживают (криофиксирование), затем разрушают путем разрушения (или с помощью микротома) при поддержании температуры жидкого азота. Затем холодная изломанная поверхность (иногда «протравленная» повышением температуры примерно до -100 ° C на несколько минут, чтобы дать немного возглавиться льду) затем затеняется испаренной платиной или золотом под средним углом 45 ° в испарителе высокого вакуума. Второй слой углерода, напыляемый перпендикулярно средней плоскости поверхности, часто выполняется для повышения стабильности покрытия-реплики. Образец возвращается к комнатной температуре и давлению, затем чрезвычайно хрупкая «затененная» металлическая копия поверхности излома отделяется от лежащего под ним биологического материала путем тщательного химического разложения с помощью кислот, раствора гипохлорита или детергента SDS . Все еще плавающую копию тщательно промывают от остаточных химикатов, вылавливают на мелкой сетке, сушат, а затем просматривают в ПЭМ.
  • Маркировка реплики перелома методом замораживания-перелома (FRIL) - метод замораживания-перелома был модифицирован, чтобы позволить идентифицировать компоненты поверхности перелома с помощью маркировки иммунным золотом. Вместо удаления всей подлежащей ткани размороженной копии в качестве последнего шага перед просмотром в микроскоп, толщина ткани сводится к минимуму во время или после процесса перелома. Тонкий слой ткани остается связанным с металлическим аналогом, поэтому он может быть помечен иммунным золотом с помощью антител к выбранным структурам. Тонкий слой исходного образца на реплике с нанесенным золотом позволяет идентифицировать структуры в плоскости излома. Существуют также родственные методы, которые маркируют поверхность протравленных клеток, и другие варианты маркирования реплик.
  • Ионно-лучевое измельчение - утонение образцов до тех пор, пока они не станут прозрачными для электронов, за счет выстрела ионов (обычно аргона ) на поверхность под углом и распыления материала с поверхности. Подклассом этого является измельчение сфокусированным ионным пучком , при котором ионы галлия используются для создания электронно-прозрачной мембраны в определенной области образца, например, с помощью устройства внутри микропроцессора. Ионно-лучевая фрезеровка также может использоваться для полировки поперечного сечения перед анализом материалов, которые трудно приготовить с помощью механической полировки, перед анализом на сканирующем электронном микроскопе.
  • Электропроводящее покрытие - ультратонкое покрытие из электропроводящего материала, нанесенное методом напыления в высоком вакууме или напылением на образец в низком вакууме. Это сделано для предотвращения накопления статических электрических полей на образце из-за облучения электронами, необходимого во время визуализации. Материалы покрытия включают золото, золото / палладий, платину, вольфрам, графит и т. Д.
  • Заземление - чтобы избежать накопления электрического заряда на образце с токопроводящим покрытием, он обычно электрически подключается к металлическому держателю образца. Частодля этой цели используется электропроводящий клей .

Недостатки

Просвечивающий и растровый электронный микроскоп JEOL, изготовленный в середине 1970-х гг.

Электронные микроскопы дороги в изготовлении и обслуживании, но капитальные и эксплуатационные расходы систем конфокальных световых микроскопов в настоящее время совпадают с затратами на основные электронные микроскопы. Микроскопы, предназначенные для достижения высоких разрешений, должны размещаться в устойчивых зданиях (иногда под землей) со специальными услугами, такими как системы подавления магнитного поля.

Образцы в основном необходимо рассматривать в вакууме , поскольку молекулы, составляющие воздух, будут рассеивать электроны. Исключением является жидкофазная электронная микроскопия с использованием либо закрытой жидкостной ячейки, либо камеры окружающей среды, например, в сканирующем электронном микроскопе окружающей среды , который позволяет просматривать гидратированные образцы при низком давлении (до 20  Торр или 2,7 кПа). влажная среда. Также были разработаны различные методы in situ электронной микроскопии газовых образцов.

Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном режиме высокого вакуума, обычно получают изображения проводящих образцов; поэтому для непроводящих материалов требуется проводящее покрытие (сплав золото / палладий, углерод, осмий и т. д.). Низковольтный режим современных микроскопов позволяет наблюдать непроводящие образцы без покрытия. Непроводящие материалы можно также визуализировать с помощью растрового электронного микроскопа с переменным давлением (или окружающей среды).

Небольшие стабильные образцы, такие как углеродные нанотрубки , панцири диатомовых водорослей и мелкие минеральные кристаллы (например, волокна асбеста), не требуют специальной обработки перед исследованием в электронный микроскоп. Образцы гидратированных материалов, включая почти все биологические образцы, должны быть приготовлены различными способами, чтобы стабилизировать их, уменьшить их толщину (ультратонкие срезы) и повысить их электронно-оптический контраст (окрашивание). Эти процессы могут приводить к появлению артефактов , но их обычно можно идентифицировать, сравнивая результаты, полученные с использованием совершенно разных методов подготовки образцов. С 1980-х годов ученые все активнее используют анализ замороженных и застеклованных образцов, что еще раз подтверждает достоверность этого метода.

Приложения

Смотрите также

использованная литература

внешняя ссылка

Общий

История

Другой