Био-МЭМС - Bio-MEMS
Био-МЭМС - это аббревиатура от биомедицинских (или биологических) микроэлектромеханических систем . Био-МЭМС в значительной степени пересекаются и иногда считаются синонимами лабораторных систем на кристалле (LOC) и систем микрообщего анализа (μTAS) . Био-МЭМС, как правило, больше ориентированы на механические детали и технологии микропроизводства, подходящие для биологических применений. С другой стороны, « лаборатория на кристалле» связана с миниатюризацией и интеграцией лабораторных процессов и экспериментов в отдельные (часто микрожидкостные ) микросхемы. Согласно этому определению, устройства «лаборатория на кристалле» не имеют строго биологических применений, хотя большинство из них могут быть адаптированы для биологических целей или могут быть адаптированы. Точно так же системы анализа общего микромира могут не иметь в виду биологические приложения и обычно предназначены для химического анализа . Широкое определение био-МЭМС может использоваться для обозначения науки и техники работы на микромасштабе для биологических и биомедицинских приложений, которые могут включать или не включать какие-либо электронные или механические функции. Междисциплинарный характер био-МЭМС объединяет материаловедение , клинические науки , медицину , хирургию , электротехнику , машиностроение , оптическую инженерию , химическую инженерию и биомедицинскую инженерию . Некоторые из его основных приложений включают геномику , протеомику , молекулярную диагностику , диагностику в местах оказания медицинской помощи , тканевую инженерию , анализ отдельных клеток и имплантируемые микроустройства.
История
В 1967 году С.Б. Картер сообщил об использовании островков палладия, испаренных из тени, для прикрепления клеток . После этого первого исследования био-МЭМС дальнейшее развитие в этой области было медленным в течение примерно 20 лет. В 1985 году Unipath Inc. выпустила на рынок ClearBlue , тест на беременность, который до сих пор используется, и его можно считать первым микрофлюидным устройством, содержащим бумагу, и первым микрофлюидным продуктом на рынке. В 1990 году Андреас Манц и Х. Майкл Видмер из Ciba-Geigy (ныне Novartis ), Швейцария, впервые ввели термин « система общего микроанализа» (μTAS) в своей основополагающей статье, в которой предлагалось использовать миниатюрные системы полного химического анализа для химического зондирования. За концепцией μTAS стояли три основных мотивационных фактора. Во-первых, открытие лекарств в последние десятилетия, вплоть до 1990-х годов, было ограничено из-за времени и стоимости параллельного выполнения множества хроматографических анализов на макроскопическом оборудовании. Во-вторых, проект « Геном человека» (HGP) , начатый в октябре 1990 г., вызвал потребность в улучшении возможностей секвенирования ДНК . Таким образом, капиллярный электрофорез стал центром химического разделения и разделения ДНК. В- третьих, DARPA из Министерства обороны США поддержал ряд микрофлюидальных исследовательских программ в 1990 - е годы после реализации возникла необходимость в разработке полевых развертываемых микросистемы для обнаружения химических и биологических агентов , которые являются потенциальными военными и террористическими угрозами . Исследователи начали использовать фотолитографии оборудование для микротехнологий из microeletromechanical систем (MEMS) , как унаследованные от микроэлектронной промышленности. В то время применение МЭМС в биологии было ограничено, потому что эта технология была оптимизирована для кремниевых или стеклянных пластин и использовала фоторезисты на основе растворителей , несовместимые с биологическим материалом. В 1993 году Джордж М. Уайтсайдс , химик из Гарварда , представил недорогие микротехнологии на основе PDMS, и это произвело революцию в области био-МЭМС. С тех пор область био-МЭМС резко выросла. Избранные основные технические достижения в ходе разработки био-МЭМС в 1990-х годах включают:
- В 1991 году был разработан первый олигонуклеотидный чип.
- В 1998 году были разработаны первые твердые микроиглы для доставки лекарств.
- В 1998 году был разработан первый чип непрерывной полимеразной цепной реакции.
- В 1999 году первая демонстрация гетерогенных ламинарных потоков для избирательной обработки клеток в микроканалах.
Сегодня гидрогели, такие как агароза , биосовместимые фоторезисты и самосборка, являются ключевыми областями исследований в улучшении био-МЭМС в качестве замены или дополнения к PDMS .
Подходы
Материалы
Кремний и стекло
Обычные методы микрообработки , такие как влажное травление , сухое травление, глубокий реактивные ионное травление, напыление , анодная связь и сплавления были использованы в био-МЭМСЕ , чтобы каналы потока , датчики расхода , химические детекторы, капилляры разделения, смесители, фильтры , насосы и клапаны. Однако у использования кремниевых устройств в биомедицинских приложениях есть некоторые недостатки, такие как их высокая стоимость и биологическая несовместимость . Из-за того, что они предназначены только для одноразового использования, они больше, чем их аналоги МЭМС , а также из-за необходимости иметь чистые помещения , высокие затраты на материалы и обработку делают био-МЭМС на основе кремния менее привлекательными с экономической точки зрения. « In vivo » био-МЭМС на основе кремния можно легко функционализировать для минимизации адсорбции белка , но хрупкость кремния остается серьезной проблемой.
Пластмассы и полимеры
Использование пластмасс и полимеров в био-МЭМС привлекательно, поскольку их легко изготовить, они совместимы с методами микрообработки и быстрого прототипирования , а также имеют низкую стоимость. Многие полимеры также являются оптически прозрачными и могут быть интегрированы в системы, в которых используются методы оптического обнаружения, такие как флуоресценция , поглощение в УФ / видимом диапазоне или метод комбинационного рассеяния света . Более того, многие полимеры являются биологически совместимыми , химически инертными по отношению к растворителям и электрически изолирующими для применений, где необходимы сильные электрические поля , такие как электрофоретическое разделение . Поверхностная химия из полимеров также может быть модифицирована для конкретных применений. В частности, поверхность PDMS может быть облучена ионами с такими элементами, как магний , тантал и железо, для уменьшения гидрофобности поверхности , что позволяет улучшить адгезию клеток в приложениях « in vivo ». Наиболее распространенные полимеры , используемые в био-MEMS включают ПММА , PDMS , OSTEmer и SU-8 .
Биологические материалы
B) и C) Отдельные фибробласты пространственно ограничены геометрией микрорельефа фибронектина.
Микромасштабные манипуляции и формирование паттернов биологических материалов, таких как белки , клетки и ткани , использовались при разработке клеточных массивов , микроматриц , тканевой инженерии на основе микротехнологий и искусственных органов . Биологические микрорельефы можно использовать для высокопроизводительного анализа отдельных клеток, точного контроля клеточного микроокружения, а также для контролируемой интеграции клеток в соответствующие многоклеточные архитектуры для повторения условий in vivo . Фотолитография , микроконтактная печать , селективная микрофлюидная доставка и самособирающиеся монослои - вот некоторые методы, используемые для нанесения рисунка на биологические молекулы на поверхности. Создание микротекстов клеток может быть выполнено с использованием микроконтактного формирования белков внеклеточного матрикса , клеточного электрофореза , оптических пинцетов , диэлектрофореза и электрохимически активных поверхностей.
Бумага
Бумажная микрофлюидика (иногда называемая лабораторией на бумаге) - это использование бумажных субстратов в микротехнологиях для управления потоком жидкости для различных приложений. Бумажная микрофлюидика применялась в бумажном электрофорезе и иммуноанализе , наиболее заметным из которых является коммерческий тест на беременность ClearBlue. Преимущества использования бумаги для микрофлюидики и электрофореза в био-МЭМС включают ее низкую стоимость, биоразлагаемость и естественное капиллярное действие. Серьезным недостатком бумажной микрофлюидики является зависимость скорости капиллярного впитывания от условий окружающей среды, таких как температура и относительная влажность. Бумажные аналитические устройства особенно привлекательны для диагностики в местах оказания медицинской помощи в развивающихся странах как из-за низкой стоимости материалов, так и из-за упора на колориметрические анализы, которые позволяют медицинским работникам легко интерпретировать результаты на глаз. По сравнению с традиционными микроканалов, бумажные микроканалы доступны для ввода образца (особенно судебно - медицинской экспертизы -Style образцов , таких как жидкости организма , и почвы), а также его природных фильтрующих свойств , которые исключают остатков клеток, грязи и других примесей в образцах. Копии на бумажной основе продемонстрировали ту же эффективность при выполнении обычных микрофлюидных операций, таких как гидродинамическое фокусирование , молекулярная экстракция на основе размера, микроперемешивание и разбавление; обычные 96- и 384- луночные микропланшеты для автоматизированного обращения с жидкостями и анализа были воспроизведены с помощью фотолитографии на бумаге для достижения более тонкого профиля и более низкой стоимости материала при сохранении совместимости с обычными считывающими устройствами для микропланшетов . Методы изготовления бумаги с микрорельефом включают фотолитографию , лазерную резку , струйную печать, плазменную обработку и нанесение воскового рисунка.
Электрокинетика
Электрокинетика использовалась в био-МЭМС для разделения смесей молекул и клеток с помощью электрических полей. При электрофорезе заряженные частицы в жидкости перемещаются под действием приложенного электрического поля . Электрофорез использовался для фракционирования небольших ионов , заряженных органических молекул, белков и ДНК . Электрофорез и микрофлюидика очень синергетичны, потому что можно использовать более высокие напряжения в микроканалах из-за более быстрого отвода тепла . Изоэлектрическая фокусировка - это разделение белков, органелл и клеток с разными изоэлектрическими точками . Изоэлектрическая фокусировка требует градиента pH (обычно создаваемого электродами ), перпендикулярного направлению потока. Сортировка и фокусировка интересующих видов достигается благодаря тому, что электрофоретическая сила вызывает перпендикулярную миграцию, пока она не течет вдоль соответствующих изоэлектрических точек. Диэлектрофорез - это движение незаряженных частиц за счет наведенной поляризации от неоднородных электрических полей. Диэлектрофорез можно использовать в био-МЭМС для ловушек диэлектрофореза, концентрируя определенные частицы в определенных точках на поверхности и перенаправляя частицы из одного потока в другой для динамического концентрирования.
Микрофлюидика
Микрожидкостные системы относятся к системам, которые манипулируют небольшими (мкл, нЛ, пЛ, фл) количествами жидкости на микроизготовленных субстратах. Микрожидкостные подходы к био-МЭМС дают несколько преимуществ:
- Поток в микроканалах является ламинарным, что позволяет проводить избирательную обработку клеток в микроканалах, математическое моделирование режимов потока и концентраций , а также количественные прогнозы биологической среды клеток и биохимических реакций.
- Микрожидкостные элементы могут быть изготовлены в клеточном масштабе или меньше, что позволяет исследовать (суб) клеточные явления, посев и сортировку отдельных клеток, а также повторение физиологических параметров.
- Интеграция микроэлектроники , микромеханики и микрооптики на одной платформе позволяет автоматизировать управление устройством , что снижает человеческий фактор и затраты на эксплуатацию.
- Микрожидкостная технология относительно экономична из-за пакетного производства и высокой пропускной способности (распараллеливание и избыточность). Это позволяет производить одноразовые или одноразовые чипы для повышения простоты использования и снижения вероятности биологического перекрестного загрязнения , а также для быстрого создания прототипов.
- Микрожидкостные устройства потребляют гораздо меньшее количество реагентов , могут потребовать лишь небольшого количества аналитов для химического обнаружения, требуют меньше времени для завершения процессов и реакций и производят меньше отходов, чем обычные макрожидкостные устройства и эксперименты.
- Соответствующая упаковка микрофлюидных устройств может сделать их пригодными для носимых устройств, имплантатов и портативных устройств в развивающихся странах.
Интересный подход, сочетающий электрокинетические явления и микрофлюидику, - это цифровая микрофлюидика . В цифровой микрофлюидике поверхность подложки покрывается микрорельефом с помощью электродов и выборочно активируется. Манипуляция небольшими каплями жидкости происходит посредством электросмачивания , которое представляет собой явление, при котором электрическое поле изменяет смачиваемость капли электролита на поверхности.
Контроль потока BioMEMs
Литографические методы изготовления микрофлюидных устройств неэффективны при формировании винтовых механизмов, используемых в клапанах макроуровня. Следовательно, микрофлюидные устройства требуют альтернативных методов управления потоком, ряд из которых в настоящее время популярны:
Quake Valves
Одним из недорогих методов изготовления клапанов с малым временем срабатывания и регулируемым ограничением потока является многослойная мягкая литография (MSL). Клапаны, изготовленные с помощью этой технологии изготовления, называются клапанами Quake, потому что они были впервые созданы в лаборатории Стивена Квейка в Стэнфордском университете . Базовая схема включает два перпендикулярных канала потока, разделенных непроницаемой эластомерной мембраной на их пересечении. Контролируемый воздушный поток проходит через один канал, а технологическая жидкость проходит через другой. Градиент давления между двумя трубопроводами, который регулируется путем изменения расхода управляющего воздуха, заставляет мембрану деформироваться и препятствовать потоку в технологическом канале. В MSL каналы как для технологической жидкости, так и для управляющей жидкости отливаются из эластомерной формы, что делает его полностью аддитивным производственным процессом.
Ледяные клапаны
Ледяные клапаны работают, отводя тепло от одной части проточного канала, заставляя жидкость затвердевать и останавливать поток через эту область. Термоэлектрические (ТЕ) блоки используются для отвода тепла от вилки. Из-за ограниченной разницы температур, которую могут обеспечить блоки ТЕ, их несколько часто соединяются последовательно для получения отрицательных температур на границе раздела субстрат-жидкость, что обеспечивает более быстрое охлаждение. Современная технология ледяных клапанов отличается коротким временем закрытия (0,37 с при 10 мкл / мин), а также работает при высоких скоростях потока (1150 мкл / мин). Ледяные клапаны были впервые представлены в 1995 году, где в качестве охлаждающего агента использовался жидкий углекислый газ под давлением .
Сборные клапаны
Предварительно изготовленные механические винтовые клапаны и соленоидные клапаны не требуют сложных процессов микротехнологии и легко применяются в мягких материалах подложки, таких как PDMS . Винтовые клапаны, в отличие от клапанов Quake и ледяных клапанов, поддерживают свой уровень ограничения потока без подачи энергии и, таким образом, идеальны для ситуаций, когда положение клапана может оставаться в основном постоянным, а приведение в действие человеком-оператором приемлемо. Электромагнитные соленоидные клапаны имеют такое же время срабатывания, как и клапаны Quake, но имеют большую площадь основания и не интегрированы в основание устройства. Это проблема, когда проблема заключается в размерах устройства, например, в имплантируемых устройствах.
Микромасштабное смешивание
Несмотря на то, что время диффузии в микрофлюидных системах значительно короче из-за малых масштабов длины, все еще существуют проблемы с удалением градиентов концентрации во временных масштабах, необходимых для микрофлюидных технологий.
Элементы смешивания ультразвуковой обработки
Обработка ультразвуком часто используется для обеспечения локального смешивания потоков за счет создания акустики сверхвысокой энергии. Микрожидкостные чипы, использующие ультразвуковое смешение, могут иметь как встроенные, так и расположенные снаружи ультразвуковые преобразователи. Обработка ультразвуком также широко используется для лизиса и гомогенизации клеток как в макро-, так и в микрофлюидных системах. Первичный механизм лизиса клеток при обработке ультразвуком - интенсивное местное нагревание и сдвиговые силы .
Пассивные элементы микширования
В пассивном смесительном элементе смешивание достигается за счет временного и пространственного перераспределения входящего ламинарного потока за счет использования параллельных каналов с переменной длиной пути и / или диаметром. Конечным результатом наличия множества параллельных проточных каналов различной длины является то, что материал, первоначально находящийся на краю профиля ламинарного потока, может многократно перераспределяться к противоположному краю, таким образом резко сокращая характерный масштаб диффузионной длины.
Био-МЭМС как миниатюрные биосенсоры
Биосенсоры - это устройства, которые состоят из системы биологического распознавания, называемой биорецептором, и преобразователя . Взаимодействие аналита с биорецептором вызывает эффект, который датчик может преобразовать в измерение, например электрический сигнал . Наиболее распространенные биорецепторы, используемые в биосенсоре, основаны на взаимодействиях антитело-антиген, взаимодействиях нуклеиновых кислот , ферментативных взаимодействиях, клеточных взаимодействиях и взаимодействиях с использованием биомиметических материалов . Общие методы преобразователя включают механическое обнаружение, электрическое обнаружение и оптическое обнаружение.
Микромеханические датчики
Механическое обнаружение в био-МЭМС достигается с помощью кантилеверов микро- и наноразмеров для измерения напряжения и измерения массы, а также пластин или мембран микро- и наноразмеров. При измерении напряжения биохимическая реакция осуществляется выборочно на одной стороне кантилевера, чтобы вызвать изменение свободной поверхностной энергии . Это приводит к изгибу кантилевера, который можно измерить оптически ( отражение лазера в четырехпозиционный детектор) или электрически ( пьезорезистор на фиксированном крае кантилевера) из-за изменения поверхностного напряжения. При измерении массы кантилевер вибрирует на своей резонансной частоте, измеренной электрически или оптически. Когда происходит биохимическая реакция, которая фиксируется на кантилевере, масса кантилевера изменяется, как и резонансная частота. Однако анализ этих данных может быть немного менее простым, поскольку адсорбция образца на кантилевер также изменяет модуль Юнга кантилевера. Изменение жесткости кантилевера также изменит его резонансную частоту, и, следовательно, шум в сигнале колебаний должен быть проанализирован, чтобы определить, является ли резонансная частота также функцией изменения упругости. Одним из распространенных способов использования этого метода является обнаружение несовпадений нуклеотидов в ДНК, поскольку изменение массы, вызванное присутствием неправильного основания, достаточно, чтобы изменить резонансную частоту кантилевера и зарегистрировать сигнал. Измерение массы не так эффективно в жидкостях, потому что минимально обнаруживаемая масса намного выше в демпфированных средах . Подвесные микроканальные резисторы представляют собой особый тип консольной конструкции, которая позволяет обойти это ограничение с помощью микрожидкостных каналов внутри кантилевера. Эти каналы могут перемещать образцы «на месте» по кантилеверу, не погружая кантилевер, минимально влияя на его колебания. Однако эта технология находится в зачаточном состоянии, и ее все еще нельзя использовать за пределами нескольких ограниченных приложений. Преимущество использования кантилеверных датчиков состоит в том, что нет необходимости в оптически обнаруживаемой метке на анализируемом веществе или биорецепторах.
Электрические и электрохимические датчики
Электрическое и электрохимическое обнаружение легко адаптировать для портативности и миниатюризации , особенно по сравнению с оптическим обнаружением. В амперометрических биосенсорах окислительно-восстановительная реакция, катализируемая ферментами, вызывает окислительно-восстановительный электронный ток, который измеряется рабочим электродом. Амперометрические биосенсоры используются в био-МЭМС для обнаружения глюкозы , галактозы , лактозы , мочевины и холестерина , а также для обнаружения газов и гибридизации ДНК . В потенциометрических биосенсорах измерения электрического потенциала на одном электроде производятся относительно другого электрода. Примеры потенциометрических биосенсоров включают ионно-чувствительные полевые транзисторы (ISFET) , химические полевые транзисторы (chem-FET) и светоадресные потенциометрические датчики (LAPS) . В кондуктометрических биосенсорах изменения электрического импеданса между двумя электродами измеряются в результате биомолекулярной реакции. Электропроводящие измерения просты и удобны в использовании, поскольку нет необходимости в специальном электроде сравнения, и они используются для обнаружения биохимических веществ, токсинов , нуклеиновых кислот и бактериальных клеток .
Оптические датчики
Проблемой оптического обнаружения является необходимость интеграции детекторов и фотодиодов в миниатюрный портативный формат в био-МЭМС. Оптическое обнаружение включает методы на основе флуоресценции, методы на основе хемилюминесценции и поверхностный плазмонный резонанс (SPR) . Оптические методы, основанные на флуоресценции, используют маркеры, которые излучают свет на определенных длинах волн, и присутствие или усиление / уменьшение (например, резонансный перенос энергии флуоресценции ) в оптическом сигнале указывает на то, что реакция произошла. Детектирование на основе флуоресценции использовалось в микрочипах и ПЦР на чипах. Хемилюминесценция - это генерация света за счет выделения энергии в результате химической реакции. Биолюминесценция и электрохемилюминесценция - это подтипы хемилюминесценции. Датчики поверхностного плазмонного резонанса могут быть тонкопленочными рефрактометрами или решетками, которые измеряют резонансное поведение поверхностных плазмонов на металлических или диэлектрических поверхностях. Резонанс изменяется, когда биомолекулы захватываются или адсорбируются на поверхности сенсора, и зависит от концентрации аналита, а также его свойств. Поверхностный плазмонный резонанс используется в анализе качества и безопасности пищевых продуктов , медицинской диагностике и мониторинге окружающей среды .
Био-МЭМС для диагностики
Геномные и протеомные микрочипы
Цели геномных и протеомных микрочипов - ускорить и удешевить высокопроизводительный анализ генома , а также идентифицировать активированные гены и их последовательности. В микрочипах используется множество различных типов биологических объектов, но в целом микроматрица состоит из упорядоченного набора микросхем, каждая из которых содержит один определенный молекулярный вид, который взаимодействует с аналитом для одновременного тестирования тысяч параметров в одном эксперименте. Некоторыми применениями геномных и протеомных микрочипов являются неонатальный скрининг , определение риска заболевания и прогнозирование эффективности терапии для персонализированной медицины .
Олигонуклеотидные чипы
Олигонуклеотидные чипы представляют собой микромассивы олигонуклеотидов . Их можно использовать для обнаружения мутаций и мониторинга экспрессии, а также для обнаружения и картирования генов. Основными методами создания микроматрицы олигонуклеотидов являются гелевые подушечки ( Motorola ), микроэлектроды (Nanogen), фотолитография ( Affymetrix ) и струйная технология ( Agilent ).
- С помощью гелевых подушечек готовые олигонуклеотиды прикрепляются к пластырям из активированного полиакриламида.
- Используя микроэлектроды , отрицательно заряженные ДНК и молекулярные зонды могут быть сконцентрированы на электродах под напряжением для взаимодействия.
- С помощью фотолитографии на подложке создается картина световой экспозиции с помощью фотошаблона или виртуальной фотошаблона, проецируемого с помощью цифрового микрозеркального устройства . Свет удаляет фотолибильные защитные группы из выбранных зон воздействия. После снятия защиты нуклеотиды с фотолабильной защитной группой подвергаются воздействию всей поверхности, и процесс химического связывания происходит только там, где на предыдущем этапе был выставлен свет. Этот процесс можно повторить для синтеза олигонуклеотидов относительно короткой длины на поверхности, нуклеотид за нуклеотидом.
- С помощью струйной технологии нуклеотиды печатаются на поверхности капля за каплей с образованием олигонуклеотидов.
кДНК микрочип
Микроматрицы кДНК часто используются для крупномасштабного скрининга и исследований экспрессии. В микрочипах кДНК мРНК из клеток собирают и преобразуют в кДНК путем обратной транскрипции. Затем молекулы кДНК (каждая из которых соответствует одному гену) иммобилизуются металлическими штырями в виде пятен диаметром ~ 100 мкм на мембране, стекле или кремниевом чипе. Для обнаружения флуоресцентно меченая однониточная кДНК из клеток гибридизуется с молекулами на микрочипе, и для анализа используется дифференциальное сравнение между обработанным образцом (помеченным красным, например) и необработанным образцом (помеченным другим цветом, например зеленым). . Красные точки означают, что соответствующий ген был экспрессирован на более высоком уровне в обработанном образце. И наоборот, зеленые точки означают, что соответствующий ген был экспрессирован на более высоком уровне в необработанном образце. Желтые точки в результате перекрытия красных и зеленых точек означают, что соответствующий ген был экспрессирован на относительно одинаковом уровне в обоих образцах, тогда как темные точки указывают на отсутствие или незначительную экспрессию в любом образце.
Пептидные и белковые микрочипы
Мотивация к использованию пептидных и белковых микрочипов заключается, во-первых, в том, что транскрипты мРНК часто плохо коррелируют с фактическим количеством синтезируемого белка. Во-вторых, микромассивы ДНК не могут идентифицировать посттрансляционную модификацию белков, которая напрямую влияет на функцию белка. В-третьих, в некоторых жидкостях организма, например в моче, отсутствует мРНК . Белковая микроматрица состоит из библиотеки белков, иммобилизованной на чипе-подложке, обычно из стекла, кремния, полистирола , ПВДФ или нитроцеллюлозы . В общем, существует три типа белковых микрочипов: функциональные, аналитические или захватывающие, и белковые матрицы с обращенной фазой.
- Функциональные белковые массивы отображают свернутые и активные белки и используются для скрининга молекулярных взаимодействий, изучения белковых путей, определения мишеней для посттрансляционной модификации и анализа ферментативной активности .
- Аналитические или захватывающие белковые матрицы отображают антигены и антитела для профилирования экспрессии белка или антител в сыворотке. Эти массивы можно использовать для открытия биомаркеров , мониторинга количества белка, мониторинга состояний активности в сигнальных путях и профилирования реперториев антител при заболеваниях.
- Массивы белков с обращенной фазой тестируют реплики клеточных лизатов и образцов сыворотки с различными антителами для изучения изменений экспрессии конкретных белков и модификаций белков во время прогрессирования заболевания, а также обнаружения биомаркеров .
Белковые микрочипы имеют строгие условия получения, хранения и экспериментов из-за низкой стабильности и необходимости учитывать естественный фолдинг на иммобилизованных белках. С другой стороны, пептиды более химически устойчивы и могут частично сохранять функции белка. Таким образом, пептидные микроматрицы использовались для дополнения белковых микроматриц в протеомных исследованиях и диагностике. Белковые микроматрицы обычно используют Escherichia coli для производства представляющих интерес белков; тогда как пептидные микрочипы используют метод SPOT (поэтапный синтез пептидов на целлюлозе) или фотолитографию для получения пептидов.
Чипы ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из основных молекулярной биологии метод , который позволяет выборочное усиление из ДНК последовательностей, который является полезным для расширенного использования редких образцов: например , стволовые клетки, биопсий, циркулирующих опухолевых клеток. Реакция включает термоциклирование последовательности ДНК и ДНК-полимеразы при трех различных температурах. Нагревание и охлаждение в обычных устройствах для ПЦР занимает много времени, а типичные реакции ПЦР могут длиться часами. Другими недостатками традиционной ПЦР являются высокий расход дорогостоящих реагентов, предпочтение амплификации коротких фрагментов и получение коротких химерных молекул. Чипы ПЦР служат для миниатюризации реакционной среды для достижения быстрой теплопередачи и быстрого перемешивания за счет большего отношения поверхности к объему и коротких расстояний диффузии . Преимущества микросхем ПЦР включают более короткое время термоциклирования, более равномерную температуру, что увеличивает выход продукции, и портативность для применения в местах оказания медицинской помощи. Микрожидкостные ПЦР-чипы имеют две проблемы: ингибирование ПЦР и загрязнение из-за большого отношения поверхности к объему, увеличивающего взаимодействие поверхности с реагентом. Например, кремниевые подложки обладают хорошей теплопроводностью для быстрого нагрева и охлаждения, но могут отравить полимеразную реакцию. Кремниевые подложки также непрозрачны, что препятствует оптическому обнаружению для КПЦР, и являются электропроводными, что предотвращает электрофоретический транспорт по каналам. Между тем стекло является идеальным материалом для электрофореза, но также тормозит реакцию. Полимеры, в частности ПДМС , оптически прозрачны, не ингибируют и могут использоваться для покрытия электрофоретического стеклянного канала. Также существуют различные другие виды обработки поверхности, включая полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин и диоксид кремния. Существуют стационарные (на основе камеры), динамические (на основе непрерывного потока) и микрокапельные ( цифровая ПЦР ) архитектуры микросхем.
- Камерная архитектура является результатом сокращения обычных реакторов ПЦР, которые трудно масштабировать. Четырех-слой стекло- ПДМС устройство было разработано с использованием этой архитектуры интеграции микроклапаны, microheaters, датчики температуры, 380-Nl реакционных камер, и капиллярный электрофорез каналы для обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) , который имеет attomolar чувствительность обнаружения.
- Архитектура, основанная на непрерывном потоке, перемещает образец через различные температурные зоны для достижения термоциклирования . Этот подход требует меньше энергии и имеет высокую пропускную способность, но требует большого расхода реагентов, и внутри каналов потока могут образовываться пузырьки газа.
- Цифровая ПЦР исключает адсорбцию и загрязнение поверхности образца / реагента за счет проведения ПЦР в микрокаплях или микрокамерах. ПЦР в каплях также предотвращает рекомбинацию гомологичных фрагментов генов, поэтому синтез коротких химерных продуктов исключается.
Медицинские диагностические устройства
.jpg)
Возможность поставить медицинский диагноз у постели больного или в пункте оказания медицинской помощи важна для здравоохранения, особенно в развивающихся странах, где доступ к централизованным больницам ограничен и непомерно дорог. С этой целью были разработаны диагностические био-МЭМС в местах оказания медицинской помощи для взятия проб слюны, крови или мочи и комплексного подхода для выполнения предварительной подготовки проб, фракционирования проб, усиления сигнала, обнаружения аналитов, анализа данных и отображения результатов. В частности, кровь является очень распространенным биологическим образцом, потому что она проходит через тело каждые несколько минут, а ее содержимое может указывать на многие аспекты здоровья.
Подготовка образца
При анализе крови необходимо разделять лейкоциты , тромбоциты , бактерии и плазму . Сита, водосливы, инерционное удержание и устройства для отвода потока - вот некоторые подходы, используемые при подготовке плазмы крови для бесклеточного анализа. Сита могут быть изготовлены на микроуровне с колонками или стойками с высоким соотношением сторон, но они подходят только для низкой нагрузки, чтобы избежать засорения ячейками. Водосливы представляют собой неглубокие мезо-подобные участки, используемые для ограничения потока узкими щелями между слоями без столбов. Одним из преимуществ использования водосливов является то, что отсутствие столбов позволяет более эффективно рециркулировать ретенат для потока через фильтр для смывания забитых ячеек. Магнитные шарики используются для разделения аналитов. Эти микроскопические шарики функционализированы целевыми молекулами и перемещаются по микрофлюидным каналам с использованием переменного магнитного поля. Это служит быстрым методом сбора целей для анализа. После завершения этого процесса прикладывается сильное стационарное магнитное поле для иммобилизации связанных с мишенью шариков и смывания несвязанных шариков. H-фильтр - это микрофлюидное устройство с двумя входами и двумя выходами, которое использует преимущества ламинарного потока и диффузии для разделения компонентов, которые диффундируют через границу раздела между двумя входными потоками. Контролируя скорость потока, расстояние диффузии и время пребывания жидкости в фильтре, клетки исключаются из фильтрата в силу их более низкой скорости диффузии. H-фильтр не забивается и может работать бесконечно долго, но аналиты разбавляются в два раза. Для клеточного анализа клетки можно исследовать в неповрежденном виде или после лизиса . Поток литического буфера может быть введен вместе с потоком, содержащим клетки, и путем диффузии индуцирует лизис перед дальнейшим анализом. Клеточный анализ обычно выполняется с помощью проточной цитометрии и может быть реализован в микрофлюидике с более низкими скоростями жидкости и более низкой пропускной способностью, чем их обычные макроскопические аналоги.
Фракционирование образцов
Разделение микрожидкостных проб может быть достигнуто с помощью капиллярного электрофореза или разделения в непрерывном потоке. При капиллярном электрофорезе длинная тонкая трубка разделяет аналиты по напряжению, поскольку они мигрируют за счет электроосмотического потока. Для разделения непрерывного потока общая идея состоит в том, чтобы приложить поле под углом к направлению потока, чтобы отклонить путь потока пробы к разным каналам. Примеры методов разделения в непрерывном потоке включают электрофорез в непрерывном потоке, изоэлектрическое фокусирование , магнитное разделение в непрерывном потоке и молекулярное просеивание .
Выдающиеся проблемы
- Большинство диагностических устройств, представленных на рынке, могут тестировать только одно заболевание. Более того, большинство устройств имеют двоичный выход (да / нет) без подробной информации о состоянии пациента. Таким образом, помимо разработки тестов на большее количество заболеваний, ученые в настоящее время работают над увеличением сложности этих устройств, чтобы повысить их полезность.
- Трудно производить диагностические устройства MEMS вне лабораторных условий. Большая часть исследований этих устройств проводится в лабораториях с контролируемым климатом, где устройства могут быть испытаны вскоре после их производства. Однако, поскольку многие из этих устройств используются для выявления тропических болезней, они должны быть достаточно прочными, чтобы выжить в жарких и влажных условиях. Они также должны храниться в течение длительного времени с момента производства до момента использования.
- Финансирование исследований тропических болезней ограничено. Кроме того, существует множество нормативных препятствий, которые необходимо устранить до утверждения медицинского устройства, что может стоить десятки миллионов долларов. Таким образом, компании, занимающиеся тропическими болезнями, часто должны совмещать свои исследовательские цели по тропическим болезням с исследованиями в других, более хорошо финансируемых областях медицинских исследований.
Био-МЭМС в тканевой инженерии
Культура клеток
Обычная технология культивирования клеток не позволяет эффективно проводить комбинаторное тестирование кандидатов в лекарства, факторов роста , нейропептидов , генов и ретровирусов в среде для культивирования клеток. Из-за необходимости периодического кормления клеток свежей средой и пассирования даже для тестирования нескольких условий требуется большое количество клеток и материалов, дорогие и громоздкие инкубаторы , большие объемы жидкости (~ 0,1 - 2 мл на образец) и утомительные человеческий труд. Требование человеческого труда также ограничивает количество и продолжительность промежутков времени между экспериментами. Микрожидкостные клеточные культуры потенциально являются значительным улучшением, поскольку их можно автоматизировать, а также они обеспечивают более низкую общую стоимость, более высокую пропускную способность и большее количество количественных описаний изменчивости поведения отдельных клеток. Благодаря включению систем газообмена и контроля температуры на чип, культивирование микрожидкостных клеток может устранить необходимость в инкубаторах и вытяжных шкафах для культивирования тканей . Однако этот тип непрерывного культивирования микрожидкостных клеток также сопряжен со своими уникальными проблемами. Контроль потока важен при посеве клеток в микроканалы, потому что поток необходимо остановить после первоначальной инъекции клеточной суспензии, чтобы клетки прикрепились или оказались захваченными в микролунках, диэлектрофорезных ловушках, микромагнитных ловушках или гидродинамических ловушках. Впоследствии поток необходимо возобновить таким образом, чтобы не создавать больших сил, отрывающих клетки от субстрата. Дозирование жидкостей с помощью ручного или роботизированного дозирования можно заменить микронасосами и микроклапанами, где дозирование жидкости легко определить, в отличие от систем непрерывного потока с помощью микромиксеров. Полностью автоматизированная микрофлюидная система культивирования клеток была разработана для изучения остеогенной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека . Также был разработан портативный микрожидкостный инкубатор для клеточных культур, способный нагревать и перекачивать растворы клеточных культур. Из-за уменьшения объема микрожидкостных культур собранные концентрации выше для лучшего измерения отношения сигнал / шум , но сбор и обнаружение, соответственно, более трудны. В этом отношении могут помочь анализы микроскопии in situ с микрожидкостными культурами клеток, но они по своей природе имеют более низкую пропускную способность из-за того, что зонд микроскопа имеет лишь небольшое поле зрения. Платформа Berkeley Lights Beacon решила проблему сбора и обнаружения, выполнив микрожидкостное культивирование на массиве фотопроводников, которые можно оптоэлектрически активировать для манипулирования клетками через чип. Эта платформа была принята Amgen и Novartis для разработки клеточных линий в биофармацевтической промышленности. Совместные культуры с микропроцессором также внесли свой вклад в био-МЭМС для тканевой инженерии, чтобы воспроизвести условия in vivo и трехмерную естественную структуру. В частности, гепатоциты имеют структуру для совместного культивирования при определенной плотности клеток с фибробластами для поддержания специфических для печени функций, таких как секреция альбумина , синтез мочевины и детоксикация p450 . Точно так же интеграция микрофлюидики с совместными культурами с микропроцессором позволила моделировать органы, в которых взаимодействуют множественные васкуляризированные ткани, такие как гематоэнцефалический барьер и легкие. Функции легких на уровне органов воссоздаются с помощью устройств типа « легкое на чипе», в которых пористая мембрана и засеянный слой эпителиальных клеток циклически растягиваются под воздействием вакуума на соседние микроканалы для имитации вдоха .
Стволовая клеточная инженерия
Целью инженерии стволовых клеток является возможность контролировать дифференцировку и самообновление плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии . Дифференцирование в стволовых клетках зависят от многих факторов, в том числе растворимых и биохимических факторов, жидкости напряжения сдвига , клеточно - ECM взаимодействия, взаимодействия клетки-клетка, а также эмбриоидное тело формирование и организация. Био-МЭМС использовались для исследования того, как оптимизировать культивирование и условия роста стволовых клеток, контролируя эти факторы. Анализ стволовых клеток и их дифференцированного потомства осуществляется с помощью микрочипов для изучения того, как факторы транскрипции и миРНК определяют судьбу клеток, как эпигенетические модификации между стволовыми клетками и их дочерними клетками влияют на фенотипы , а также для измерения и сортировки стволовых клеток по экспрессии их белков.
Биохимические факторы
Микрофлюидика может использовать свой микроскопический объем и характеристики ламинарного потока для пространственно-временного контроля биохимических факторов, доставляемых стволовым клеткам. Генераторы микрожидкостных градиентов использовались для изучения зависимостей "доза-реакция" . Кислород является важным биохимическим фактором, который необходимо учитывать при дифференцировке с помощью факторов транскрипции, индуцированных гипоксией (HIF) и связанных с ними сигнальных путей, особенно в развитии крови, сосудистой сети , плаценты и костной ткани. Традиционные методы изучения воздействия кислорода основывались на настройке всего инкубатора на определенную концентрацию кислорода, что ограничивало анализ попарными сравнениями между нормоксическими и гипоксическими состояниями вместо желаемой характеристики, зависящей от концентрации. Разработанные решения включают использование непрерывных осевых градиентов кислорода и массивов микрофлюидных камер для культивирования клеток, разделенных тонкими мембранами из PDMS на заполненные газом микроканалы .
Напряжение сдвига жидкости
Напряжение сдвига жидкости имеет значение для дифференцировки стволовых клеток сердечно-сосудистых клонов, а также для позднего эмбриогенеза и органогенеза, такого как лево-правая асимметрия во время развития. Макромасштабные исследования не позволяют проводить количественный анализ напряжения сдвига для дифференциации, поскольку они выполняются с использованием проточных камер с параллельными пластинами или аппаратов с вращающимся конусом только в двухпозиционных сценариях. Поток Пуазейля в микрофлюидике позволяет систематически изменять напряжения сдвига, используя геометрию канала и скорость потока через микронасосы , что продемонстрировано с помощью массивов перфузионных камер для мезенхимальных стволовых клеток и исследований адгезии клеток фибробластов .
Взаимодействие клеток с ECM
Взаимодействия клетка- ECM вызывают изменения в дифференцировке и самообновлении за счет жесткости субстрата посредством механотрансдукции и взаимодействия различных интегринов с молекулами ECM. Micropatterning из ECM белков микро-контактной печати (μCP) , струйной печати , и маска распыления были использованы в стволовой клетки - ЕСМ исследования взаимодействия. При использовании микроконтактной печати для контроля области прикрепления клеток было обнаружено , что переключение остеогенных / адипогенных клонов в мезенхимальных стволовых клетках человека может зависеть от формы клеток. Микро- изготовление микропостов и измерение их отклонения может определять силы тяги, действующие на клетки. Фотолитография также может быть использована для сшивания засеянных клетками фотополимеризуемого ECM для трехмерных исследований. Использование микрочипов ЕСМ для оптимизации комбинаторных эффектов коллагена , ламинина и фибронектина на стволовые клетки более выгодно, чем обычные планшеты с лунками, из-за их более высокой пропускной способности и меньшей потребности в дорогостоящих реагентах.
Межклеточные взаимодействия
Судьба клеток регулируется как взаимодействиями между стволовыми клетками, так и взаимодействиями между стволовыми клетками и мембранными белками . Управление плотностью посева клеток - распространенный биологический метод контроля межклеточных взаимодействий , но контроль локальной плотности затруднен, и часто бывает трудно разделить эффекты между растворимыми сигналами в среде и физическими межклеточными взаимодействиями. Микропаттернирование белков клеточной адгезии можно использовать для определения пространственного положения различных клеток на субстрате для изучения пролиферации ESC человека. Посев стволовых клеток в микролунки PDMS и переворачивание их на субстрат или другой клеточный слой - это метод достижения точного пространственного контроля. Связь с щелевыми соединениями также изучалась с помощью микрофлюидики, при которой отрицательное давление, создаваемое потоком жидкости в боковых каналах, примыкающих к центральному каналу, улавливает пары клеток, которые находятся в прямом контакте или разделены небольшим зазором. Однако в целом ненулевая подвижность и короткое время клеточного цикла стволовых клеток часто нарушают пространственную организацию, налагаемую этими микротехнологиями.
Формирование и организация эмбриоидного тела
Эмбриоидные тельца являются обычным тестом на плюрипотентность стволовых клеток in vitro, и их размер необходимо контролировать, чтобы вызвать направленную дифференцировку в определенные клоны. Высокопроизводительное формирование эмбриоидных телец одинакового размера с помощью микролунок и микрофлюидики позволяет легко извлекать их и, что более важно, масштабировать для клинических условий. Активный контроль за организацией и архитектурой клеток эмбриоидного тела может также направлять дифференцировку стволовых клеток с помощью микрофлюидных градиентов энтодермы , мезодермы и факторов, индуцирующих эктодерму , а также факторов самообновления.
Вспомогательные репродуктивные технологии
Вспомогательные репродуктивные технологии помогают лечить бесплодие и генетически улучшать поголовье. Однако эффективность этих технологий при криоконсервации и производстве эмбрионов млекопитающих in vitro невысока. В этих технологиях была применена микрофлюидика , чтобы лучше имитировать микроокружение in vivo с структурированными топографическими и биохимическими поверхностями для контролируемой пространственно-временной адгезии клеток, а также минимизировать мертвые объемы. Микронасосы и микроклапаны могут автоматизировать утомительные процедуры дозирования жидкости, а различные датчики могут быть интегрированы для контроля качества в реальном времени . Устройства Bio-MEMS были разработаны для оценки подвижности сперматозоидов , выполнения отбора сперматозоидов , а также предотвращения полиспермии при экстракорпоральном оплодотворении .
Био-МЭМС в медицинских имплантатах и хирургии
Имплантируемые микроэлектроды
Имплантируемые микроэлектроды предназначены для взаимодействия с нервной системой организма для регистрации и отправки биоэлектрических сигналов для изучения заболеваний, улучшения протезов и мониторинга клинических параметров . Микрофабрикация привела к разработке зондов Мичигана и электродной решетки штата Юта , которые имеют увеличенное количество электродов на единицу объема, одновременно решая проблемы толстых подложек, вызывающих повреждение во время имплантации и вызывающих реакцию с инородным телом и инкапсуляцию электродов через кремний и металлы в электродах. Мичиганские зонды использовались в крупномасштабных записях и сетевом анализе нейронных сборок, а электродная матрица Юты использовалась в качестве интерфейса мозг-компьютер для парализованных. Внеклеточные микроэлектроды нанесены на надувной спиралевидный пластик в кохлеарных имплантатах для более глубокого введения и лучшего контакта электрода с тканью для передачи высококачественных звуков. Интеграция микроэлектроники на тонких гибких подложках привела к разработке сердечного пластыря, который прикрепляется к криволинейной поверхности сердца только за счет поверхностного натяжения для измерения электрофизиологии сердца и электронных татуировок для измерения температуры кожи и биоэлектричества . Беспроводная регистрация электрофизиологических сигналов возможна путем добавления пьезокристалла в цепь из двух записывающих электродов и одного транзистора на имплантированном микроустройстве. Внешний преобразователь излучает импульсы ультразвуковой энергии}, которые попадают на пьезокристалл, а изменения внеклеточного напряжения отражаются ультразвуком на пьезокристалле обратно, что позволяет проводить измерения. Сеть так называемых «нейронных пылинок» может отображать сигналы в той области тела, где имплантированы микродатчики.
Микроинструменты для хирургии
Био-МЭМС для хирургических приложений может улучшить существующие функциональные возможности, добавить новые возможности для хирургов по разработке новых методов и процедур, а также улучшить хирургические результаты за счет снижения риска и предоставления обратной связи в режиме реального времени во время операции. Хирургические инструменты с микромеханической обработкой, такие как крошечные щипцы , наборы микроигл и очистители тканей, стали возможными благодаря технологиям послойного микротехнологирования из металла и керамики для малоинвазивной хирургии и роботизированной хирургии . Включение датчиков в хирургические инструменты также обеспечивает тактильную обратную связь для хирурга, идентификацию типа ткани по деформации и плотности во время операций резания и диагностическую катетеризацию для измерения кровотока , давления, температуры , содержания кислорода и химических концентраций.
Доставки лекарств
Микроиглы, системы составов и имплантируемые системы - это био-МЭМС, применимые для доставки лекарств . Микроиглы размером примерно 100 мкм могут проникать через кожный барьер и доставлять лекарства в подлежащие клетки и интерстициальную жидкость с уменьшением повреждения тканей, уменьшением боли и отсутствием кровотечения. Микроиглы также могут быть интегрированы с микрофлюидикой для автоматической загрузки или мультиплексирования лекарств. С точки зрения пользователя, микроиглы могут быть включены в формат пластыря для самостоятельного введения и не представляют собой острую биологическую опасность (если материал полимерный ). Доставка лекарств с помощью микроигл включает покрытие поверхности терапевтическими агентами, загрузку лекарств в пористые или полые микроиглы или изготовление микроигл с лекарством и матрицей покрытия для максимальной загрузки лекарственного средства. Также разрабатываются микроиглы для экстракции интерстициальной жидкости, крови и доставки генов . Эффективность доставки лекарств с помощью микроигл остается проблемой, поскольку трудно установить, действительно ли микроиглы проникли через кожу. Некоторые препараты, такие как диазепам , плохо растворимы, и их необходимо распылить непосредственно перед интраназальным введением . В этих обстоятельствах можно использовать технологию био-МЭМС с использованием пьезоэлектрических преобразователей в резервуары с жидкостью для создания узкого распределения аэрозолей по размерам для лучшей доставки лекарств. Также были разработаны имплантируемые системы доставки лекарств для введения терапевтических агентов, которые имеют плохую биодоступность или требуют локализованного высвобождения и воздействия на целевой участок. Примеры включают микрофлюидное устройство PDMS, имплантированное под конъюнктиву для доставки лекарств в глаз для лечения глазных заболеваний, и микрочипы с покрытыми золотом резервуарами для лекарств от остеопороза . В имплантируемых био-MEMS для доставки лекарств важно учитывать разрыв устройства и сброс дозы , фиброзную инкапсуляцию устройства и эксплантацию устройства. Большинство лекарств также необходимо доставлять в относительно больших количествах (миллилитры или даже больше), что затрудняет доставку имплантируемых биомЭМС-лекарств из-за их ограниченной способности удерживать лекарства.