Морилка Hoechst - Hoechst stain

Химическая структура красителей Hoechst.

Красители Hoechst являются частью семейства синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК . Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны Hoechst AG , которая пронумеровала все их соединения, так что краситель Hoechst 33342 стал 33 342-м составом, произведенным компанией. Есть три связанное пятно Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются те , наиболее часто используемыми , и они имеют схожие возбуждение - спектры излучения .

Молекулярные характеристики

Спектры возбуждения-излучения красителей Хёхста.

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом с длиной волны около 350 нм , и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг максимума спектра излучения на 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальное излучение флуоресценции в диапазоне 510–540 нм. Пятна Hoechst можно возбудить ксеноновой или ртутной дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером . Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и испускания, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров . Интенсивность флуоресценции Hoechst красители также возрастает с увеличением рН от растворителя .

Красители Hoechst растворимы в воде и в органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрация может достигать 10 мг / мл. Водные растворы стабильны при 2–6 ° C не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы замораживают при температуре –20 ° C или ниже.

Hoechst 33258 (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 264D .

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК с предпочтением последовательностей, богатых аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию. Красители Hoechst проницаемы для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными , что означает, что живые клетки выживают после обработки этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфические белки- переносчики АТФ-связывающих кассет, также могут активно транспортировать эти красители из своей цитоплазмы .

Приложения

Трансмиссионное изображение клеток HeLa с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Крайняя левая ячейка находится в прометафазах стадии митоза ; его хромосомы ярко флуоресцируют, потому что они содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивированных нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец обрабатывали красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На рисунке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования внеклеточных ловушек нейтрофилов у пациентов с БА, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг / мл обычно используется для окрашивания ДНК в клетках бактерий или эукариот . Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 ° C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленая флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых. Красители Hoechst часто используются как заменители другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI .

Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI:

  • Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток.
  • Дополнительная этильная группа красителей Hoechst делает их более проницаемыми для клеток.
  • Существуют красители, окрашивающие ядра, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания.

Hoechst 33342 и 33258 являются гасили путем бромдеоксиуридина (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую проницаемость для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве заменителя тимидина . Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst даже сильнее с BrdU-замещенной ДНК; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга развития клеточного цикла .

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих областях:

Отток Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, они могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции . Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным хехстом, через красный и синий фильтры и нанесением красных и синих хехстов друг на друга.

Токсичность и безопасность

Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клеток . Следовательно, они потенциально мутагенные и канцерогенные , поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними и их утилизации. Окраска Hoechst используется для сортировки спермы у скота и людей. Его безопасность обсуждалась.

Смотрите также

Рекомендации

Внешние ссылки