Сортировка спермы - Sperm sorting
Сортировка сперматозоида является средством выбора , каким типа сперматозоида является оплодотворение в яйцеклетку . Несколько традиционных методов центрифугирования или всплытия . Новые применяемые методы, такие как проточная цитометрия, расширяют возможности сортировки сперматозоидов, и разрабатываются новые методы сортировки сперматозоидов.
Его можно использовать для сортировки наиболее здоровых сперматозоидов, а также для определения более конкретных признаков, таких как выбор пола, при котором сперматозоиды разделяются на популяции, несущие X- (женские) и Y- (мужские) хромосомы на основе их разница в содержании ДНК. Полученные в результате сперматозоиды с сортировкой по полу можно использовать в сочетании с другими вспомогательными репродуктивными технологиями, такими как искусственное оплодотворение или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), для получения потомства желаемого пола - в сельскохозяйственных животных, а также в медицинской практике человека. .
Методы
Обычные методы
До появления проточной цитометрии использовалось несколько методов сортировки сперматозоидов. Центрифугирование в градиенте плотности (в непрерывном или прерывистом градиенте) может концентрировать образцы спермы с низкой концентрацией сперматозоидов, используя плотность сперматозоидов в качестве меры их качества. Точно так же, так называемые плавать вверх методы применяют стадию центрифугирования , а затем сперма разрешено плавать вверх в среду, таким образом , обогащение субпопуляции подвижных сперматозоидов. Однако центрифугирование сперматозоидов вредит жизнеспособности сперматозоидов и вызывает выработку активных форм кислорода. Традиционные методы обычно используются в вспомогательных репродуктивных технологиях.
Проточной цитометрии
Проточная цитометрия - это еще один метод, используемый для сортировки сперматозоидов, и адаптации этого метода открывают новые возможности в сортировке сперматозоидов. Однако, поскольку при сортировке сперматозоидов на основе проточной цитометрии часто используются флуоресцентные красители, которые часто окрашивают ДНК, безопасность этого метода в репродуктивной медицине человека является предметом научных дискуссий.
Однако проточная цитометрия - единственный используемый в настоящее время метод, способный определить пол будущего потомства путем измерения содержания ДНК в отдельных сперматозоидах. Он оценивает, содержат ли они большую Х-хромосому (дающую потомство женского пола) или меньшую Y-хромосому (ведущую к потомству мужского пола). Затем он позволяет разделить сперматозоиды X и Y. Так называемая технология определения пола сперматозоидов Beltsfield была разработана Министерством сельского хозяйства США совместно с Ливерморской национальной лабораторией Лоуренса, опираясь на разницу ДНК между X- и Y-хромосомами. Перед проведением проточной цитометрической сортировки сперму маркируют флуоресцентным красителем Hoechst 33342, который связывается с ДНК каждого сперматозоида. Поскольку X-хромосома больше (т.е. содержит больше ДНК), чем Y-хромосома, «женские» (несущие X-хромосому) сперматозоиды будут поглощать большее количество красителя, чем их мужской (несущий Y-хромосому) аналог. Как следствие, при воздействии УФ-света во время проточной цитометрии X-сперматозоиды флуоресцируют ярче, чем Y-сперматозоиды. Когда сперматозоиды проходят через проточный цитометр в виде одного файла, каждый сперматозоид заключен в одну каплю жидкости, и ему присваивается электрический заряд, соответствующий его хромосомному статусу (например, X-положительный заряд, Y-отрицательный заряд). Затем поток капель X и Y разделяется с помощью электростатического отклонения и собирается в отдельные пробирки для сбора для последующей обработки.
Другой цитометрический метод, используемый при сортировке сперматозоидов, - это сортировка клеток с магнитной активацией (MACS), которая обычно применяется в больницах вспомогательной репродукции для сортировки сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Это достигается с помощью антител к поверхностным маркерам запрограммированной гибели клеток ( апоптоза ), таким как аннексин V , в сочетании с магнитными шариками. После связывания этих антител сперматозоиды, подвергшиеся апоптозу, сортируются путем приложения магнитного поля к суспензии сперматозоидов. MACS устраняет необходимость во флуоресцентных ДНК-связывающих молекулах.
Другие техники
Повреждение ДНК в сперматозоидах может быть обнаружено с помощью рамановской спектроскопии . Однако он недостаточно специфичен для выявления индивидуальных черт. Сперматозоиды с наименьшим повреждением ДНК могут быть впоследствии введены в яйцеклетку путем интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). Многие другие методы сортировки сперматозоидов были предложены или в настоящее время проходят испытания.
Для отбора сперматозоидов с низким индексом повреждения ДНК популяция сперматозоидов может быть обогащена сперматозоидами с нефрагментированной ДНК с помощью таких методов, как электрофорез , Z-метод и MACS (сортировка клеток с магнитной активацией), которые в сочетании с центрифугированием в градиенте плотности в одном препарате спермы. протоколы приводят к получению сперматозоидов высшего качества.
Сайты связывания гиалуроновой кислоты (НА) на плазматической мембране сперматозоидов являются индикатором зрелости сперматозоидов (Huszar et al., 2003, Yudin et al., 1999). Есть два метода, основанных на этом факте: физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (PICSI) и медленная процедура спермы; оба метода требуют подготовки спермы путем промывки или центрифугирования спермы.
Приложения
Сперма проходит процесс естественного отбора, когда миллионы сперматозоидов попадают во влагалище, но лишь немногие достигают яйцеклетки, и тогда только одному обычно позволяют оплодотворить ее. Сперма выбирается не только по ее максимальной подвижности, но и по другим факторам, таким как целостность ДНК , выработка активных форм кислорода и жизнеспособность . Этот выбор в значительной степени обходится в случае экстракорпорального оплодотворения, что приводит к более высокой частоте врожденных дефектов, связанных с вспомогательными репродуктивными методами . Яйцеклетки часто оплодотворяются спермой, у которой мало шансов оплодотворить ее в естественных условиях. Таким образом, сортировку спермы можно использовать для снижения рисков, связанных с вспомогательной репродукцией. Кроме того, продолжаются дискуссии об использовании сортировки спермы для выбора пола ребенка.
Для общего здоровья
Обычные методы сортировки сперматозоидов широко используются для оценки качества спермы перед последующим искусственным оплодотворением или экстракорпоральным оплодотворением . Было подтверждено, что сперма, отсортированная с использованием этих методов, имеет более высокое качество, чем несортированная. Однако такие важные характеристики сперматозоидов, как целостность ДНК, остаются непроверенными с помощью этих традиционных методов. Новые методы на основе проточной цитометрии, такие как окрашивание YO-PRO, позволяют отличить апоптозные и мертвые сперматозоиды от жизнеспособных. Например, окрашивание аннексином V с последующим применением MACS может значительно улучшить показатели наступления беременности в парах с предыдущей неудачей вспомогательной репродукции.
Для выбора пола
В сельском хозяйстве
Сортировка спермы с помощью проточной цитометрии является общепризнанным методом в ветеринарной практике, и в молочной промышленности большинство коров подвергают искусственному осеменению отсортированной спермой для увеличения количества телят (сортировка спермы менее распространена у других видов сельскохозяйственных животных, хотя и искусственных. осеменение - обычное дело). Искусственное оплодотворение сельскохозяйственных животных отсортированной спермой признано Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) как многообещающий способ повышения эффективности сельского хозяйства, необходимого для производства достаточного количества пищи для растущего населения. Использование искусственного оплодотворения отсортированной спермой рассматривается как способ создать оптимальное соотношение телят мужского и женского пола для увеличения производства молочного молока .
В людях
Выбор пола детей может помочь предотвратить наследственные заболевания, связанные с полом, такие как мышечная дистрофия Дюшена или гемофилия, в семьях с историей этих заболеваний. С другой стороны, сортировка спермы у людей поднимает этические проблемы, связанные с идеей выбора пола . При широкомасштабном применении он может вызвать дисбаланс в соотношении полов . Это также может иметь последствия для гендерного равенства, если родители постоянно выбирают мальчика в качестве своего первенца (было показано, что первенцы имеют больше шансов на успех в жизни).
В мире нет страны, которая прямо разрешает выбор пола в немедицинских целях. В 2009 году 31 страна разрешила выбор пола в случае риска заболеваний, связанных с полом, или в других медицинских целях. В США для людей применение сортировки сперматозоидов при выборе пола строго регулируется FDA . После внедрения техники MicroSort она была предложена родителям в рамках клинических испытаний . Процедура была доступна ограниченному количеству участников каждый месяц в дополнение к выполнению определенных критериев, таких как наличие заболевания, связанного с полом, или наличие хотя бы одного ребенка (для уравновешивания семьи). В настоящее время лаборатории MicroSort и врачи-партнеры существуют в нескольких странах (некоторые для общих целей, некоторые предлагают услуги только в случае риска генетических заболеваний, связанных с одним полом).
При высокой точности сортировка сперматозоидов с помощью проточной цитометрии не позволяет получить две совершенно разные популяции. Другими словами, среди «женских» сперматозоидов всегда будет какая-то «мужская» сперма, и наоборот. Точная процентная чистота каждой популяции зависит от сортируемых видов и «ворот», которые оператор размещает вокруг всей популяции, видимой для машины. В целом, чем больше разница в ДНК между X- и Y-хромосомами вида, тем легче создать популяцию с высокой степенью чистоты. У овец и крупного рогатого скота чистота для каждого пола обычно остается выше 90% в зависимости от «стробирования», в то время как для людей она может быть снижена до 90% для «женских» сперматозоидов и 70% для «мужских» сперматозоидов.