Флуорофор - Fluorophore

Для использования и теории флуоресценции см. Флуоресценция в науках о жизни .
Клетка человека, меченная флуорофором .

Флуорофор (или флуорохром , подобно хромофор ) представляет собой флуоресцентное химическое соединение , которое может повторно излучать свет при возбуждении света. Флуорофоры обычно содержат несколько объединенных ароматических групп или плоские или циклические молекулы с несколькими π-связями .

Иногда флуорофоры используются отдельно, в качестве индикатора в жидкостях, в качестве красителя для окрашивания определенных структур, в качестве субстрата ферментов или в качестве зонда или индикатора (когда на его флуоресценцию влияют факторы окружающей среды, такие как полярность или ионы). В более общем случае они ковалентно связаны с макромолекулой , служа маркером (или красителем, или меткой, или репортером) для аффинных или биоактивных реагентов ( антител , пептидов, нуклеиновых кислот). Флуорофоры, в частности, используются для окрашивания тканей, клеток или материалов в различных аналитических методах, например, при флуоресцентной визуализации и спектроскопии .

Флуоресцеин , через его амино-реактивное изотиоцианатное производное флуоресцеинизотиоцианат (FITC), был одним из самых популярных флуорофоров. Начиная с маркировки антител, применение распространилось на нуклеиновые кислоты благодаря карбоксифлуоресцеину (FAM), TET, ...). Другие исторически распространенные флуорофоры - это производные родамина (TRITC), кумарина и цианина . Новые поколения флуорофоров, многие из которых являются запатентованными, часто работают лучше, будучи более фотостабильными, более яркими и / или менее чувствительными к pH, чем традиционные красители со сравнимым возбуждением и излучением.

Флуоресценция

Флуорофор поглощает световую энергию определенной длины волны и повторно излучает свет с большей длиной волны. Поглощенные длины волн , эффективность передачи энергии и время до излучения зависят как от структуры флуорофора, так и от его химического окружения, поскольку молекула в возбужденном состоянии взаимодействует с окружающими молекулами. Длины волн максимального поглощения (≈ возбуждения) и излучения (например, поглощение / излучение = 485 нм / 517 нм) являются типичными терминами, используемыми для обозначения данного флуорофора, но весь спектр может быть важным для рассмотрения. Спектр длин волн возбуждения может быть очень узкой или более широкой полосой, или он может полностью выходить за пределы уровня отсечки. Спектр излучения обычно более резкий, чем спектр возбуждения, и имеет большую длину волны и, соответственно, меньшую энергию. Энергия возбуждения варьируется от ультрафиолета до видимого спектра , а энергия излучения может продолжаться от видимого света до ближней инфракрасной области.

Основные характеристики флуорофоров:

  • Максимальная длина волны возбуждения и излучения (выраженная в нанометрах (нм)): соответствует пику в спектрах возбуждения и излучения (обычно по одному пику для каждого).
  • Молярный коэффициент поглощения (в молярном -1 см -1 ): связывает количество поглощенного света на данной длине волны с концентрацией флуорофора в растворе.
  • Квантовый выход : эффективность энергии, переданной от падающего света к испускаемой флуоресценции (= количество испускаемых фотонов на поглощенные фотоны).
  • Время жизни (в пикосекундах): продолжительность возбужденного состояния флуорофора перед возвращением в основное состояние. Это время, необходимое для того, чтобы популяция возбужденных флуорофоров распалась до 1 / e (≈0,368) от исходного количества.
  • Стоксов сдвиг : разница между максимальной длиной волны возбуждения и максимальной длиной волны излучения.
  • Темная фракция : доля молекул, активных в испускании флуоресценции. Для квантовых точек длительная микроскопия одиночных молекул показала, что 20-90% всех частиц никогда не излучают флуоресценции. С другой стороны, наночастицы конъюгированного полимера (Pdots) почти не показывают темной фракции в своей флуоресценции. Флуоресцентные белки могут иметь темную фракцию из-за неправильного свертывания белка или образования дефектных хромофоров.

Эти характеристики определяют другие свойства, включая фотообесцвечивание или фоторезистентность (потеря флуоресценции при непрерывном возбуждении светом). Следует учитывать и другие параметры, поскольку полярность молекулы флуорофора, размер и форма флуорофора (например, для поляризационной флуоресценции ) и другие факторы могут изменять поведение флуорофоров.

Флуорофоры также можно использовать для гашения флуоресценции других флуоресцентных красителей (см. Статью « Тушение (флуоресценция)» ) или для передачи их флуоресценции на еще более длинной длине волны (см. Статью « Резонансный перенос энергии Фёрстера» (FRET)).

Подробнее о принципе флуоресценции .

Размер (молекулярная масса)

Большинство флуорофоров представляют собой небольшие органические молекулы из 20-100 атомов (200-1000 дальтон - молекулярная масса может быть выше в зависимости от привитых модификаций и конъюгированных молекул), но есть также гораздо более крупные природные флуорофоры, которые являются белками : зеленый флуоресцентный белок (GFP ) составляет 27 к Да и несколько фикобилипротеинов (PE, APC ...) являются ≈240k Da .

Флуоресцентные частицы, такие как квантовые точки : диаметром 2-10 нм, 100-100 000 атомов, также считаются флуорофорами.


Размер флуорофора может стерически мешать меченной молекуле и влиять на полярность флуоресценции.

Семьи

Флуоресценция различных веществ в УФ-свете. Зеленый - флуоресцеин, красный - родамин B, желтый - родамин 6G, синий - хинин, фиолетовый - смесь хинина и родамина 6g. Растворы имеют концентрацию около 0,001% в воде.

Молекулы флуорофоров можно использовать по отдельности или они могут служить флуоресцентным мотивом функциональной системы. Основываясь на молекулярной сложности и методах синтеза, молекулы флуорофоров можно в целом разделить на четыре категории: белки и пептиды, небольшие органические соединения, синтетические олигомеры и полимеры и многокомпонентные системы.

Флуоресцентные белки GFP (зеленый), YFP (желтый) и RFP (красный) могут быть присоединены к другим специфическим белкам с образованием гибридного белка , синтезируемого в клетках после трансфекции подходящего плазмидного носителя.

Небелковые органические флуорофоры принадлежат к следующим основным химическим семействам:

Эти флуорофоры флуоресцируют из-за делокализованных электронов, которые могут перескакивать через полосу и стабилизировать поглощенную энергию. Например, бензол , один из простейших ароматических углеводородов, возбуждается при длине волны 254 нм и излучает при длине волны 300 нм. Это отличает флуорофоры от квантовых точек, которые представляют собой флуоресцентные полупроводниковые наночастицы .

Они могут быть присоединены к белку к определенным функциональным группам, таким как - аминогруппы ( активный эфир , карбоксилат , изотиоцианат , гидразин ), карбоксильные группы ( карбодиимид ), тиол ( малеимид , ацетилбромид ), азид (с помощью химии щелчка или неспецифически ( глутаральдегид )).

Кроме того, могут присутствовать различные функциональные группы для изменения его свойств, таких как растворимость, или придания особых свойств, таких как бороновая кислота, которая связывается с сахарами, или множественные карбоксильные группы для связывания с определенными катионами. Когда краситель содержит электронодонорную и электроноакцепторную группы на противоположных концах ароматической системы, этот краситель, вероятно, будет чувствителен к полярности окружающей среды ( сольватохромный ), поэтому его называют чувствительным к среде. Часто внутри клеток используются красители, непроницаемые для заряженных молекул, в результате чего карбоксильные группы превращаются в сложный эфир, который удаляется эстеразами внутри клеток, например фура-2АМ и флуоресцеиндиацетатом .

Следующие семейства красителей являются группами товарных знаков и не обязательно имеют структурное сходство.

Ядра эндотелиальных клеток легочной артерии крупного рогатого скота, окрашенные в синий цвет с помощью DAPI , митохондрии, окрашенные в красный цвет с помощью MitoTracker Red CMXRos, и F-актин, окрашенные в зеленый цвет с помощью фаллоидина Alexa Fluor 488 и отображенные на флуоресцентном микроскопе.

Примеры часто встречающихся флуорофоров

Реактивные и конъюгированные красители

Краситель Ex (нм) Em (нм) МВт Примечания
Гидроксикумарин 325 386 331 Сукцинимидиловый эфир
Аминокумарин 350 445 330 Сукцинимидиловый эфир
Метоксикумарин 360 410 317 Сукцинимидиловый эфир
Каскад Синий (375); 401 423 596 Гидразид
Тихоокеанский синий 403 455 406 Малеимид
Тихоокеанский апельсин 403 551
Люцифер желтый 425 528
NBD 466 539 294 NBD-X
R-фикоэритрин (PE) 480; 565 578 240 тыс.
Конъюгаты PE-Cy5 480; 565; 650 670 он же Cychrome, R670, Трехцветный, Квантово-красный
Конъюгаты PE-Cy7 480; 565; 743 767
Красный 613 480; 565 613 PE-Texas Red
PerCP 490 675 35 кДа Белок перидинин хлорофилл
TruRed 490 675 695 Конъюгат PerCP-Cy5.5
FluorX 494 520 587 (GE Healthcare)
Флуоресцеин 495 519 389 FITC; чувствительный к pH
БОДИПИ-ФЛ 503 512
G-Dye100 498 524 подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye200 554 575 подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye300 648 663 подходит для мечения белков и электрофореза
G-Dye400 736 760 подходит для мечения белков и электрофореза
Cy2 489 506 714 QY 0,12
Cy3 (512); 550 570; (615) 767 QY 0,15
Cy3B 558 572; (620) 658 QY 0,67
Cy3.5 581 594; (640) 1102 QY 0,15
Cy5 (625); 650 670 792 QY 0.28
Cy5.5 675 694 1272 QY 0,23
Cy7 743 767 818 QY 0.28
TRITC 547 572 444 TRITC
X-родамин 570 576 548 XRITC
Лиссамин Родамин B 570 590
Техасский красный 589 615 625 Сульфонилхлорид
Аллофикоцианин (APC) 650 660 104 тыс.
Конъюгаты APC-Cy7 650; 755 767 Дальний красный

Сокращения:

Красители нуклеиновые кислоты

Краситель Ex (нм) Em (нм) МВт Примечания
Hoechst 33342 343 483 616 AT-селективный
DAPI 345 455 AT-селективный
Hoechst 33258 345 478 624 AT-селективный
SYTOX Синий 431 480 ~ 400 ДНК
Хромомицин А3 445 575 CG-селективный
Митрамицин 445 575
ЙОЙО-1 491 509 1271
Этидиум бромид 210; 285 605 394 в водном растворе
Акридиновый апельсин 503 530/640 ДНК / РНК
SYTOX зеленый 504 523 ~ 600 ДНК
ТОТО-1, ТО-ПРО-1 509 533 Жизненно важное пятно, ТОТО: димер цианина
TO-PRO: цианиновый мономер
Тиазол Апельсин 510 530
CyTRAK Оранжевый 520 615 - (Биостатус) (красный возбуждение темный)
Иодид пропидия (PI) 536 617 668,4
LDS 751 543; 590 712; 607 472 ДНК (543ex / 712em), РНК (590ex / 607em)
7-AAD 546 647 7-аминоактиномицин D, CG-селективный
SYTOX Оранжевый 547 570 ~ 500 ДНК
ТОТО-3, ТО-ПРО-3 642 661
DRAQ5 600/647 697 413 (Биостатус) (полезное возбуждение до 488)
DRAQ7 599/644 694 ~ 700 (Биостатус) (полезное возбуждение до 488)

Красители функции клеток

Краситель Ex (нм) Em (нм) МВт Примечания
Индо-1 361/330 490/405 1010 AM сложный эфир с низким / высоким содержанием кальция (Ca 2+ )
Флуо-3 506 526 855 AM эфир. pH> 6
Флуо-4 491/494 516 1097 AM эфир. pH 7,2
DCFH 505 535 529 2'7'Дихородигидрофлуоресцеин , окисленная форма
DHR 505 534 346 Дигидрородамин 123 , окисленная форма, свет катализирует окисление
SNARF 548/579 587/635 pH 6/9

Флуоресцентные белки

Краситель Ex (нм) Em (нм) МВт QY BR PS Примечания
GFP (мутация Y66H) 360 442
GFP (мутация Y66F) 360 508
EBFP 380 440 0,18 0,27 мономер
EBFP2 383 448 20 мономер
Азурит 383 447 15 мономер
GFPuv 385 508
Т-Сапфир 399 511 0,60 26 год 25 слабый димер
Cerulean 433 475 0,62 27 36 слабый димер
mCFP 433 475 0,40 13 64 мономер
мБирюзовый2 434 474 0,93 28 год мономер
ECFP 434 477 0,15 3
CyPet 435 477 0,51 18 59 слабый димер
GFP (мутация Y66W) 436 485
mKeima-Red 440 620 0,24 3 мономер (MBL)
TagCFP 458 480 29 димер (Евроген)
AmCyan1 458 489 0,75 29 тетрамер (Clontech)
mTFP1 462 492 54 димер
GFP (мутация S65A) 471 504
Мидорииси Циан 472 495 0,9 25 димер (МБЛ)
GFP дикого типа 396 475 508 26k 0,77
GFP (мутация S65C) 479 507
TurboGFP 482 502 26 тыс. 0,53 37 димер, (Евроген)
Тег: GFP 482 505 34 мономер (Евроген)
GFP (мутация S65L) 484 510
Изумруд 487 509 0,68 39 0,69 слабый димер (Invitrogen)
GFP (мутация S65T) 488 511
EGFP 488 507 26k 0,60 34 174 слабый димер (Clontech)
Адзами Грин 492 505 0,74 41 год мономер (MBL)
ZsGreen1 493 505 105 тыс. 0,91 40 тетрамер (Clontech)
TagYFP 508 524 47 мономер (Евроген)
EYFP 514 527 26k 0,61 51 60 слабый димер (Clontech)
Топаз 514 527 57 год мономер
Венера 515 528 0,57 53 15 слабый димер
mCitrine 516 529 0,76 59 49 мономер
YPet 517 530 0,77 80 49 слабый димер
TurboYFP 525 538 26 тыс. 0,53 55,7 димер, (Евроген)
ZsЖелтый1 529 539 0,65 13 тетрамер (Clontech)
Кусабира Апельсин 548 559 0,60 31 год мономер (MBL)
мОранжевый 548 562 0,69 49 9 мономер
Аллофикоцианин (APC) 652 657,5 105 кДа 0,68 гетеродимер, сшитый
mKO 548 559 0,60 31 год 122 мономер
TurboRFP 553 574 26 тыс. 0,67 62 димер, (Евроген)
tdTomato 554 581 0,69 95 98 тандемный димер
TagRFP 555 584 50 мономер (Евроген)
DsRed мономер 556 586 ~ 28 тыс. 0,1 3.5 16 мономер, (Clontech)
DsRed2 («RFP») 563 582 ~ 110 тыс. 0,55 24 (Клонтех)
мКлубника 574 596 0,29 26 год 15 мономер
TurboFP602 574 602 26 тыс. 0,35 26 год димер, (Евроген)
AsRed2 576 592 ~ 110 тыс. 0,21 13 тетрамер (Clontech)
mRFP1 584 607 ~ 30 тыс. 0,25 мономер, ( Цзянь лаборатория )
J-красный 584 610 0,20 8,8 13 димер
R-фикоэритрин (RPE) 565> 498 573 250 кДа 0,84 гетеротример
B-фикоэритрин (BPE) 545 572 240 кДа 0,98 гетеротример
мЧерри 587 610 0,22 16 96 мономер
HcRed1 588 618 ~ 52 тыс. 0,03 0,6 димер (Clontech)
Катюша 588 635 23 димер
P3 614 662 ~ 10 000 кДа фикобилисомный комплекс
Перидинин хлорофилл (PerCP) 483 676 35 кДа тример
mKate (TagFP635) 588 635 15 мономер (Евроген)
TurboFP635 588 635 26 тыс. 0,34 22 димер, (Евроген)
mPlum 590 649 51,4 тыс. 0,10 4.1 53
малина 598 625 0,15 13 мономер, более быстрый фотоотбеливатель, чем mPlum
мСкарлет 569 594 0,70 71 277 мономер

Сокращения:

Приложения

Дополнительная информация: Флуоресценция в науках о жизни

Флуорофоры имеют особое значение в области биохимии и исследований белков , например, в иммунофлуоресценции, но также и в клеточном анализе, например в иммуногистохимии и сенсорах малых молекул .

Использование вне наук о жизни

Кроме того, флуоресцентные красители находят широкое применение в промышленности под названием «неоновые цвета», такие как:

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки