Репликация ДНК - DNA replication

Репликация ДНК: двойная спираль распаковывается и раскручивается, затем каждая отделенная цепь (бирюзовая) действует как шаблон для репликации новой партнерской цепи (зеленая). Нуклеотиды (основания) подбираются для синтеза новых партнерских цепей в две новые двойные спирали.

В молекулярной биологии , репликация ДНК представляет собой биологический процесс получения два идентичных реплик ДНК из одной исходной ДНК - молекулы. Репликация ДНК происходит во всех живых организмах, являясь наиболее важной частью биологической наследственности . Это важно для деления клеток во время роста и восстановления поврежденных тканей, а также гарантирует, что каждая из новых клеток получит свою собственную копию ДНК . Клетка обладает отличительным свойством деления, что делает репликацию ДНК необходимой.

ДНК состоит из двойной спирали двух комплементарных цепей . Двойная спираль описывает внешний вид двухцепочечной ДНК, которая, таким образом, состоит из двух линейных цепей, которые проходят друг напротив друга и скручиваются вместе с образованием. Во время репликации эти нити разделяются. Каждая нить исходной молекулы ДНК затем служит шаблоном для производства своего аналога, процесс, называемый полуконсервативной репликацией . В результате полуконсервативной репликации новая спираль будет состоять из исходной цепи ДНК, а также вновь синтезированной цепи. Механизмы клеточной корректуры и проверки ошибок обеспечивают почти идеальную точность репликации ДНК.

В клетке репликация ДНК начинается в определенных местах или источниках репликации в геноме, который содержит генетический материал организма. Раскручивание ДНК в исходной точке и синтез новых цепей под действием фермента, известного как геликаза , приводит к тому, что репликационные вилки растут в двух направлениях от источника. Ряд белков связан с вилкой репликации, чтобы помочь в инициации и продолжении синтеза ДНК . Наиболее заметно, что ДНК-полимераза синтезирует новые цепи, добавляя нуклеотиды, которые дополняют каждую (матричную) цепь. Репликация ДНК происходит во время S-стадии интерфазы .

Репликация ДНК (амплификация ДНК) также может выполняться in vitro (искусственно вне клетки). ДНК-полимеразы, выделенные из клеток, и искусственные праймеры ДНК могут использоваться для запуска синтеза ДНК в известных последовательностях в матричной молекуле ДНК. Примерами являются полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (LCR) и транскрипционная амплификация (ТМА). В марте 2021 года исследователи сообщили о доказательствах, свидетельствующих о том, что предварительная форма транспортной РНК , необходимый компонент трансляции , биологического синтеза новых белков в соответствии с генетическим кодом , могла быть самой молекулой репликатора на очень раннем этапе развития жизни. или абиогенез .

Структура ДНК

ДНК существует в виде двухцепочечной структуры, в которой обе цепи скручены вместе, образуя характерную двойную спираль . Каждая отдельная цепь ДНК представляет собой цепь из четырех типов нуклеотидов . Нуклеотиды в ДНК содержат сахар дезоксирибозы , фосфат и азотистое основание . Четыре типа нуклеотидов соответствуют четырем нуклеотидным основаниям аденин , цитозин , гуанин и тимин , обычно обозначаемые как A, C, G и T. Аденин и гуанин являются пуриновыми основаниями, а цитозин и тимин - пиримидинами . Эти нуклеотиды образуют фосфодиэфирные связи , создавая фосфатно-дезоксирибозный остов двойной спирали ДНК с нуклеотидными основаниями, направленными внутрь (т. Е. В сторону противоположной цепи). Нуклеооснования сопоставляются между цепями за счет водородных связей с образованием пар оснований . Аденин соединяется с тимином (две водородные связи), а пары гуанина с цитозином (три водородные связи ).

Нити ДНК имеют направленность , и разные концы одной нити называются «3 '(три простых) конца» и «5' (пять простых) концов». По соглашению, если дана последовательность оснований одной цепи ДНК, левый конец последовательности является 5'-концом, а правый конец последовательности - 3'-концом. Нити двойной спирали антипараллельны, одна от 5 'до 3', а противоположная нить от 3 'до 5'. Эти термины относятся к атому углерода в дезоксирибозе, к которому присоединяется следующий фосфат в цепи. Направленность имеет последствия для синтеза ДНК, потому что ДНК-полимераза может синтезировать ДНК только в одном направлении, добавляя нуклеотиды к 3'-концу цепи ДНК.

Спаривание комплементарных оснований в ДНК (посредством водородных связей ) означает, что информация, содержащаяся в каждой цепи, является избыточной. Фосфодиэфирные (внутрицепочечные) связи прочнее, чем водородные (межцепочечные) связи. Фактическая работа фосфодиэфирных связей заключается в том, что в полимерах ДНК 5 'углерод одного нуклеотида соединяется с 3' углеродом другого нуклеотида, в то время как водородные связи стабилизируют двойные спирали ДНК поперек оси спирали, но не в направлении оси 1. .Это позволяет отделить пряди друг от друга. Следовательно, нуклеотиды на одной цепи могут быть использованы для реконструкции нуклеотидов на вновь синтезированной цепи-партнере.

ДНК-полимераза

ДНК-полимеразы добавляют нуклеотиды к 3'-концу цепи ДНК. Если несоответствие случайно включено, дальнейшее удлинение полимеразы ингибируется. Вычитка удаляет несовпадающий нуклеотид, и удлинение продолжается.

ДНК-полимеразы - это семейство ферментов, которые осуществляют все формы репликации ДНК. ДНК-полимеразы, как правило, не могут инициировать синтез новых цепей, а могут только удлинить существующую цепь ДНК или РНК в паре с цепью-матрицей. Чтобы начать синтез, необходимо создать короткий фрагмент РНК, называемый праймером , и спарить его с цепью ДНК-матрицы.

ДНК-полимераза добавляет новую цепь ДНК, удлиняя 3'-конец существующей нуклеотидной цепи, добавляя новые нуклеотиды, соответствующие цепочке матрицы, по одному за счет создания фосфодиэфирных связей . Энергия для этого процесса полимеризации ДНК происходит от гидролиза высокоэнергетических фосфатных (фосфоангидридных) связей между тремя фосфатами, присоединенными к каждому неинкорпорированному основанию . Свободные основания с присоединенными к ним фосфатными группами называются нуклеотидами ; в частности, основания с тремя присоединенными фосфатными группами называются нуклеозидтрифосфатами . Когда нуклеотид добавляется к растущей цепи ДНК, образование фосфодиэфирной связи между проксимальным фосфатом нуклеотида и растущей цепью сопровождается гидролизом высокоэнергетической фосфатной связи с высвобождением двух дистальных фосфатов в виде пирофосфата. . Ферментативный гидролиз образовавшегося пирофосфата в неорганический фосфат потребляет вторую высокоэнергетическую фосфатную связь и делает реакцию необратимой.

В целом ДНК-полимеразы очень точны, с частотой внутренних ошибок менее одной ошибки на каждые 10 ⁷ добавленных нуклеотидов. Кроме того, некоторые ДНК-полимеразы обладают способностью корректировать; они могут удалять нуклеотиды с конца растущей нити, чтобы исправить несовпадающие основания. Наконец, механизмы восстановления несоответствия после репликации контролируют ДНК на наличие ошибок, будучи способными отличить несовпадения в вновь синтезированной цепи ДНК от исходной последовательности цепи. Вместе эти три этапа дискриминации обеспечивают точность репликации менее одной ошибки на каждые 10 ⁹ добавленных нуклеотидов.

Скорость репликации ДНК в живой клетке сначала измеряли как скорость удлинения ДНК фага Т4 в инфицированной фагом E. coli . В период экспоненциального увеличения ДНК при 37 ° C скорость составила 749 нуклеотидов в секунду. Частота мутаций на пару оснований на репликацию во время синтеза ДНК фага Т4 составляет 1,7 на 10 ⁸ .

Процесс репликации

Обзор этапов репликации ДНК

Шаги в синтезе ДНК

Репликация ДНК, как и все процессы биологической полимеризации, протекает в трех ферментативно катализируемых и скоординированных стадиях: инициация, удлинение и завершение.

Посвящение

Роль инициаторов в инициации репликации ДНК.

Формирование пререпликационного комплекса.

Чтобы клетка могла делиться , она должна сначала воспроизвести свою ДНК. Репликация ДНК - это процесс по принципу «все или ничего»; как только репликация начинается, она продолжается до завершения. После завершения репликации она больше не повторяется в том же клеточном цикле. Это стало возможным благодаря разделению инициации пререпликационного комплекса .

Пререпликационный комплекс

В позднем митозе и ранней фазе G1 большой комплекс белков-инициаторов собирается в пререпликационный комплекс в определенных точках ДНК, известных как « источники ». В E. coli первичным белком-инициатором является DnaA ; в дрожжах это комплекс распознавания происхождения . Последовательности, используемые белками-инициаторами, обычно «богаты АТ» (богаты основаниями аденина и тимина), потому что пары оснований АТ имеют две водородные связи (а не три, образованные в паре CG), и, таким образом, их легче разделить на цепи. У эукариот комплекс распознавания ориджина катализирует сборку белков-инициаторов в пререпликационный комплекс. Cdc6 и Cdt1 затем связываются со связанным комплексом распознавания источника в источнике, чтобы сформировать более крупный комплекс, необходимый для загрузки комплекса Mcm на ДНК. Комплекс Mcm - это геликаза, которая распутывает спираль ДНК в точках начала репликации и вилках репликации у эукариот. Комплекс Mcm рекрутируется на поздней фазе G1 и загружается комплексом ORC-Cdc6-Cdt1 на ДНК посредством АТФ-зависимого ремоделирования белка. Загрузка комплекса Mcm на исходную ДНК знаменует завершение образования пререпликационного комплекса.

Если условия окружающей среды прямо в поздней фазе G1, G1 и G1 / S циклин - Cdk комплексы активируются, которые стимулируют экспрессию генов , которые кодируют компоненты ДНК синтетической техники. Активация G1 / S-Cdk также способствует экспрессии и активации комплексов S-Cdk, которые могут играть роль в активации источников репликации в зависимости от вида и типа клеток. Контроль этих Cdk варьируется в зависимости от типа клетки и стадии развития. Эта регуляция лучше всего понятна у почкующихся дрожжей , где S-циклины Clb5 и Clb6 в первую очередь ответственны за репликацию ДНК. Комплексы Clb5,6-Cdk1 непосредственно запускают активацию ориджинов репликации и поэтому необходимы на протяжении S фазы для непосредственной активации каждого ориджина.

Сходным образом Cdc7 также требуется через S-фазу для активации источников репликации. Cdc7 не активен на протяжении клеточного цикла, и его активация строго рассчитана по времени, чтобы избежать преждевременного инициирования репликации ДНК. В конце G1 активность Cdc7 резко возрастает в результате ассоциации с регуляторной субъединицей Dbf4 , которая напрямую связывает Cdc7 и способствует его протеинкиназной активности. Было обнаружено, что Cdc7 является ограничивающим скорость регулятором активности происхождения. Вместе G1 / S-Cdks и / или S-Cdks и Cdc7 взаимодействуют, чтобы напрямую активировать источники репликации, что приводит к инициации синтеза ДНК.

Преинициативный комплекс

В ранней S фазе активация S-Cdk и Cdc7 ведет к сборке преинициативного комплекса, массивного белкового комплекса, сформированного в начале. Формирование преинициативного комплекса вытесняет Cdc6 и Cdt1 из исходного репликационного комплекса, инактивируя и разобирая пре-репликационный комплекс. Загрузка преинициативного комплекса на ориджин активирует геликазу Mcm, вызывая раскручивание спирали ДНК. Комплекс преинициации также загружает в ДНК α-примазу и другие ДНК-полимеразы.

После того, как α-примаза синтезирует первые праймеры, соединения праймер-матрица взаимодействуют с загрузчиком зажима, который загружает скользящий зажим на ДНК, чтобы начать синтез ДНК. Компоненты комплекса преинициации остаются связанными с вилками репликации по мере того, как они выходят из источника.

Удлинение

ДНК-полимераза обладает 5′ – 3 ′ активностью. Все известные системы репликации ДНК требуют наличия свободной 3'- гидроксильной группы, прежде чем можно будет инициировать синтез (примечание: матрица ДНК читается в направлении от 3 'к 5', тогда как новая цепь синтезируется в направлении от 5 'к 3' - это часто бывает смущенный). Различают четыре различных механизма синтеза ДНК:

1. Все клеточные формы жизни и многие ДНК- вирусы , фаги и плазмиды используют примазу для синтеза короткого праймера РНК со свободной 3'-группой ОН, которая впоследствии удлиняется ДНК-полимеразой.
2. Ретроэлементы (включая ретровирусы ) используют РНК переноса, которая запускает репликацию ДНК, обеспечивая свободный 3'-ОН, который используется для удлинения обратной транскриптазой .
3. В аденовирусах и φ29 семействе бактериофагов , то 'ОН группа 3 обеспечиваются боковой цепью аминокислоты генома присоединен белок (терминал белка) , к которому добавлены нуклеотиды с помощью ДНК - полимеразы , чтобы сформировать новую нить.
4. В одноцепочечных ДНК-вирусах - группе, которая включает цирковирусы , геминивирусы , парвовирусы и другие - а также во многих фагах и плазмидах , использующих механизм репликации по кругу (RCR), эндонуклеаза RCR создает разрыв в цепи генома. (одноцепочечные вирусы) или одну из цепей ДНК (плазмиды). 5'-конец разорванной цепи переносится на остаток тирозина на нуклеазе, а свободная 3'-ОН-группа затем используется ДНК-полимеразой для синтеза новой цепи.

Первый из этих механизмов является наиболее известным и используется клеточными организмами. В этом механизме, как только две цепи разделены, праймаза добавляет праймеры РНК к цепям матрицы. Ведущая цепь получает один праймер РНК, а отстающая цепь - несколько. Ведущая цепь непрерывно удлиняется от праймера ДНК-полимеразой с высокой процессивностью , в то время как отстающая цепь прерывисто удлиняется от каждого праймера, образуя фрагменты Окадзаки . РНКаза удаляет фрагменты праймерной РНК, и ДНК-полимераза с низкой процессивностью, отличная от репликативной полимеразы, входит, чтобы заполнить пробелы. Когда это будет завершено, можно будет найти одну щель на ведущей нити и несколько щелей на отстающей нити. Лигаза заполняет эти зазоры, завершая тем самым реплицированную молекулу ДНК.

Примаза, используемая в этом процессе, значительно отличается у бактерий и архей / эукариот . Бактерии используют примазу, принадлежащую к суперсемейству белков DnaG, которая содержит каталитический домен складчатого типа TOPRIM. Фолд TOPRIM содержит ядро ​​α / β с четырьмя консервативными цепями в топологии Россманна . Эта структура также обнаруживается в каталитических доменах топоизомеразы Ia, топоизомеразы II, нуклеаз семейства OLD и белков репарации ДНК, связанных с белком RecR.

Примаза, используемая археями и эукариотами, напротив, содержит высокопроизводительную версию мотива распознавания РНК (RRM). Эта праймаза структурно сходна со многими вирусными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, обратными транскриптазами, циклазами, генерирующими циклические нуклеотиды, и ДНК-полимеразами семейств A / B / Y, которые участвуют в репликации и репарации ДНК. При репликации эукариот праймаза образует комплекс с Pol α.

Множественные ДНК-полимеразы играют разные роли в процессе репликации ДНК. В кишечной палочки , ДНК - Поль III , представляет собой фермент полимераза в первую очередь отвечает за репликацию ДНК. Он собирается в репликационный комплекс на репликационной вилке, который демонстрирует чрезвычайно высокую процессивность, оставаясь нетронутым в течение всего репликационного цикла. Напротив, ДНК Pol I представляет собой фермент, отвечающий за замену праймеров РНК на ДНК. ДНК Pol I обладает экзонуклеазной активностью от 5 'до 3' в дополнение к своей полимеразной активности и использует свою экзонуклеазную активность для разрушения праймеров РНК впереди, поскольку он удлиняет цепь ДНК позади себя, в процессе, называемом ник-трансляцией . Pol I намного менее процессивен, чем Pol III, потому что его основная функция в репликации ДНК состоит в создании множества коротких участков ДНК, а не нескольких очень длинных участков.

У эукариот фермент с низкой процессивностью, Pol α, помогает инициировать репликацию, потому что он образует комплекс с примазой. Считается, что у эукариот синтез ведущей цепи осуществляется Pol ε; однако это мнение недавно было оспорено, предполагая роль Pol δ. Удаление праймера завершается Pol δ, а восстановление ДНК во время репликации завершается Pol ε.

По мере продолжения синтеза ДНК исходные нити ДНК продолжают раскручиваться с каждой стороны пузыря, образуя вилку репликации с двумя зубцами. У бактерий, которые имеют единственный источник репликации на их кольцевой хромосоме, этот процесс создает « тета-структуру » (напоминающую греческую букву тета: θ). Напротив, эукариоты имеют более длинные линейные хромосомы и инициируют репликацию в нескольких источниках внутри них.

Вилка репликации

Схема репликационной вилки.
a: шаблон, b: ведущая цепь, c: отстающая цепь, d: репликационная вилка, e: праймер, f: фрагменты Окадзаки

Многие ферменты участвуют в репликационной вилке ДНК.

Репликационная вилка - это структура, которая формируется внутри длинной спиральной ДНК во время репликации ДНК. Он создается геликазами, которые разрывают водородные связи, удерживающие две нити ДНК вместе в спирали. Полученная структура имеет два ветвящихся «зубца», каждый из которых состоит из одной нити ДНК. Эти две цепи служат шаблоном для ведущей и отстающей цепей, которые будут созданы, когда ДНК-полимераза сопоставит комплементарные нуклеотиды шаблонам; шаблоны могут правильно называться шаблоном ведущей нити и шаблоном отстающей нити.

ДНК считывается ДНК-полимеразой в направлении от 3 'до 5', что означает, что новая цепь синтезируется в направлении от 5 'до 3'. Так как матрицы ведущей и отстающей нити ориентированы в противоположных направлениях на репликационной вилке, основная проблема заключается в том, как добиться синтеза новой отстающей нити ДНК, направление синтеза которой противоположно направлению растущей репликационной вилки.

Ведущая прядь

Ведущая нить - это нить новой ДНК, которая синтезируется в том же направлении, что и растущая репликационная вилка. Такая репликация ДНК непрерывна.

Отстающая прядь

Отстающая нить - это нить новой ДНК, направление синтеза которой противоположно направлению растущей репликационной вилки. Из-за своей ориентации репликация отстающей цепи более сложна по сравнению с репликацией ведущей цепи. Как следствие видно, что ДНК-полимераза на этой цепи «отстает» от другой цепи.

Отстающая нить синтезируется в виде коротких отдельных сегментов. На отстающей нити шаблона , A праймаза «считывает» матричной ДНК и инициирует синтез короткой комплементарной РНК праймера. ДНК-полимераза удлиняет примированные сегменты, образуя фрагменты Окадзаки . Затем праймеры РНК удаляются и заменяются ДНК, и фрагменты ДНК соединяются вместе с помощью ДНК-лигазы .

Динамика на вилке репликации

Собранный зажим ДНК человека, тример белка PCNA .

Во всех случаях геликаза состоит из шести полипептидов, которые охватывают только одну цепь реплицируемой ДНК. Две полимеразы связаны с гексимером геликазы. У эукариот геликаза оборачивается вокруг ведущей нити, а у прокариот - вокруг отстающей нити.

Когда геликаза раскручивает ДНК в репликационной вилке, ДНК впереди вынуждена вращаться. Этот процесс приводит к накоплению изгибов в ДНК впереди. Это нарастание образует сопротивление скручиванию, которое в конечном итоге остановит продвижение репликационной вилки. Топоизомеразы - это ферменты, которые временно разрывают цепи ДНК, снимая напряжение, вызванное раскручиванием двух цепей спирали ДНК; топоизомеразы (включая ДНК-гиразу ) достигают этого путем добавления отрицательных суперспиралей к спирали ДНК.

Голая одноцепочечная ДНК имеет тенденцию сворачиваться назад, образуя вторичные структуры ; эти структуры могут мешать движению ДНК-полимеразы. Чтобы предотвратить это, одноцепочечные связывающие белки связываются с ДНК до тех пор, пока не будет синтезирована вторая цепь, предотвращая образование вторичной структуры.

Двухцепочечная ДНК наматывается на гистоны, которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов, поэтому реплицированная ДНК должна быть намотана на гистоны в тех же местах, что и исходная ДНК. Чтобы гарантировать это, гистоновые шапероны разбирают хроматин перед его репликацией и заменяют гистоны в нужном месте. Некоторые шаги в этой сборке несколько умозрительны.

Зажимные белки образуют скользящий зажим вокруг ДНК, помогая ДНК-полимеразе поддерживать контакт со своей матрицей, тем самым способствуя процессивности. Внутренняя поверхность зажима позволяет пропустить через него ДНК. Как только полимераза достигает конца матрицы или обнаруживает двухцепочечную ДНК, скользящий зажим претерпевает конформационное изменение, которое высвобождает ДНК-полимеразу. Белки, загружающие зажим, используются для первоначальной загрузки зажима, распознавая соединение между матрицей и праймерами РНК. ^{: 274-5}

Белки репликации ДНК

В репликационной вилке многие репликационные ферменты собираются на ДНК в сложную молекулярную машину, называемую реплисомой . Ниже приводится список основных ферментов репликации ДНК, которые участвуют в реплисоме:

Репликационная техника

E. coli Реплисома. Примечательно, что ДНК на отстающей цепи образует петлю. Точная структура реплисомы изучена недостаточно.

Механизмы репликации состоят из факторов, участвующих в репликации ДНК и появляющихся на матричных оцДНК. Механизмы репликации включают примосоторы - ферменты репликации; ДНК-полимераза, ДНК-геликазы, ДНК-зажимы и ДНК-топоизомеразы, а также белки репликации; например, белки, связывающие одноцепочечную ДНК (SSB). В механизмах репликации эти компоненты координируются. У большинства бактерий все факторы, участвующие в репликации ДНК, расположены на вилках репликации, а комплексы остаются на вилках во время репликации ДНК. Эти репликационные механизмы называются реплисомами или системами ДНК-репликазы . Эти термины являются общими для белков, расположенных на вилках репликации. В эукариотических и некоторых бактериальных клетках реплисомы не образуются.

Поскольку механизмы репликации не перемещаются относительно шаблонных ДНК, таких как фабрики, они называются фабриками репликации . На альтернативном рисунке фабрики ДНК подобны проекторам, а ДНК подобны кинематографическим фильмам, которые постоянно проходят в проекторы. В модели фабрики репликации после того, как обе ДНК-геликазы для ведущих цепей и отстающих цепей загружены в матрицу ДНК, геликазы перемещаются вдоль ДНК друг в друга. Хеликазы остаются связанными до конца процесса репликации. Питер Мейстер и др. непосредственно наблюдали сайты репликации в почкующихся дрожжах путем мониторинга ДНК-полимеразы, меченной зеленым флуоресцентным белком (GFP). Они обнаружили репликацию ДНК пар помеченных локусов, симметрично разнесенных от точки начала репликации, и обнаружили, что расстояние между парами заметно уменьшалось со временем. Это открытие предполагает, что механизм репликации ДНК связан с фабриками ДНК. То есть пары фабрик репликации загружены в источники репликации и фабрики, связанные друг с другом. Кроме того, матричные ДНК перемещаются на фабрики, что приводит к экструзии матричных оцДНК и новых ДНК. Открытие Мейстера - первое прямое свидетельство модели фабрики репликации. Последующие исследования показали, что ДНК-геликазы образуют димеры во многих эукариотических клетках, а механизмы бактериальной репликации остаются в одном внутриядерном месте во время синтеза ДНК.

Фабрики репликации выполняют распутывание сестринских хроматид. Распутывание важно для распределения хроматид по дочерним клеткам после репликации ДНК. Поскольку сестринские хроматиды после репликации ДНК удерживают друг друга кольцами когезина , существует единственный шанс распутывания при репликации ДНК. Установка механизмов репликации в качестве фабрик репликации может повысить эффективность репликации ДНК. Если репликационные вилки свободно перемещаются в хромосомах, сцепление ядер усугубляется и препятствует митотической сегрегации.

Прекращение

Эукариоты инициируют репликацию ДНК во многих точках хромосомы, поэтому вилки репликации встречаются и заканчиваются во многих точках хромосомы. Поскольку эукариоты имеют линейные хромосомы, репликация ДНК не может достичь самого конца хромосом. Из-за этой проблемы ДНК теряется в каждом цикле репликации с конца хромосомы. Теломеры - это участки повторяющейся ДНК, расположенные близко к концам, которые помогают предотвратить потерю генов из-за этого укорочения. Укорочение теломер - нормальный процесс в соматических клетках . Это укорачивает теломеры хромосомы дочерней ДНК. В результате клетки могут делиться только определенное количество раз, прежде чем потеря ДНК предотвратит дальнейшее деление. (Это известно как предел Хейфлика .) Внутри линии зародышевых клеток , которая передает ДНК следующему поколению, теломераза удлиняет повторяющиеся последовательности области теломер, чтобы предотвратить деградацию. Теломераза может ошибочно стать активной в соматических клетках, что иногда приводит к образованию рака . Повышенная активность теломеразы - один из признаков рака.

Прекращение требует, чтобы продвижение вилки репликации ДНК было остановлено или заблокировано. Терминация в конкретном локусе, когда она происходит, включает взаимодействие между двумя компонентами: (1) последовательностью сайта терминации в ДНК и (2) белком, который связывается с этой последовательностью, чтобы физически остановить репликацию ДНК. У различных видов бактерий это называется сайт-связывающим белком конца репликации ДНК или Ter-белком .

Поскольку бактерии имеют кольцевые хромосомы, прекращение репликации происходит, когда две репликационные вилки встречаются на противоположном конце родительской хромосомы. E. coli регулирует этот процесс за счет использования терминирующих последовательностей, которые при связывании с белком Tus обеспечивают прохождение только одного направления репликационной вилки. В результате вилки репликации вынуждены всегда встречаться в области терминации хромосомы.

Регулирование

Клеточный цикл эукариотических клеток.

Эукариоты

Внутри эукариот репликация ДНК контролируется в контексте клеточного цикла . По мере того, как клетка растет и делится, она проходит стадии клеточного цикла; Репликация ДНК происходит во время фазы S (фазы синтеза). Прогресс эукариотической клетки по циклу контролируется контрольными точками клеточного цикла . Прохождение через контрольные точки контролируется посредством сложных взаимодействий между различными белками, включая циклины и циклин-зависимые киназы . В отличие от бактерий, эукариотическая ДНК реплицируется в пределах ядра.

Контрольная точка G1 / S (или контрольная точка рестрикции) регулирует, вступают ли эукариотические клетки в процесс репликации ДНК и последующего деления. Клетки, которые не проходят через эту контрольную точку, остаются на стадии G0 и не реплицируют свою ДНК.

После прохождения контрольной точки G1 / S ДНК должна реплицироваться только один раз в каждом клеточном цикле. Когда комплекс Mcm удаляется от источника, пререпликационный комплекс демонтируется. Поскольку новый комплекс Mcm не может быть загружен в источнике до тех пор, пока субъединицы предварительной репликации не будут повторно активированы, один источник репликации не может использоваться дважды в одном и том же клеточном цикле.

Активация S-Cdks в ранней S-фазе способствует разрушению или ингибированию отдельных компонентов пререпликационного комплекса, предотвращая немедленную повторную сборку. S и M-Cdks продолжают блокировать сборку комплекса до репликации даже после завершения S фазы, гарантируя, что сборка не может происходить снова, пока вся активность Cdk не будет снижена в позднем митозе.

У почкующихся дрожжей ингибирование сборки вызывается Cdk-зависимым фосфорилированием компонентов пререпликационного комплекса. В начале S фазы фосфорилирование Cdc6 с помощью Cdk1 вызывает связывание Cdc6 с лигазой убиквитинового протеина SCF , что вызывает протеолитическое разрушение Cdc6. Cdk-зависимое фосфорилирование белков Mcm способствует их экспорту из ядра вместе с Cdt1 во время S фазы, предотвращая загрузку новых комплексов Mcm в источниках в течение одного клеточного цикла. Cdk фосфорилирование комплекса репликации ориджина также ингибирует сборку комплекса до репликации. Индивидуального присутствия любого из этих трех механизмов достаточно, чтобы ингибировать сборку пререпликационного комплекса. Однако мутации всех трех белков в одной и той же клетке действительно запускают повторную инициацию во многих точках репликации в пределах одного клеточного цикла.

В клетках животных белок геминин является ключевым ингибитором сборки пререпликационного комплекса. Геминин связывает Cdt1, предотвращая его связывание с исходным комплексом распознавания. В G1 уровни геминина поддерживаются на низком уровне APC, который убиквитинирует геминин, чтобы нацелить его на деградацию. Когда геминин разрушается, Cdt1 высвобождается, позволяя ему функционировать в сложной сборке до репликации. В конце G1 APC инактивируется, позволяя геминину накапливаться и связывать Cdt1.

Репликация хлоропластов и митохондриальных геномов происходит независимо от клеточного цикла в процессе репликации D-петли .

Фокус репликации

В клетках позвоночных сайты репликации концентрируются в положениях, называемых фокусами репликации . Сайты репликации могут быть обнаружены путем иммуноокрашивания дочерних цепей и ферментов репликации и мониторинга факторов репликации, меченных GFP. С помощью этих методов обнаружено, что фокусы репликации различного размера и положения появляются в S-фазе деления клетки, и их количество на ядро ​​намного меньше, чем количество геномных вилок репликации.

P. Heun et al. , (2001) проследили GFP-меченные фокусы репликации в почкующихся дрожжевых клетках и выявили, что точки начала репликации постоянно перемещаются в G1 и S фазе, а динамика значительно снижается в S фазе. Традиционно сайты репликации фиксировались на пространственной структуре хромосом ядерным матриксом или ламинами . Результаты Хойна опровергают традиционные представления о том, что у почкующихся дрожжей нет ламинов, и подтверждают, что источники репликации самоорганизуются и образуют очаги репликации.

Путем активации источников репликации, контролируемых пространственно и временно, регулируется образование фокусов репликации. DA Jackson et al. (1998) обнаружили, что соседние источники одновременно активируются в клетках млекопитающих. Пространственное сопоставление сайтов репликации приводит к кластеризации вилок репликации. Кластеризация спасает остановившиеся вилки репликации и способствует нормальному прохождению вилок репликации. Прогресс вилок репликации тормозится многими факторами; столкновение с белками или комплексами, прочно связывающимися с ДНК, дефицит dNTP, разрывы на матричных ДНК и т. д. Если репликационные вилки останавливаются, а оставшиеся последовательности из остановившихся вилок не реплицируются, дочерние цепи имеют нереплицированные участки, полученные в результате взлома. Нереплицированные сайты на одной родительской цепи удерживают вместе другую, но не дочерние цепи. Следовательно, образующиеся сестринские хроматиды не могут отделиться друг от друга и не могут делиться на 2 дочерние клетки. Когда срабатывают соседние источники и форк из одного источника останавливается, форк из другого источника получает доступ в направлении, противоположном остановившемуся форку, и дублирует нереплицированные сайты. В качестве другого механизма спасения есть применение неактивных ориджинов репликации, которые лишние ориджины не запускаются при нормальной репликации ДНК.

Бактерии

Dam метилирует аденин сайтов GATC после репликации.

Большинство бактерий не проходят четко определенный клеточный цикл, а вместо этого постоянно копируют свою ДНК; во время быстрого роста это может привести к одновременному возникновению нескольких раундов репликации. У E. coli , наиболее охарактеризованных бактерий, репликация ДНК регулируется с помощью нескольких механизмов, включая: гемиметилирование и секвестирование исходной последовательности, отношение аденозинтрифосфата (АТФ) к аденозиндифосфату (АДФ) и уровни белка. DnaA. Все они контролируют связывание белков-инициаторов с исходными последовательностями.

Поскольку E. coli метилирует последовательности ДНК GATC, синтез ДНК приводит к полуметилированным последовательностям. Эта гемиметилированная ДНК распознается белком SeqA , который связывает и изолирует исходную последовательность; кроме того, DnaA (необходимая для инициации репликации) хуже связывается с гемиметилированной ДНК. В результате вновь реплицированные ориджины не могут немедленно инициировать следующий раунд репликации ДНК.

АТФ накапливается, когда клетка находится в богатой среде, запуская репликацию ДНК, когда клетка достигает определенного размера. АТФ конкурирует с АДФ за связывание с DnaA, и комплекс DnaA-ATP способен инициировать репликацию. Определенное количество белков DnaA также требуется для репликации ДНК - каждый раз, когда копируется источник, количество сайтов связывания для DnaA удваивается, что требует синтеза большего количества DnaA, чтобы обеспечить еще одну инициацию репликации.

У быстрорастущих бактерий, таких как кишечная палочка , репликация хромосом занимает больше времени, чем деление клетки. Бактерии решают эту проблему, инициируя новый раунд репликации до того, как предыдущий был завершен. Новый раунд репликации сформирует хромосому клетки, которая рождается через два поколения после делящейся клетки. Этот механизм создает перекрывающиеся циклы репликации.

Проблемы с репликацией ДНК

Репликационная вилка перезапускается путем гомологичной рекомбинации после репликационного стресса

Эпигенетические последствия дефектов повторной сборки нуклеосом при остановке репликационных вилок

Есть много событий, которые способствуют стрессу репликации, в том числе:

• Неправильное включение рибонуклеотидов
• Необычные структуры ДНК
• Конфликты между репликацией и транскрипцией
• Недостаточность основных факторов репликации
• Общие хрупкие сайты
• Сверхэкспрессия или конститутивная активация онкогенов
• Недоступность хроматина

Полимеразной цепной реакции

Исследователи обычно реплицируют ДНК in vitro с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР использует пару праймеров для охвата целевой области в матричной ДНК, а затем полимеризует партнерские цепи в каждом направлении от этих праймеров с использованием термостабильной ДНК-полимеразы . Повторение этого процесса через несколько циклов усиливает целевой участок ДНК. В начале каждого цикла смесь матрицы и праймеров нагревают, разделяя вновь синтезированную молекулу и матрицу. Затем, когда смесь остывает, оба они становятся матрицами для отжига новых праймеров, и полимераза выходит из них. В результате количество копий целевой области удваивается каждый раунд, экспоненциально увеличиваясь .

Смотрите также

• Жизнь
• Клетка (биология)
• Деление клеток
• Ген
• Экспрессия гена
• Эпигенетика
• Геном
• Автопоэзис
• Расщепление хромосом
• Устройство хранения данных
• Самовоспроизведение
• ДНК Хатимодзи

Примечания

использованная литература