Окрашивание - Staining

Окрашивание - это метод, используемый для увеличения контраста образцов, как правило, на микроскопическом уровне. Пятна и красители часто используются в гистологии (микроскопическое исследование биологических тканей) , а также в медицинских областях патоморфологическую , гематологии и цитопатологии , что акцент на изучении и диагнозов по болезни на микроскопическом уровне. Красители могут использоваться для определения биологических тканей (выделение, например, мышечных волокон или соединительной ткани ), популяций клеток (классификация различных клеток крови ) или органелл внутри отдельных клеток.

В биохимии это включает добавление к субстрату красителя, зависящего от класса ( ДНК , белки , липиды , углеводы ), для определения или количественной оценки присутствия определенного соединения. Окрашивание и флуоресцентная маркировка могут служить аналогичным целям. Биологическое окрашивание также используется для маркировки клеток при проточной цитометрии и для маркировки белков или нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе . Световые микроскопы используются для просмотра окрашенных образцов при большом увеличении, обычно с использованием яркого поля или эпифлуоресцентного освещения.

Окрашивание не ограничивается биологическими материалами, оно также может использоваться для изучения структуры других материалов, например, ламеллярных структур полукристаллических полимеров или доменных структур блок-сополимеров .

In vivo против In vitro

Окрашивание in vivo (также называемое витальным окрашиванием или прижизненным окрашиванием) - это процесс окрашивания живых тканей. Когда определенные клетки или структуры приобретают контрастный цвет, их форма ( морфология ) или положение в клетке или ткани можно легко увидеть и изучить. Обычная цель - выявить цитологические детали, которые иначе могли бы быть неочевидными; однако окрашивание также может выявить, где в клетках или тканях происходят определенные химические вещества или определенные химические реакции.

Окрашивание in vitro включает окрашивание клеток или структур, которые были удалены из их биологического контекста. Некоторые пятна часто объединяются, чтобы выявить больше деталей и особенностей, чем отдельное пятно. В сочетании со специальными протоколами фиксации и подготовки образцов ученые и врачи могут использовать эти стандартные методы в качестве последовательных, повторяемых диагностических инструментов. Контрастирующий это пятночто делает клетку или структуру более заметным, когда не полностью виден с главным пятном.

• Кристаллический фиолетовый окрашивает как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Обработка спиртом удаляет кристаллический фиолетовый цвет только у грамотрицательных организмов. Сафранин в качестве контрастного красителя используется для окрашивания грамотрицательных организмов, обесцвеченных алкоголем.

В условиях ex vivo многие клетки продолжают жить и метаболизировать, пока не «закрепятся». Некоторые методы окрашивания основаны на этом свойстве. Эти пятна, исключенные живыми клетками, но поглощенные уже мертвыми клетками, называются витальными пятнами (например, трипановый синий или йодид пропидия для эукариотических клеток). Пятна, которые проникают в живые клетки и окрашивают их, называются суправитальными пятнами (например, новый метиленовый синий и блестящий крезиловый синий для окрашивания ретикулоцитов ). Однако в конечном итоге эти пятна токсичны для организма, некоторые в большей степени, чем другие. Частично из-за их токсического взаимодействия внутри живой клетки, когда суправитальные пятна попадают в живую клетку, они могут давать характерный образец окрашивания, отличный от окрашивания уже фиксированной клетки (например, «ретикулоцитарный» вид по сравнению с диффузной «полихромазией»). Для достижения желаемого эффекта красители используются в очень разбавленных растворах от 1 : 5 000 до 1 : 500 000 (Howey, 2000). Обратите внимание, что многие красители можно использовать как в живых, так и в фиксированных клетках.

Подготовка

Необходимые подготовительные шаги зависят от типа запланированного анализа; Могут потребоваться некоторые или все из следующих процедур.

Влажные крепления - влажные крепления используются для наблюдения за живыми организмами и могут быть изготовлены с использованием воды и некоторых красителей. Жидкость добавляется на предметное стекло перед добавлением микроорганизмов, а покровное стекло помещается на образец в воде и окрашивается, чтобы помочь удержать его в поле зрения .

Фиксация, которая сама по себе может состоять из нескольких этапов, направлена ​​на максимальное сохранение формы вовлеченных клеток или ткани. Иногда используется термофиксация, чтобы убить, закрепить и изменить образец, чтобы он впитал пятна. Большинство химических фиксаторов (химические вещества, вызывающие фиксацию) создают химические связи между белками и другими веществами в образце, увеличивая их жесткость. Обычные фиксаторы включают формальдегид , этанол , метанол и / или пикриновую кислоту . Кусочки ткани могут быть залиты парафином, чтобы увеличить их механическую прочность и стабильность, а также облегчить разрезание на тонкие ломтики.

Протравливание: это химические вещества, которые могут создавать красители для окрашивания материалов, которые в противном случае не поддаются окрашиванию.

Протравы делятся на две категории:

а) Основная протрава: вступает в реакцию с кислотными красителями, например квасцами, сульфатом железа, хлоридом цетилпиридиния и т. д.

б) Кислая протрава: вступает в реакцию с основными красителями, например пикриновой кислотой, дубильной кислотой и т. д.

Прямое окрашивание: без протравы.

Непрямое окрашивание: окрашивание с помощью протравы.

В таблице представлены методы непрямого окрашивания и протравы, применяемые в каждом из них:

Sr Нет.	Название техники непрямого окрашивания	Название нанесенной протравы
1.)	Окрашивание по Граму	Йод по Граму
2.)	Окрашивание клеточной стенки а.) Метод Рингера б.) Метод Дьяра	10% дубильная кислота 0,34% цены за клик
3.)	Окрашивание жгутиков а.) Метод Лейфсона б.) Метод Лёффлера	Дубильная кислота в пятне Лейфсона Протрава Леффлера (20% дубильная кислота)
4.)	Окрашивание спирохетами а.) Метод Фонтаны б.) Метод Беккера	Протрава Фонтаны (5% дубильная кислота) Протрава Фонтаны (5% дубильная кислота)

Проницаемость включает обработку клеток (обычно) мягким поверхностно-активным веществом . Эта обработка растворяет клеточные мембраны и позволяет более крупным молекулам красителя проникать внутрь клетки.

Установка обычно включает прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. В некоторых случаях клетки можно выращивать прямо на предметном стекле. Для образцов рыхлых клеток (например, мазка крови или мазка Папаниколау ) образец можно наносить непосредственно на предметное стекло. Для более крупных кусков ткани делаются тонкие срезы (срезы) с помощью микротома ; затем эти срезы можно смонтировать и проверить.

Стандартизация

Большинство красок, обычно используемых в микроскопии, доступны в виде красителей, сертифицированных BSC . Это означает, что образцы партии производителя были протестированы независимым органом, Комиссией по биологическим пятнам ( BSC ), и было установлено, что они соответствуют или превышают определенные стандарты чистоты, содержания красителя и эффективности в методах окрашивания, что обеспечивает более точное проведение экспериментов и повышение надежности. полученные результаты. Эти стандарты опубликованы в журнале Комиссии Biotechnic & Histochemistry . Состав многих красителей у разных поставщиков неодинаков. Использование красителей, сертифицированных BSC, устраняет источник неожиданных результатов.

Некоторые поставщики продают пятна, «сертифицированные» ими, а не Комиссией по биологическим пятнам. Такие продукты могут подходить или не подходить для диагностических и других приложений.

Отрицательное окрашивание

Простой метод окрашивания на бактерии, который обычно оказывается успешным, даже если методы окрашивания не дают положительных результатов , - это использовать отрицательное окрашивание . Этого можно достичь, намазав образец на предметное стекло, а затем нанеся нигрозин (черный синтетический краситель) или тушь (водная суспензия углеродных частиц). После высыхания микроорганизмы можно рассматривать под микроскопом в светлом поле как более светлые включения, хорошо контрастирующие с окружающей их темной средой. Отрицательное окрашивание может окрашивать фон, а не организмы, потому что клеточная стенка микроорганизмов обычно имеет отрицательный заряд, который отталкивает отрицательно заряженное пятно. Красители, используемые при отрицательном окрашивании, являются кислыми. Примечание: отрицательное окрашивание - это мягкий метод, который не может уничтожить микроорганизмы и поэтому не подходит для изучения патогенов.

Положительное окрашивание

В отличие от отрицательного окрашивания, при положительном окрашивании используются базовые красители для окрашивания образца на ярком фоне. Хотя хромофор используется как для отрицательного, так и для положительного окрашивания, в этом методе используется положительно заряженный ион, а не отрицательный. Отрицательно заряженная клеточная стенка многих микроорганизмов привлекает положительно заряженный хромофор, в результате чего образец впитывает пятно, придавая ему цвет используемого красителя. Положительное окрашивание чаще используется в микробиологии, чем отрицательное. Ниже перечислены различные типы положительного окрашивания.

Простое окрашивание против дифференциального окрашивания

Простое окрашивание - это метод, при котором на слайде одновременно используется только один тип окрашивания. Поскольку используется только одно окрашивание, образцы (для положительных пятен) или фон (для отрицательных пятен) будут одного цвета. Поэтому простые красители обычно используются для просмотра только одного организма на слайде. При дифференциальном окрашивании используется несколько красок на предметное стекло. В зависимости от используемых красителей организмы с разными свойствами будут иметь разные цвета, что позволяет классифицировать несколько образцов. Дифференциальное окрашивание также можно использовать для окрашивания различных органелл в одном организме, что можно увидеть при окрашивании эндоспор .

Типы техник окрашивания

Старший Нет.	Техника окрашивания	Подготовка	заявка	Результат
1.	Простой (монохромный)	Пятно мазка одиночным красителем. например. Метиленовый синий, сафранин и др.	Используется для выделения микробов и иллюстрации клеточного формы и расположения.	Организмы окрашиваются в цвет нанесенной морилки
2.	Отрицательный (облегчение)	Мазок смешать с нигрозином и намазать в тонкую пленку	Изучение морфологии клеток	Организм в пятнах, фон черный
3	Грамм	Первичное окрашивание: Кристаллический фиолетовый нанесен на пленку, затем обработан йодом (протравой), спиртом (обесцвечивающим средством) и окрашен сафранином.	Характеризует бактерии в одной из двух групп: грамположительные или грамотрицательные.	Грамположительный цвет имеет пурпурный цвет Грамм отрицательный имеет розовый цвет
4	Кислотный голод (метод Циля-Нильсена)	Пленка, окрашенная горячим ZNCF, обесцвеченная (кислотно-спиртовая) и контркрашивание метиленовым синим	Отделите не обесцвеченные кислотоустойчивые бактерии, не обесцвеченные, от окрашенных некислотных бактерий.	Кислотоустойчивые бактерии: красный Некислотный: синий
5	Эндоспора (метод Дорнора)	Первичное пятно Малахитовый зеленый нагрев фиксируется для проникновения спор; вегетативные клетки контрастируют с сафранином	Обнаруживает наличие эндоспор у шести родов бактерий	Эндоспоры: зеленые Вегетативные клетки: красный
6	Капсула A: Метод Шипения (Позитивная техника) B: Техника Маневала (отрицательная)	Мазок, окрашенный красителем Хисс после обработки сульфатом меди Бактериальную суспензию смазывают вместе с конго красным и наносят краситель Маневаля.	Капсулы можно рассматривать как прозрачные зоны, окружающие клетки капсулированных бактерий, и они используются для демонстрации присутствия капсул.	Капсула: светло-фиолетовый / бледно-лиловый цвет. Бактерии: фиолетовая капсула, бактериальная клетка, выделяется на темном фоне
7	Клеточная стенка (метод Дьяра)	Мазок обработан CPC, который диссоциирует с образованием положительно заряженного цетилпиридиния и отрицательно заряженных ионов хлора. Положительно заряженные ионы адсорбируются на отрицательно заряженной клеточной стенке.	Окрашивает клеточную стенку бактерии	Клеточная стенка: красная Цитоплазма: синяя
8	Жгутики (метод Лейфсона)	Протравы утолщают жгутики перед окрашиванием и увеличивают микроскопическую видимость при окрашивании красителем Лейфсона.	Демонстрирует наличие жгутиков	Жгутики: красные Вегетативные клетки: синие
9	Ядерный материал (метод Фельгена)	Мазок обрабатывают для гидролиза, чтобы высвободить пурины из ДНК, пурины, чтобы вызвать сдвиг фуранозы в альдегид. Альдегидные группы могут реагировать с реактивом Шиффа с образованием аддитивных соединений.	Чтобы продемонстрировать наличие ДНК в клетке. Но для обнаружения ДНК РНК должна быть избирательно разрушена кислотным гидролизом, не затрагивая ДНК.	Ядерный материал - розовато-фиолетовый, Цитоплазма - бесцветная
10	Метахроматические гранулы (метод Альберта)	Мазок сначала обрабатывают хлороформом для удаления жиров. Мазок нанесен красителем Альберта, который содержит катионные красители, такие как толуидиновый синий и малахитовый зеленый. Толуидиновый синий предпочтительно окрашивает гранулы, в то время как малахитовый зеленый окрашивает цитоплазму.	Гранулы демонстрируют типичную природу монохроматизма, что используется для демонстрации гранул.	Гранулы: Голубовато-черные, Цитоплазма: Зеленые
11	Внутриклеточные липиды (метод Бурдона)	Липиды окрашиваются жирорастворимыми красителями, такими как суданский черный. При применении Судана черные красители-B переходят в липиды и удерживаются там, в то время как цитоплазма контрастно окрашивается сафранином.	Для обнаружения липидов в клеточной стенке, клеточной мембране или жировых глобулах (ПОБ в цитоплазме)	Липидные гранулы: темно-синие, Цитоплазма: светло-розовая.
12	Полисахарид (метод Хотча-Кусса)	Полисахарид окисляется периодатом с образованием полиальдегида, который реагирует с реагентами Шиффа до красного цвета, а цитоплазма окрашивается малахитовым зеленым.	Обнаруживает скопление гранул полисахарида в клетках	Полисахарид: красный Цитоплазма: зеленая

Конкретные техники

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму используется для определения грамм-статуса и классификации бактерий на основе состава их клеточной стенки . При окрашивании по Граму используется кристаллический фиолетовый для окрашивания клеточных стенок, йод (в качестве протравы) и контрастное окрашивание фуксином или сафранином для (маркировки всех бактерий). Статус по Граму помогает разделить образцы бактерий на две группы, обычно представляющие их филогенез. Эта характеристика в сочетании с другими методами делает его полезным инструментом в лабораториях клинической микробиологии, где он может быть важным при раннем выборе подходящих антибиотиков .

На большинстве препаратов, окрашенных по Граму , грамотрицательные микроорганизмы выглядят красными или розовыми из-за их контрастного окрашивания . Из-за более высокого содержания липидов после обработки спиртом пористость клеточной стенки увеличивается, поэтому комплекс CVI (кристаллический фиолетовый - йод) может проходить через нее. Таким образом, основное пятно не сохраняется. Кроме того, в отличие от большинства грамположительных бактерий, грамотрицательные бактерии имеют только несколько слоев пептидогликана и вторичную клеточную мембрану, состоящую в основном из липополисахарида.

Окрашивание эндоспор

Окрашивание эндоспор используется для определения наличия или отсутствия эндоспор , которые очень затрудняют уничтожение бактерий. Доказано, что споры бактерий трудно окрашивать, поскольку они не проницаемы для водных красителей. Окрашивание эндоспор особенно полезно для идентификации образующих эндоспоры бактериальных патогенов, таких как Clostridium difficile . До разработки более эффективных методов это окрашивание выполняли по методу Виртца с термофиксацией и контрастным окрашиванием. Благодаря использованию малахитового зеленого и разбавленного соотношения карбол-фуксина фиксация бактерий в осмиевой кислоте была отличным способом избежать смешивания красителей. Однако недавно пересмотренные методы окрашивания значительно сократили время, необходимое для создания этих пятен. Этот пересмотр включал замену карбол-фуксина водным сафранином в сочетании с недавно разбавленной 5% -ной формулой малахитового зеленого. Этот новый и улучшенный состав пятен был выполнен таким же образом, как и раньше, с использованием термофиксации, полоскания и промокания для последующего исследования. При обследовании все бактерии, образующие эндоспоры, будут окрашены в зеленый цвет, а все остальные клетки - в красный цвет.

Пятно по Цилю-Нильсену

Циля-Нильсен этого пятно некислотоустойчивого используются для видов пятна микобактерий туберкулеза , что не окрашивают с помощью стандартных процедур лабораторного окрашивания , таких как окрашивание по Граму.

Это окрашивание осуществляется за счет использования как красного карбол-фуксина, который окрашивает бактерии, так и контр-красителя, такого как метиленовый синий .

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

Окрашивание гематоксилином и эозином часто используется в гистологии для исследования тонких срезов тканей. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин окрашивает цитоплазму, соединительную ткань и другие внеклеточные вещества в розовый или красный цвет. Эозин сильно поглощается эритроцитами , окрашивая их в ярко-красный цвет. В искусно приготовленном препарате H&E красные кровяные тельца почти оранжевые, а коллаген и цитоплазма (особенно мышцы) приобретают разные оттенки розового.

Окрашивание по Папаниколау

Окрашивание по Папаниколау , или окрашивание PAP, было разработано для замены тонкоигольной аспирационной цитологии (FNAC) в надежде сократить время и стоимость окрашивания без ущерба для качества. Это окрашивание - часто используемый метод для исследования образцов клеток из различных типов тканей в различных органах. Окрашивание PAP претерпело несколько модификаций, чтобы стать «подходящей альтернативой» FNAC. Этот переход произошел из-за того, что ученые оценили влажные фиксированные мазки, сохраняющие структуру ядер, в отличие от непрозрачного внешнего вида высушенных на воздухе мазков Романовского. Это привело к созданию гибридного окрашивания влажной фиксации и воздушной сушки, известного как сверхбыстрое окрашивание папаниколау. Эта модификация включает использование назального физиологического раствора для регидратации клеток с целью увеличения прозрачности клеток и сочетается с использованием спиртового формалина для улучшения цвета ядер. Окрашивание по папаниколау теперь используется вместо цитологического окрашивания во всех типах органов из-за его улучшения морфологического качества, уменьшения времени окрашивания и снижения стоимости. Его часто используют для окрашивания мазков Папаниколау . Он использует комбинацию гематоксилина , оранжевый G , эозин Y , светло - зеленый SF желтоватый , а иногда Bismarck Brown Y .

Окрашивание PAS

Periodic acid-Schiff - это специальный гистологический краситель, используемый для маркировки углеводов ( гликоген , гликопротеин , протеогликаны ). PAS обычно используется на тканях печени, где образуются отложения гликогена, что делается для того, чтобы различать различные типы болезней накопления гликогена. PAS важен, потому что он может обнаруживать гранулы гликогена, обнаруженные в опухолях яичников и поджелудочной железы эндокринной системы, а также в мочевом пузыре и почках почечной системы. Базальные мембраны также могут отображаться при окрашивании PAS и могут быть важны при диагностике почечной недостаточности. Из-за большого количества углеводов в клеточной стенке гиф и дрожжевых форм грибов окрашивание Периодной кислотой по Шиффу может помочь обнаружить эти виды в образцах тканей человеческого тела.

Трихромия Массона

Трихром Массона - это (как следует из названия) протокол трехцветного окрашивания. Рецепт развился из оригинальной техники Массона для различных конкретных применений, но все они хорошо подходят для различения клеток от окружающей соединительной ткани . Большинство рецептов производят красный кератин и мышечные волокна, синее или зеленое окрашивание коллагена и кости , светло-красное или розовое окрашивание цитоплазмы и ядер черных клеток .

Романовские пятна

Эти пятна Романовского считаются полихромными окрашиваниями эффекта и основаны на сочетании эозина плюса (химически восстановленный эозин ) и деметилируют метиленовый синие (содержащий свои продукты окисления лазури A и лазурный B ). Это окрашивание проявляет различные цвета для всех клеточных структур («эффект Романовского-Гимзы») и, таким образом, использовалось для окрашивания полиморфов нейтрофилов и ядер клеток. Общие варианты включают пятно Райта , пятно Дженнер , Май-Грюнвальд пятно, Leishman пятно и Гимз .

Все они используются для исследования образцов крови или костного мозга . Они предпочтительнее H&E для исследования клеток крови, потому что различные типы лейкоцитов (белых кровяных телец) могут быть легко различимы. Все они также подходят для анализа крови на наличие паразитов, передающихся через кровь, таких как малярия .

Окрашивание серебром

Окрашивание серебром - это использование серебра для окрашивания гистологических срезов . Такое окрашивание важно для демонстрации белков (например, коллагена III типа ) и ДНК . Он используется, чтобы показать как вещества внутри, так и снаружи клеток . Окрашивание серебром также используется в гель-электрофорезе в температурном градиенте .

Аргентаффинные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после фиксации формалином . Этот метод был открыт итальянцем Камилло Гольджи с помощью реакции между нитратом серебра и дихроматом калия , в результате чего в некоторых клетках осаждается хромат серебра (см . Метод Гольджи ). A rgyrophilic клетка уменьшает раствор серебра до металлического серебра после воздействия на пятно , который содержит восстановитель . Примером этого может быть гидрохинон или формалин.

Окрашивание суданом

При окрашивании суданом используются судановые красители для окрашивания суданофильных веществ, часто включая липиды . Часто используются Судан III , Судан IV , Oil Red O , четырехокись осмия и Sudan Black B. Окрашивание суданом часто используется для определения уровня фекального жира при диагностике стеатореи .

Окрашивание по Виртцу-Конклину

Окрашивание Виртца-Конклина - это специальная техника, разработанная для окрашивания настоящих эндоспор с использованием красителя малахитовый зеленый в качестве основного красителя и сафранина в качестве контрастного красителя. После окрашивания они не обесцвечиваются. Добавление тепла во время процесса окрашивания является огромным фактором. Тепло помогает открыть мембрану спор, чтобы краситель мог проникнуть внутрь. Основная цель этого красителя - показать прорастание спор бактерий. Если происходит процесс прорастания, то спора станет зеленой из-за малахитового зеленого цвета, а окружающая клетка станет красной из-за сафранина. Это пятно также может помочь определить ориентацию спор внутри бактериальной клетки; будь то терминал (на кончике), субтерминал (внутри ячейки) или центральный (полностью в середине ячейки).

Окрашивание коллагеновых гибридизующихся пептидов

Окрашивание гибридизирующим пептидом коллагена (ГПК) позволяет легко и напрямую окрашивать денатурированные коллагены любого типа (типа I, II, IV и т. Д.), Независимо от того, были ли они повреждены или разложены ферментативными, механическими, химическими или термическими способами. Они работают, свертываясь в тройную спираль коллагена с доступными одиночными нитями в ткани. ГПК можно визуализировать с помощью простого флуоресцентного микроскопа .

Общие биологические пятна

Различные пятна реагируют или концентрируются в разных частях клетки или ткани, и эти свойства используются для выявления определенных частей или областей. Некоторые из наиболее распространенных биологических пятен перечислены ниже. Если не указано иное, все эти красители можно использовать с фиксированными клетками и тканями; отмечены витальные красители (пригодные для использования с живыми организмами).

Акридиновый апельсин

Акридиновый оранжевый (АО) представляет собой флуоресцентный катионный краситель, селективный к нуклеиновым кислотам, полезный для определения клеточного цикла. Он проницаем для клеток и взаимодействует с ДНК и РНК посредством интеркаляции или электростатического притяжения. Когда он связан с ДНК, он очень похож по спектру на флуоресцеин. Подобно флуоресцеину, он также применим в качестве неспецифического красителя для подсветки традиционно окрашенных клеток на поверхности твердого образца ткани (окрашивание с подсветкой флуоресценцией).

Бисмарк коричневый

Бисмарк коричневый (также Бисмарк коричневый Y или манчестерский коричневый) придает желтый цвет кислым муцинам . и интенсивный коричневый цвет тучных клеток. По умолчанию это пятно затмевает любую окружающую его структуру и снижает качество контраста. Чтобы оно было полезным, его нужно сочетать с другими пятнами. Некоторыми дополнительными красителями, используемыми вместе с коричневым Бисмарком, являются гематоксилин и толуидиновый синий, которые обеспечивают лучший контраст в гистологическом образце.

Кармин

Кармин - это ярко-красный краситель, используемый для окрашивания гликогена , а карминные квасцы - для окрашивания ядер. Карминовые пятна требуют использования протравы, обычно алюминиевой .

Кумасси синий

Кумасси синий (также бриллиантовый синий) неспецифически окрашивает белки в ярко-синий цвет. Часто используется в гель-электрофорезе.

Крезил фиолетовый

Крезиловый фиолетовый окрашивает кислотные компоненты цитоплазмы нейронов в фиолетовый цвет, особенно тельца Ниссля . Часто используется в исследованиях мозга.

Кристально-фиолетовый

Кристаллический фиолетовый в сочетании с подходящей протравой окрашивает клеточные стенки в пурпурный цвет. Кристаллический фиолетовый - это краситель, используемый при окрашивании по Граму.

DAPI

DAPI представляет собой флуоресцентный краситель ядер, возбуждаемый ультрафиолетовым светом и демонстрирующий сильную синюю флуоресценцию при связывании с ДНК . DAPI связывается с A = T-богатыми повторами хромосом. DAPI также не виден при обычной просвечивающей микроскопии. Его можно использовать в живых или фиксированных клетках. Клетки, окрашенные DAPI, особенно подходят для подсчета клеток.

Эозин

Эозин чаще всего используется в качестве контрастного красителя гематоксилину, придавая розовый или красный цвет цитоплазматическому материалу, клеточным мембранам и некоторым внеклеточным структурам. Он также придает сильный красный цвет эритроцитам . Эозин также можно использовать в качестве контрастного красителя в некоторых вариантах окрашивания по Граму и во многих других протоколах. На самом деле есть два очень близких соединения, обычно называемых эозином. Чаще всего используется эозин Y (также известный как эозин Y ws или эозин желтоватого цвета); он имеет слегка желтоватый оттенок. Другое соединение эозина - это эозин B (эозин синеватый или имперский красный); у него очень слабый голубоватый оттенок. Эти два красителя взаимозаменяемы, и использование того или другого является, скорее, вопросом предпочтений и традиций.

Этидиум бромид

Бромид этидия интеркалирует и окрашивает ДНК, обеспечивая флуоресцентное красно-оранжевое окрашивание. Хотя он не окрашивает здоровые клетки, его можно использовать для идентификации клеток, находящихся на последних стадиях апоптоза - такие клетки имеют гораздо более проницаемые мембраны . Следовательно, бромистый этидий часто используется в качестве маркера апоптоза в популяциях клеток и для определения местоположения полос ДНК при гель-электрофорезе . Краситель также можно использовать в сочетании с акридиновым оранжевым (АО) при подсчете жизнеспособных клеток. Это комбинированное окрашивание EB / AO заставляет живые клетки флуоресцировать зеленым, в то время как апоптотические клетки сохраняют характерную красно-оранжевую флуоресценцию.

Кислый фуксин

Кислый фуксин можно использовать для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрий . Кислый фуксин используется в качестве окрашивания ядер и цитоплазмы в методе трихрома Мэллори. Кислый фуксин окрашивает цитоплазму в некоторых вариантах трихрома Массона. В пикрофуксине Ван Гизона кислый фуксин придает красный цвет коллагеновым волокнам. Кислый фуксин также является традиционным красителем для митохондрий (метод Альтмана).

Гематоксилин

Гематоксилин (гематоксилин в Северной Америке) - это ядерное пятно. Используется с протравой, окрашивающей ядра гематоксилином в сине-фиолетовый или коричневый цвет. Он чаще всего используется с эозином при окрашивании H&E (гематоксилин и эозин), одной из наиболее распространенных процедур в гистологии .

Пятна Hoechst

Хехст является бис - бензимидазолом производного соединения , которое связывается с малой бороздкой в ДНК . Пятна Hoechst, часто используемые в флуоресцентной микроскопии для окрашивания ДНК, выглядят желтыми при растворении в водных растворах и излучают синий свет при возбуждении УФ-излучением. Существует два основных типа Hoechst : Hoechst 33258 и Hoechst 33342 . Эти два соединения функционально похожи, но имеют небольшую разницу в структуре. Hoechst 33258 содержит концевую гидроксильную группу и, таким образом, более растворим в водном растворе, однако эти характеристики снижают его способность проникать через плазматическую мембрану . Hoechst 33342 содержит этиловое замещение на концевой гидроксильную группе (т.е. этиловой группы) , что делает его более гидрофобным для облегчения прохождения плазмы мембраны

Йод

Йод используется в химии как индикатор крахмала . Когда крахмал смешивается с йодом в растворе, появляется интенсивный темно-синий цвет, представляющий комплекс крахмал / йод. Крахмал - это вещество, обычное для большинства растительных клеток, поэтому слабый раствор йода окрашивает крахмал, присутствующий в клетках. Йод является одним из компонентов метода окрашивания, известного как окрашивание по Граму , используемого в микробиологии . Йод, используемый в качестве протравы при окрашивании по Граму, усиливает проникновение красителя через поры, присутствующие в клеточной стенке / мембране.

Раствор Люголя или йод Люголя (IKI) представляет собой коричневый раствор, который становится черным в присутствии крахмалов и может использоваться в качестве окрашивания клеток, делая ядра клеток более заметными.

Раствор Люголя, используемый с обычным уксусом (уксусной кислотой), используется для выявления предраковых и раковых изменений в тканях шейки матки и влагалища во время контрольных обследований «мазок Папаниколау» при подготовке к биопсии. Уксусная кислота заставляет аномальные клетки бледнеть, в то время как нормальные ткани окрашивают йод в коричневый цвет красного дерева.

Малахитовый зеленый

Малахитовый зеленый (также известный как ромбовидный зеленый B или викторианский зеленый B) можно использовать в качестве сине-зеленого контрастного окрашивания сафранину в технике окрашивания по Гименесу для бактерий. Его также можно использовать для прямого окрашивания спор .

Метиловый зеленый

Метиловый зеленый обычно используется в светлопольных микроскопах, а также в флуоресцентных микроскопах для окрашивания хроматина клеток, чтобы их было легче рассмотреть.

Метиленовый синий

Метиленовый синий используется для окрашивания клеток животных, таких как клетки щек человека, чтобы сделать их ядра более заметными. Также используется для окрашивания мазков крови в цитологии.

Нейтральный красный

Нейтральный красный (или толуиленовый красный) окрашивает вещество Ниссля в красный цвет. Обычно его используют в качестве контрастного красителя в сочетании с другими красителями.

Нильский синий

Нильский синий (или Нильский синий А) окрашивает ядра в синий цвет. Его можно использовать с живыми клетками.

Нильский красный

Нильский красный (также известный как оксазон нильского синего) образуется при кипячении нильского синего с серной кислотой . Это дает смесь нильского красного и нильского синего. Нильский красный - липофильное пятно; он будет накапливаться в липидных глобулах внутри клеток, окрашивая их в красный цвет. Нильский красный можно использовать с живыми клетками. Он сильно флуоресцирует при разделении на липиды, но практически не светится в водном растворе.

Четырехокись осмия (официальное название: четырехокись осмия)

Тетраоксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества.

Иодид пропидия

Иодид пропидия представляет собой флуоресцентный интеркалирующий агент, который можно использовать для окрашивания клеток. Иодид пропидия используется в качестве окраски ДНК в проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток или содержания ДНК в анализе клеточного цикла или в микроскопии для визуализации ядра и других ДНК-содержащих органелл. Йодид пропидия не может проникать через мембрану живых клеток, что делает его полезным для дифференциации некротических, апоптотических и здоровых клеток. PI также связывается с РНК, что требует обработки нуклеазами, чтобы различать окрашивание РНК и ДНК.

Родамин

Родамин представляет собой флуоресцентный краситель, специфичный для белка, обычно используемый в флуоресцентной микроскопии.

Сафранин

Сафранин (или сафранин О) - красный катионный краситель. Он связывается с ядрами (ДНК) и другими тканевыми полианионами, включая гликозаминогликаны в хрящевых и тучных клетках, а также с компонентами лигнина и пластид в тканях растений. Сафранин не следует путать с шафраном, дорогим натуральным красителем, который используется в некоторых методах для придания коллагену желтого цвета, чтобы контрастировать с синим и красным цветами, которые другие красители придают ядрам и цитоплазме в тканях животных (включая человека).

Часто используется неправильное написание «сафранин». Окончание -ine подходит для сафранина О, потому что этот краситель является амином,

Сохраняемость тканей

Ткани, впитывающие пятна, называются хроматическими . Хромосомы были названы так из-за их способности поглощать фиолетовое пятно.

Положительное сродство к конкретному красителю может быть обозначено суффиксом -фильный . Например, ткани, окрашенные лазурным пятном, можно назвать азурофильными . Это также может быть использовано для более общих свойств окрашивания, таких как ацидофильный для тканей, окрашиваемых кислотными пятнами (в первую очередь эозином ), базофильный при окрашивании основными красителями и амфофильный при окрашивании кислотными или основными красителями. Напротив, хромофобные ткани не сразу поглощают цветной краситель.

Электронная микроскопия

Как и в световой микроскопии, красители можно использовать для увеличения контраста в просвечивающей электронной микроскопии . Обычно используются электронно-плотные соединения тяжелых металлов.

Фосфорновольфрамовая кислота

Фосфорновольфрамовая кислота является обычным негативным пятном для вирусов , нервов , полисахаридов и других биологических тканевых материалов. Он в основном используется в форме 0,5–2% pH, что делает его нейтральным, и в сочетании с водой образует водный раствор. Фосфорновольфрамовая кислота заполнена электронно-плотным веществом, которое окрашивает фон, окружающий образец, темным, а сам образец - светлым. Этот процесс не является нормальным положительным методом окрашивания, когда образец темный, а фон остается светлым.

Четырехокись осмия

Четырехокись осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества. Поскольку это тяжелый металл, который поглощает электроны, это, пожалуй, самый распространенный краситель, используемый для морфологии в биологической электронной микроскопии. Он также используется для окрашивания различных полимеров с целью изучения их морфологии с помощью ПЭМ. OsO
₄очень летуч и чрезвычайно токсичен. Это сильный окислитель, так как осмий имеет степень окисления +8. Он агрессивно окисляет многие материалы, оставляя после себя отложения нелетучего осмия в более низкой степени окисления.

Четырехокись рутения

Четырехокись рутения столь же летучая и даже более агрессивная, чем четырехокись осмия, и может окрашивать даже материалы, устойчивые к пятнам осмия, например полиэтилен.

Другие химические вещества , используемые в электронной микроскопии окрашивания включают в себя: молибдат аммония , кадмия йодида , карбогидразид , хлорид трехвалентного железа , уротропина , индий трихлорида , лантана (III) нитрат , ацетат свинца , цитратом свинца , нитрат свинца (II) , периодический кислоту , фосфорно - молибденовой кислоты , калия феррицианид , ферроцианид калии , рутений красный , нитрат серебра , серебра протеинат , chloroaurate натрия , таллий нитрат , тиосемикарбазид , уранил ацетат , нитрат уранила и ванадил сульфат .

Смотрите также

• Комиссия по биологическим пятнам: сторонний контроль качества и сертификация пятен
• Цитология : исследование клеток
• Гистология : исследование тканей
• Иммуногистохимия : использование антисывороток для мечения специфических антигенов
• Трис (дисульфонат батофенантролина) рутения (II) , белковый краситель.
• Жизнеспособное пятно : пятна, не убивающие клетки
• СТРАНИЦА : разделение белковых молекул
• Бариевая клизма - разновидность окрашивания in vivo, создающая контраст в рентгеновской части светового спектра.
• Диафонизация

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки

Библиотечные ресурсы по окрашиванию

Ресурсы в вашей библиотеке Ресурсы в других библиотеках

• Комиссия по биологическим пятнам - это независимая некоммерческая компания, которая тестирует красители с начала 1920-х годов и выдает Сертификаты одобрения на партии красителей, которые соответствуют международно признанным стандартам.
• StainsFile Справочник по красителям и методам окрашивания.
• Жизненно важное окрашивание простейших и соответствующие методы временного крепления ~ Howey, 2000
• Говоря о фиксации: часть 1 и часть 2 - М. Халит Умар
• Микрофотографии пятен гистологии
• Часто задаваемые вопросы по упражнениям по окрашиванию на домашней странице Шридхара Рао ПН