Циркадные часы - Circadian clock
Циркадные часы или циркадный осциллятор , является биохимическим осциллятором , что циклы со стабильной фазой и синхронизирован с солнечным временем .
Период in vivo таких часов обязательно составляет почти ровно 24 часа (текущие солнечные сутки на Земле ). У большинства живых существ внутренне синхронизированные циркадные часы позволяют организму предвидеть ежедневные изменения окружающей среды, соответствующие циклу день-ночь, и соответственно корректировать свою биологию и поведение.
Термин « циркадный ритм» происходит от латинского слова « около» (около) умирает (день), поскольку в отрыве от внешних сигналов (таких как окружающий свет) они не работают ровно 24 часа. Например, часы людей в лаборатории при постоянном слабом освещении в среднем будут составлять около 24,2 часа в сутки, а не ровно 24 часа.
Нормальные биологические часы колеблются с эндогенным периодом ровно 24 часа, они увлекаются , когда получают достаточное количество ежедневных корректирующих сигналов из окружающей среды, в первую очередь дневного света и темноты. Циркадные часы - это центральные механизмы, управляющие циркадными ритмами . Они состоят из трех основных компонентов:
- центральный биохимический осциллятор с периодом около 24 часов, отслеживающий время;
- ряд входных путей к этому центральному генератору, позволяющий увлекать часы;
- серия выходных путей, связанных с отдельными фазами осциллятора, которые регулируют явные ритмы в биохимии, физиологии и поведении во всем организме.
Часы сбрасываются, когда организм улавливает временные ориентиры окружающей среды, основной из которых является свет. Циркадные осцилляторы распространены повсеместно в тканях организма, где они синхронизируются как эндогенными, так и внешними сигналами, чтобы регулировать транскрипционную активность в течение дня тканеспецифичным образом. Циркадные часы связаны с большинством клеточных метаболических процессов и зависят от старения организма. Основные молекулярные механизмы биологических часов были определены у видов позвоночных , Drosophila melanogaster , растений , грибов , бактерий и, предположительно, также у архей .
В 2017 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Джеффри Холлу , Майклу Росбашу и Майклу У. Янгу «за открытие молекулярных механизмов, контролирующих циркадный ритм» у плодовых мух.
Анатомия позвоночных
У позвоночных главные циркадные часы содержатся в супрахиазматическом ядре (SCN), двустороннем нервном кластере, состоящем примерно из 20 000 нейронов. Сам SCN расположен в гипоталамусе , небольшой области мозга, расположенной непосредственно над перекрестом зрительных нервов , где он получает входные данные от специализированных светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки через ретиногипоталамический тракт .
SCN поддерживает контроль над телом, синхронизируя «подчиненные осцилляторы», которые демонстрируют свои собственные почти 24-часовые ритмы и контролируют циркадные явления в местных тканях. Посредством межклеточных сигнальных механизмов, таких как вазоактивный кишечный пептид , SCN сигнализирует другим ядрам гипоталамуса и шишковидной железе, чтобы модулировать температуру тела и выработку гормонов, таких как кортизол и мелатонин ; эти гормоны попадают в систему кровообращения и вызывают воздействие часов во всем организме.
Однако неясно, какой именно сигнал (или сигналы) вызывает основное увлечение многими биохимическими часами, содержащимися в тканях по всему телу. См. Более подробную информацию в разделе «Регулирование циркадных осцилляторов» ниже.
Транскрипционный и нетранскрипционный контроль
Доказательства генетической основе циркадных ритмов у высших эукариот началось с открытием периода ( в ) в локус дрозофилы с передовых генетических экранов , заполненных Рон Конопка и Seymour Бензером в 1971 г. С помощью анализа на циркадных мутантов и дополнительных мутаций на Гены часов дрозофилы , была предложена модель, охватывающая положительные и отрицательные петли ауторегуляторной обратной связи транскрипции и трансляции . Основные гены циркадных «часов» определяются как гены, белковые продукты которых являются необходимыми компонентами для генерации и регулирования циркадных ритмов. Подобные модели были предложены у млекопитающих и других организмов.
Однако исследования цианобактерий изменили наше представление о часовом механизме, поскольку Кондо и его коллеги обнаружили, что эти одноклеточные организмы могут поддерживать точное 24-часовое время в отсутствие транскрипции, т.е. автоматическая трансляция петли обратной связи для ритмов. Более того, эти часы были реконструированы в пробирке (то есть в отсутствие каких-либо клеточных компонентов), доказав, что точные 24-часовые часы могут быть сформированы без необходимости в цепях генетической обратной связи. Однако этот механизм был применим только к цианобактериям, а не к родовым.
В 2011 году серьезный прорыв в понимании происходил в лаборатории Редди Кембриджского университета . Эта группа обнаружила циркадные ритмы в окислительно-восстановительных белках ( пероксиредоксинах ) в клетках, лишенных ядра - красных кровяных телец человека. В этих клетках не было ни транскрипции, ни генетических цепей, а значит, и петли обратной связи. Аналогичные наблюдения были сделаны на морских водорослях, а затем и на эритроцитах мышей. Что еще более важно, окислительно-восстановительные осцилляции, демонстрируемые ритмами пероксиредоксина, теперь наблюдались во многих далеких царствах жизни (эукариоты, бактерии и археи), охватывающих древо эволюции. Таким образом, окислительно-восстановительные часы выглядят как старые часы , а цепи генетической обратной связи являются основными выходными механизмами для управления физиологией и поведением клеток и тканей.
Следовательно, модель часов следует рассматривать как продукт взаимодействия между транскрипционными цепями и нетранскрипционными элементами, такими как окислительно-восстановительные колебания и циклы фосфорилирования белков.
Часы млекопитающих
Избирательный нокдаун генов известных компонентов циркадных часов человека демонстрирует, что как активные компенсаторные механизмы, так и избыточность используются для поддержания функции часов. Каким образом эти самоподдерживающиеся клеточные часы достигают многоклеточной интеграции, в значительной степени неясно, но только астроциты могут управлять молекулярными колебаниями в SCN и циркадным поведением у мышей.
Несколько генов часов млекопитающих были идентифицированы и охарактеризованы в ходе экспериментов на животных, несущих естественные, химически индуцированные и направленные нокаут-мутации, а также с помощью различных сравнительных геномных подходов. Большинство идентифицированных компонентов часов являются активаторами транскрипции или репрессорами, которые модулируют стабильность белка и ядерную транслокацию и создают две взаимосвязанные петли обратной связи. В первичной петле обратной связи члены семейства факторов транскрипции основной спираль-петля-спираль (bHLH) -PAS (Period-Arnt-Single-minded), CLOCK и BMAL1 , гетеродимеризуются в цитоплазме с образованием комплекса, который после транслокации в ядро инициирует транскрипцию генов-мишеней, таких как гены "периода" основных тактовых генов ( PER1 , PER2 и PER3 ) и два гена криптохрома ( CRY1 и CRY2 ). Отрицательная обратная связь достигается за счет гетеродимеров PER: CRY, которые перемещаются обратно в ядро для репрессии собственной транскрипции путем ингибирования активности комплексов CLOCK: BMAL1. Другая регуляторная петля индуцируется, когда гетеродимеры CLOCK: BMAL1 активируют транскрипцию Rev-ErbA и Rora, двух орфанных ядерных рецепторов, связанных с ретиноевой кислотой. REV-ERBa и RORa впоследствии конкурируют за связывание связанных с ретиноевой кислотой элементов ответа орфанных рецепторов (RORE), присутствующих в промоторе Bmal1. Посредством последующего связывания RORE члены ROR и REV-ERB способны регулировать Bmal1 . В то время как ROR активируют транскрипцию Bmal1 , REV-ERB репрессируют тот же процесс транскрипции. Следовательно, циркадные колебания Bmal1 как положительно, так и отрицательно регулируются ROR и REV-ERB.
Часы с насекомыми
У D. melanogaster цикл генов (CYC) является ортологом BMAL1 у млекопитающих. Таким образом, димеры CLOCK – CYC активируют транскрипцию циркадных генов. Ген вневременной жизни (TIM) является ортологом CRY млекопитающих в качестве ингибитора; CRY D. melanogaster вместо этого действует как фоторецептор. У мух CLK – CYC связывается с промоторами генов, регулируемых циркадным ритмом, только во время транскрипции. Также существует стабилизирующая петля, в которой ген vrille (VRI) ингибирует, тогда как PAR-домен-белок-1 (PDP1) активирует транскрипцию Clock.
Грибные часы
У нитчатого гриба N. crassa часовой механизм аналогичен механизму млекопитающих и мух, но не ортологичен.
Заводные часы
Циркадные часы растений состоят из компонентов, совершенно отличных от таковых у животных, грибов или бактерий. У часов растений есть концептуальное сходство с часами животных в том, что они состоят из серии взаимосвязанных петель транскрипционной обратной связи. Гены, участвующие в часах, демонстрируют пиковую экспрессию в фиксированное время суток. Первыми генами, идентифицированными в часах растений, были TOC1 , CCA1 и LHY . Пик экспрессии генов CCA1 и LHY происходит на рассвете, а пик экспрессии гена TOC1 - примерно в сумерках. Белки CCA1 / LHY и TOC1 подавляют экспрессию генов друг друга. В результате, когда уровни белка CCA1 / LHY начинают снижаться после рассвета, он освобождает репрессию гена TOC1, позволяя экспрессии TOC1 и уровням белка TOC1 увеличиваться. По мере увеличения уровня белка TOC1 он дополнительно подавляет экспрессию генов CCA1 и LHY. Противоположность этой последовательности происходит в течение ночи, чтобы восстановить пик экспрессии генов CCA1 и LHY на рассвете. В часы встроено гораздо больше сложности с множественными петлями, включающими гены PRR, Evening Complex и светочувствительные белки GIGANTIA и ZEITLUPE.
Бактериальные часы
В бактериальных циркадных ритмах , колебания фосфорилирования из цианобактерий белки Кай C восстанавливали в бесклеточной системе (AN в пробирке часов) путем инкубации Kaic с KAIA , käib и АТФ .
Посттранскрипционная модификация
Долгое время считалось, что циклы активации / репрессии транскрипции, управляемые регуляторами транскрипции, составляющими циркадные часы, являются основной движущей силой экспрессии циркадных генов у млекопитающих. Однако совсем недавно было сообщено, что только 22% генов циклического обмена матричной РНК управляются транскрипцией de novo. Позже были описаны посттранскрипционные механизмы, управляющие ритмической экспрессией белков, на уровне РНК, такие как динамика полиаденилирования мРНК.
Фустин с соавторами идентифицировали метилирование внутренних аденозинов (m 6 A) внутри мРНК (особенно самих транскриптов часов) как ключевого регулятора циркадного периода. Ингибирование метилирования m 6 A посредством фармакологического ингибирования клеточного метилирования или, более конкретно, посредством siRNA-опосредованного подавления m 6 A метилазы Mettl3, привело к резкому удлинению циркадного периода. Напротив, сверхэкспрессия Mettl3 in vitro приводит к более короткому периоду. Эти наблюдения ясно продемонстрировали важность посттранскрипционной регуляции циркадных часов на уровне РНК и одновременно установили физиологическую роль метилирования (m 6 A) РНК.
Посттрансляционная модификация
Петли авторегуляторной обратной связи в часах занимают около 24 часов для завершения цикла и составляют циркадные молекулярные часы. Это создание ~ 24-часовых молекулярных часов регулируется посттрансляционными модификациями, такими как фосфорилирование , сумоилирование , ацетилирование и метилирование гистонов , а также убиквитинирование . Обратимое фосфорилирование регулирует важные процессы, такие как проникновение в ядро, образование белковых комплексов и деградацию белка. Каждый из этих процессов вносит значительный вклад в поддержание периода на уровне ~ 24 часов и обеспечивает точность циркадных часов, влияя на стабильность вышеупомянутых белков основных часов. Таким образом, в то время как регуляция транскрипции генерирует ритмические уровни РНК, регулируемые посттрансляционные модификации контролируют обилие белков, субклеточную локализацию и репрессорную активность PER и CRY.
Белки , ответственные за пост-трансляционной модификации генов тактовыми включают киназы казеиновые членов семьи ( казеин - киназы 1 дельта (CSNK1D) и казеин - киназы 1 эпсилон (CSNK1E) и F-окно лейцин-богатый повтор белка 3 (fbxl3). У млекопитающих, CSNK1E и CSNK1D являются критическими факторами, которые регулируют оборот основного циркадного белка. Экспериментальные манипуляции с любым из этих белков приводят к драматическим эффектам на циркадные периоды, таким как изменение активности киназ и сокращение циркадных периодов, и дополнительно демонстрируют важность посттрансляционной регуляции в основном механизме циркадных часов. Эти мутации вызывают особый интерес у людей, поскольку они вовлечены в прогрессирующее расстройство фазы сна . Небольшая модификация белка-модификатора, связанного с убиквитином, BMAL1 также была предложена в качестве еще одного уровня посттрансляционного регулирование.
Регулирование циркадных осцилляторов
Циркадные осцилляторы - это просто осцилляторы с периодом приблизительно 24 часа. В ответ на световой раздражитель тело соотносится с системой и сетью путей, которые работают вместе, чтобы определить биологический день и ночь. Регуляторные сети, участвующие в поддержании точного времени на протяжении ряда механизмов посттрансляционной регуляции. Циркадные осцилляторы могут регулироваться фосфорилированием , SUMOилированием, убиквитинированием , а также ацетилированием и деацетилированием гистонов , ковалентной модификацией гистонового хвоста, которая контролирует уровень структур хроматина, вызывающих более легкую экспрессию гена. Метилирование структуры белка добавляет метильную группу и регулирует функцию белка или экспрессию гена, а при метилировании гистонов экспрессия гена либо подавляется, либо активируется путем изменения последовательности ДНК. Гистоны проходят процесс ацетилирования, метилирования и фосфорилирования, но основные структурные и химические изменения происходят, когда ферменты гистонацетилтрансферазы (HAT) и гистондеацетилазы (HDAC) добавляют или удаляют ацетильные группы из гистона, вызывая серьезные изменения в экспрессии ДНК. Изменяя экспрессию ДНК, ацетилирование и метилирование гистонов регулируют работу циркадного осциллятора. Фустин и его сотрудники представили новый уровень сложности регуляции циркадного осциллятора у млекопитающих, показав, что метилирование РНК необходимо для эффективного экспорта зрелой мРНК из ядра: ингибирование метилирования РНК вызывает ядерное удержание транскриптов часового гена, что приводит к к более длительному циркадному периоду.
Ключевой особенностью часов является их способность синхронизироваться с внешними стимулами. Присутствие автономных осцилляторов клеток почти в каждой клетке тела поднимает вопрос о том, как эти осцилляторы координируются во времени. Поиски универсальных временных сигналов для периферийных часов у млекопитающих привели к появлению таких основных сигналов вовлечения, как питание, температура и кислород. Было показано, что и ритмы кормления, и температурные циклы синхронизируют периферические часы и даже отсоединяют их от главных часов в мозгу (например, дневное ограниченное кормление). Недавно было обнаружено, что кислородные ритмы синхронизируют часы в культивируемых клетках.
Подходы системной биологии к выяснению колебательных механизмов
Современные экспериментальные подходы с использованием системной биологии выявили много новых компонентов в биологических часах, которые предлагают комплексный взгляд на то, как организмы поддерживают циркадные колебания.
Недавно Baggs et al. разработал новую стратегию, названную «Сетевой анализ дозировки генов» (GDNA), для описания сетевых функций в циркадных часах человека, которые способствуют устойчивости организма к генетическим нарушениям. В своем исследовании авторы использовали малую интерферирующую РНК (миРНК), чтобы вызвать дозозависимые изменения в экспрессии генов компонентов часов в иммортализованных клетках U2OS остеосаркомы человека, чтобы построить сети ассоциации генов, согласующиеся с известными биохимическими ограничениями в циркадных часах млекопитающих. Использование нескольких доз миРНК привело к их количественной ПЦР, чтобы выявить некоторые сетевые особенности циркадных часов, включая пропорциональные ответы экспрессии генов, распространение сигнала через взаимодействующие модули и компенсацию за счет изменений экспрессии генов.
Пропорциональные ответы в экспрессии нижестоящих генов после siRNA-индуцированного возмущения выявили уровни экспрессии, которые были активно изменены по отношению к подавляемому гену. Например, когда Bmal1 подавлялся дозозависимым образом, уровни мРНК Rev-ErbA альфа и Rev-ErbA бета снижались линейно и пропорционально. Это подтвердило предыдущие данные о том, что Bmal1 непосредственно активирует гены Rev-erb, а также предполагает, что Bmal1 вносит значительный вклад в экспрессию Rev-erb.
Кроме того, метод GDNA предоставил основу для изучения механизмов биологических реле в циркадных сетях, через которые модули сообщают об изменениях в экспрессии генов. Авторы наблюдали распространение сигнала через взаимодействия между активаторами и репрессорами и выявили однонаправленную компенсацию паралогов между несколькими репрессорами часового гена - например, когда истощается PER1 , наблюдается увеличение Rev-erbs, что, в свою очередь, распространяет сигнал на снижение экспрессии в генах. BMAL1 , мишень репрессоров Ревберба.
Изучая нокдаун нескольких репрессоров транскрипции, GDNA также выявила компенсацию паралогов, при которой паралоги генов активируются посредством активного механизма, с помощью которого функция гена замещается после нокдауна без отказа - то есть одного компонента достаточно для поддержания функции. Эти результаты также предполагают, что сеть часов использует активные компенсирующие механизмы, а не простую избыточность для обеспечения устойчивости и поддержания функции. По сути, авторы предположили, что наблюдаемые сетевые особенности действуют согласованно как система генетической буферизации для поддержания функции часов перед лицом генетических и экологических возмущений. Следуя этой логике, мы можем использовать геномику для изучения сетевых особенностей циркадного осциллятора.
Другое исследование, проведенное Zhang et al. также использовали скрининг малой интерферирующей РНК по всему геному в клеточной линии U2OS для идентификации дополнительных тактовых генов и модификаторов с использованием экспрессии репортерного гена люциферазы. Нокдаун почти 1000 генов снизил амплитуду ритма. Авторы обнаружили и подтвердили сотни мощных эффектов на длину периода или увеличение амплитуды вторичных экранов. Характеристика подмножества этих генов продемонстрировала дозозависимый эффект на функцию осциллятора . Сетевой анализ взаимодействия белков показал, что десятки генных продуктов прямо или косвенно связаны с известными компонентами часов. Анализ пути показал, что эти гены чрезмерно представлены в компонентах пути передачи сигналов инсулина и hedgehog , клеточного цикла и метаболизма фолиевой кислоты. В сочетании с данными, демонстрирующими, что многие из этих путей регулируются часами, Zhang et al. постулировал, что часы взаимосвязаны со многими аспектами клеточной функции.
Подход системной биологии может связать циркадные ритмы с клеточными явлениями, которые изначально не считались регуляторами циркадных колебаний. Например, семинар 2014 года в NHLBI оценил новые данные о циркадном геноме и обсудил взаимодействие между биологическими часами и многими различными клеточными процессами.
Изменение циркадных часов
Хотя точные суточные суточные часы есть у многих организмов, они не универсальны. Организмы, живущие в арктических или антарктических районах, не могут наблюдать солнечное время во все времена года, хотя считается, что большинство из них поддерживает циркадный ритм, близкий к 24 часам, например, медведи во время оцепенения. Большая часть биомассы Земли находится в темной биосфере, и хотя эти организмы могут проявлять ритмическую физиологию, для этих организмов доминирующий ритм вряд ли будет циркадным. Для организмов, мигрирующих с востока на запад - и особенно для организмов, которые совершают кругосветное плавание - абсолютная 24-часовая фаза может изменяться в течение месяцев, сезонов или лет.
Некоторые пауки показывают необычно длинные или короткие циркадные часы. У некоторых ткачей мусора , например, есть 18,5-часовые циркадные часы, но они все еще могут перейти в 24-часовой цикл. Эта адаптация может помочь паукам избегать хищников, позволяя им быть наиболее активными до восхода солнца. Часы черных вдов аритмичны, возможно, из-за их предпочтения темноте.