Производство белка - Protein production
Производство белка - это биотехнологический процесс производства определенного белка . Обычно это достигается манипулированием экспрессией гена в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большие количества рекомбинантного гена . Это включает в себя транскрипцию из рекомбинантной ДНК к матричной РНК ( мРНК ), в переводе мРНК в полипептидных цепей, которые в конечном счете , сложенными в функциональные белки и может быть целевых к конкретным субклеточном или внеклеточных местах.
Системы производства белка (на лабораторном жаргоне также называемые «системами экспрессии») используются в науках о жизни , биотехнологии и медицине . В молекулярно-биологических исследованиях используются многочисленные белки и ферменты, многие из которых происходят из систем экспрессии; в частности, ДНК-полимераза для ПЦР , обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования, а также для создания белков, которые проверяются при открытии лекарств в качестве биологических мишеней или самих потенциальных лекарств. Существуют также важные применения систем экспрессии в промышленной ферментации , особенно в производстве биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин, для лечения диабета и производства ферментов .
Системы производства белка
Обычно используемые системы продуцирования белков включают системы, полученные из бактерий , дрожжей , бакуловирусов / насекомых , клеток млекопитающих и, в последнее время, нитчатых грибов, таких как Myceliophthora thermophila . Когда биофармацевтические препараты производятся с использованием одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клетки-хозяина, также попадают в конечный продукт в следовых количествах.
Системы на основе ячеек
Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как « комбинация вектора экспрессии , его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которые обеспечивают контекст, позволяющий чужеродному гену функционировать в клетке-хозяине, который то есть производить белки на высоком уровне ». Сверхэкспрессия - это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии гена, который приводит к выраженному фенотипу, связанному с генами .
Есть много способов ввести чужеродную ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество разных клеток-хозяев - каждая система экспрессии имеет определенные преимущества и недостатки. На системы экспрессии обычно ссылаются хозяин и источник ДНК или механизм доставки генетического материала. Например, обычными хозяевами являются бактерии (такие как E.coli , B. subtilis ), дрожжи (такие как S.cerevisiae ) или линии эукариотических клеток . Обычными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (например, бакуловирус , ретровирус , аденовирус ), плазмиды , искусственные хромосомы и бактериофаги (например, лямбда ). Наилучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто предпочтительнее для белков, требующих значительной посттрансляционной модификации . Линии клеток насекомых или млекопитающих используются, когда требуется сплайсинг мРНК, подобный человеку. Тем не менее, бактериальная экспрессия имеет то преимущество, что легко продуцирует большие количества белка, который требуется для рентгеновской кристаллографии или экспериментов с ядерным магнитным резонансом для определения структуры.
Поскольку бактерии являются прокариотами , они не оснащены полным ферментативным механизмом для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного фолдинга. Следовательно, мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые трудно восстановить без резких денатурирующих агентов и последующего обременительного рефолдинга белка.
Для решения этих проблем были разработаны системы экспрессии с использованием нескольких эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки соответствовали эукариотическим организмам или были ближе к ним: клетки растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота) трансфицировали генами и культивируют в суспензии и даже в виде тканей или целых организмов для получения полностью свернутых белков. Однако системы экспрессии млекопитающих in vivo имеют низкий выход и другие ограничения (трудоемкость, токсичность для клеток-хозяев и т. Д.). Чтобы объединить высокую урожайность / продуктивность и масштабируемые белковые характеристики бактерий и дрожжей, а также продвинутые эпигенетические особенности систем растений, насекомых и млекопитающих, были разработаны другие системы производства белка с использованием одноклеточных эукариот (т.е. непатогенных клеток Leishmania ).
Бактериальные системы
кишечная палочка
E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев для экспрессии, и ДНК обычно вводят ввектор экспрессии плазмиды . Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения количества копий гена или увеличения силы связывания промоторной области, что способствует транскрипции.
Например, последовательность ДНК представляющего интерес белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с большим числом копий, содержащую промотор lac (часто LacUV5 ), которая затем трансформируется в бактерию E. coli . Добавление IPTG ( аналог лактозы ) активирует промотор lac и заставляет бактерии экспрессировать интересующий белок.
Штаммы E. coli BL21 и BL21 (DE3) - это два штамма, обычно используемые для производства белка. Как представители линии B, они лишены протеаз lon и OmpT , защищающих продуцируемые белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21 (DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет использовать вместо этого векторы с промотором T7.
Коринебактерии
Непатогенные виды грамположительных коринебактерий используются для коммерческого производства различных аминокислот. В С.glutamicum , вид широко используется для производства глутамата и лизина , компоненты человеческой пищи, корма для животных и фармацевтических продуктов.
Экспрессия функционально активного эпидермального фактора роста человека была проведена в C. glutamicum , что продемонстрировало потенциал промышленного производства белков человека. Экспрессированные белки могут быть нацелены на секрецию либо через общий секреторный путь (Sec), либо через путь транслокации двойного аргинина (Tat).
В отличие от грамотрицательных бактерий , у грамположительных Corynebacterium отсутствуют липополисахариды, которые действуют как антигенные эндотоксины у людей.
Pseudomonas fluorescens
Непатогенные и грамотрицательные бактерии, Pseudomonas fluorescens , используются для производства рекомбинантных белков на высоком уровне; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens - это метаболически разносторонний организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быстрое развитие сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно производить высокие титры активного растворимого белка.
Эукариотические системы
Дрожжи
Системы экспрессии с использованием либо S. cerevisiae, либо Pichia pastoris обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих с высоким выходом в белковых средах с определенным химическим составом.
Нитчатые грибы
Нитчатые грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma , а также в последнее время Myceliophthora thermophila C1, были разработаны в качестве платформ экспрессии для скрининга и производства различных промышленных ферментов . Система экспрессии C1 демонстрирует морфологию низкой вязкости в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды для выращивания и продуцирования.
Бакуловирус -infected клетки
Бакуловирусом -infected клеток насекомых ( Sf9 , SF21 , High Five штаммов) или клетки млекопитающих ( HeLa , HEK 293 ) позволяют производить гликозилированных или мембранных белков , которые не могут быть получены с помощью грибковой или бактериальной системы. Это полезно для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются постоянно, потому что инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизируются и умирают во время каждого цикла заражения.
Нелитическая экспрессия клеток насекомых
Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической системе экспрессии бакуловируса. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируются в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. Затем следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. Нелитическая система была использована для получения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией инфицированных бакуловирусом клеток. Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9 , Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda , Hi-5 из клеток Trichoplusia ni , а также клетки Schneider 2 и Schneider 3 из клеток Drosophila melanogaster . В этой системе клетки не лизируются, и можно использовать несколько режимов культивирования. Кроме того, можно воспроизводить циклы производства белка. Эта система дает однородный продукт. Недостатком этой системы является необходимость дополнительной стадии скрининга для отбора жизнеспособных клонов .
Экскавата
Системы экспрессии Leishmania tarentolae (не могут инфицировать млекопитающих) обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков с высоким выходом в химически определенных средах. Полученные белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидной связи.
Системы млекопитающих
Наиболее распространенными системами экспрессии у млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки эмбриональной почки человека (НЕК).
- Клетка яичника китайского хомячка
- Мышь миелома lymphoblstoid (например NS0 клеток)
- Полностью человек
Бесклеточные системы
Бесклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены экстракцией из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низких уровней экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем более широко используются клеточные системы.
Смотрите также
- Целлозавр , база данных клеточных линий
- Экспрессия гена
- Одноклеточный белок
- Очистка белков
- Прецизионное брожение
- Белок клетки-хозяина
- Список рекомбинантных белков
Рекомендации
дальнейшее чтение
- Хиггинс С.Дж., Хеймс Б.Д. (1999). Экспрессия белка: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963623-5.
- Банейкс, Франсуа (2004). Технологии экспрессии белков: текущее состояние и будущие тенденции . Наука о гирляндах. ISBN 978-0-9545232-5-1.
Внешние ссылки
|
Ресурсы библиотеки о производстве протеина |