Центрифугирование - Centrifugation

Центрифугирование - это механический процесс, который включает использование центробежной силы для отделения частиц от раствора в соответствии с их размером, формой, плотностью, средней вязкостью и скоростью ротора. Более плотные компоненты смеси перемещаются от оси центрифуги , в то время как менее плотные компоненты смеси перемещаются к оси. Химики и биологи могут увеличить эффективную гравитационную силу пробирки, чтобы осадок (осадок) быстро и полностью переместился на дно пробирки. Оставшаяся жидкость, которая находится над осадком, называется супернатантом или супернатантом.

Существует корреляция между размером и плотностью частицы и скоростью, с которой частица отделяется от гетерогенной смеси, когда единственная прилагаемая сила - это сила тяжести. Чем больше размер и больше плотность частиц, тем быстрее они отделяются от смеси. Прикладывая к смеси большую эффективную гравитационную силу, как в центрифуге, разделение частиц ускоряется. Это идеально для промышленных и лабораторных условий, поскольку частицы, которые отделяются естественным образом в течение длительного периода времени, могут быть отделены за гораздо меньшее время.

Скорость центрифугирования определяется угловой скоростью, обычно выражаемой в оборотах в минуту (об / мин), или ускорением, выраженным в g . Коэффициент преобразования между числом оборотов в минуту и g зависит от радиуса ротора центрифуги . Скорость осаждения частиц при центрифугировании зависит от их размера и формы, центробежного ускорения, объемной доли присутствующих твердых веществ, разницы плотностей между частицей и жидкостью и вязкости . Наиболее распространенное применение - отделение твердых частиц от высококонцентрированных суспензий, которое используется при очистке осадка сточных вод для обезвоживания, где образуется менее плотный осадок.

Метод центрифугирования имеет широкий спектр промышленных и лабораторных применений; Этот процесс используется не только для разделения двух смешивающихся веществ, но и для анализа гидродинамических свойств макромолекул. Это один из наиболее важных и часто используемых методов исследования в биохимии , клеточной и молекулярной биологии . В химической и пищевой промышленности специальные центрифуги могут обрабатывать непрерывный поток жидкости, содержащей частицы. Центрифугирование - также наиболее распространенный метод, используемый для обогащения урана , основанный на небольшой разнице масс между атомами U-238 и U-235 в газообразном гексафториде урана .

Математическая формула

В жидкой суспензии многие частицы или клетки будут постепенно падать на дно емкости под действием силы тяжести ; однако время, необходимое для такого разделения, невозможно. Другие очень мелкие частицы невозможно изолировать в растворе до тех пор, пока на них не будет воздействовать высокая центробежная сила . Поскольку суспензия вращается с определенной скоростью или оборотами в минуту (об / мин), центробежная сила позволяет частицам перемещаться радиально от оси вращения. Общая формула для расчета числа оборотов центрифуги в минуту (RPM):

${\ displaystyle RPM = {\ sqrt {g \ over r}}}$,

где g представляет собой соответствующую силу центрифуги, а r - радиус от центра ротора до точки в образце.

Однако, в зависимости от используемой модели центрифуги, соответствующий угол ротора и радиус могут изменяться, поэтому формула изменяется. Например, ротор Sorvall # SS-34 имеет максимальный радиус 10,8 см, поэтому формула принимает вид , который можно упростить до . ${\ textstyle RPM = 299 {\ sqrt {g \ over r}}}$${\ textstyle RPM = 91 {\ sqrt {g}}}$

По сравнению с гравитацией сила частицы называется «относительной центробежной силой» (RCF). Это перпендикулярная сила, действующая на содержимое ротора в результате вращения, всегда относительно силы тяжести земли, которая измеряет прочность роторов различных типов и размеров. Например, RCF 1000 xg означает, что центробежная сила в 1000 раз сильнее земной гравитационной силы. RCF зависит от скорости вращения в об / мин и расстояния частиц от центра вращения. Наиболее распространенная формула, используемая для расчета RCF:

${\ displaystyle RCF = 1,118 \ times 10 ^ {- 5} \ times r \ times (об / мин) ^ {2}}$,

где - постоянная; r - радиус, выраженный в сантиметрах , между осью вращения и центром; а об / мин - это скорость в оборотах в минуту. ${\ textstyle 1.118 \ times 10 ^ {- 5}}$

Исторически сложилось так, что многие разделения проводились при скорости 3000 об / мин; приблизительное определение силы g, действующей на этой скорости, состоит в том, чтобы умножить радиус центрифугирования в 10 раз, поэтому радиус 160 мм дает приблизительно 1600 x g. Это довольно произвольный подход, поскольку применяемая относительная центробежная сила линейно зависит от радиуса, поэтому увеличение радиуса на 10% означает, что относительная центробежная сила на 10% выше при той же скорости. Грубо говоря, приведенную выше формулу можно упростить с погрешностью всего 0,62%. ${\ textstyle RCF = 10 \ раз r}$

Центрифугирование в биологических исследованиях

Микроцентрифуги

Микроцентрифуги - это специально разработанные настольные модели с легкими роторами небольшого объема, способными очень быстро разгоняться до примерно 17 000 об / мин. Это легкие устройства, которые в основном используются для кратковременного центрифугирования образцов объемом примерно 0,2–2,0 мл. Однако из-за своего небольшого размера они легко транспортируются и при необходимости могут работать в холодном помещении. Они могут быть охлаждены или нет. Микроцентрифуга обычно используется в исследовательских лабораториях, где небольшие образцы биологических молекул, клеток или ядер должны подвергаться воздействию высокой RCF в течение относительно коротких интервалов времени. Микроцентрифуги, предназначенные для работы с высокой скоростью, могут достигать 35000 об / мин, давая относительную скорость вращения до 30000 × g, и называются высокоскоростными микроцентрифугами.

Центрифуги низкоскоростные

Низкоскоростные центрифуги используются для сбора химических осадков, интактных клеток (животных, растений и некоторых микроорганизмов), ядер, хлоропластов, крупных митохондрий и более крупных фрагментов плазматической мембраны. В этих центрифугах также используются градиенты плотности для очистки клеток. Роторы с качающимся ковшом, как правило, используются очень широко из-за огромной гибкости размера образца за счет использования адаптеров. Эти машины имеют максимальную скорость вращения ротора менее 10 000 об / мин и варьируются от небольших настольных до больших напольных центрифуг.

Центрифуги высокоскоростные

Высокоскоростные центрифуги обычно используются для сбора микроорганизмов, вирусов , митохондрий , лизосом , пероксисом и интактных трубчатых мембран Гольджи. Большинство простых задач гранулирования выполняется с помощью роторов с фиксированным углом. Некоторая работа с градиентом плотности для очистки клеток и органелл может быть выполнена в роторах с качающимся ведром или, в случае градиентов Перколла, в роторах с фиксированным углом. Высокоскоростные или сверхскоростные центрифуги могут обрабатывать большие объемы проб, от нескольких десятков миллилитров до нескольких литров. Кроме того, более крупные центрифуги также могут достигать более высоких угловых скоростей (около 30 000 об / мин). Роторы могут поставляться с различными адаптерами для размещения пробирок , бутылок или микротитровальных планшетов разного размера .

Ультрацентрифугирование

Ультрацентрифугирование использует высокую центробежную силу для изучения свойств биологических частиц на исключительно высоких скоростях. Современные ультрацентрифуги могут вращаться со скоростью до 150 000 об / мин (что эквивалентно 1 000 000 xg). Они используются для сбора всех мембранных везикул, происходящих из плазматической мембраны, эндоплазматического ретикулума (ER) и мембраны Гольджи , эндосом , рибосом , рибосомных субъединиц, плазмид , ДНК , РНК и белков в роторах с фиксированным углом. По сравнению с микроцентрифугами или высокоскоростными центрифугами, ультрацентрифуги могут выделять гораздо более мелкие частицы и, кроме того, в то время как микроцентрифуги и суперцентрифуги разделяют частицы партиями (ограниченные объемы образцов необходимо обрабатывать вручную в пробирках или бутылках), ультрацентрифуги могут разделять молекулы партиями или партиями. системы с непрерывным потоком.

Ультрацентрифугирование используется для разделения макромолекул / кинетических исследований связывания лиганда, отделения различных фракций липопротеинов из плазмы и депротонизации физиологических жидкостей для анализа аминокислот.

Это наиболее часто используемые центрифуги для очистки всех частиц, кроме клеток с градиентом плотности, и хотя для этой цели традиционно использовались качающиеся бакеты, также используются роторы с фиксированным углом и вертикальные роторы, особенно для самогенерируемых градиентов и могут значительно повысить эффективность разделения. Есть два типа ультрацентрифуг: аналитические и препаративные.

Аналитическое ультрацентрифугирование

Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) можно использовать для определения свойств макромолекул, таких как форма, масса, состав и конформация. Это широко используемый метод биомолекулярного анализа, используемый для оценки чистоты образца, для характеристики механизмов сборки и разборки биомолекулярных комплексов , для определения стехиометрии субъединиц , для идентификации и характеристики макромолекулярных конформационных изменений, а также для расчета констант равновесия и термодинамических параметров для самоассоциации и гетероассоциированные системы. Аналитические ультрацентрифуги включают в себя сканирующую оптическую систему на основе видимого / ультрафиолетового света для мониторинга в реальном времени движения образца во время вращения.

Образцы центрифугируются в растворе высокой плотности, таком как сахароза , хлорид цезия или йодиксанол . Раствор высокой плотности может иметь одинаковую концентрацию по всей пробирке («подушка») или переменную концентрацию (« градиент »). Молекулярные свойства могут быть смоделированы с помощью седиментации анализа скорости или седиментационного равновесия анализа. Во время эксперимента частица или молекулы будут перемещаться через пробирку с разной скоростью в зависимости от их физических свойств и свойств раствора и в конечном итоге образуют гранулы на дне пробирки или полосы на разной высоте.

Препаративное ультрацентрифугирование

Препаративные ультрацентрифуги часто используются для разделения частиц в соответствии с их плотностью, выделения и / или сбора более плотных частиц для сбора в осадок и осветления суспензий, содержащих частицы. Иногда исследователи также используют препаративные ультрацентрифуги, если им нужна гибкость для изменения типа ротора в приборе. Препаративные ультрацентрифуги могут быть оснащены широким спектром различных типов ротора, которые могут вращать образцы разного количества, под разными углами и с разной скоростью.

Процесс фракционирования

В биологических исследованиях фракционирование клеток обычно включает выделение клеточных компонентов при сохранении индивидуальных ролей каждого компонента. Обычно образец клеток хранится в суспензии, которая:

• Буферизованный - нейтральный pH, предотвращающий повреждение структуры белков, включая ферменты (которые могут повлиять на ионные связи)
• Изотонический (с равным водным потенциалом) - предотвращает накопление или потерю воды органеллами.
• Прохладный - снижение общей активности фермента, высвобождаемого позже во время процедуры

Центрифугирование - это первый шаг в большинстве случаев фракционирования . Посредством низкоскоростного центрифугирования остатки клеток можно удалить, оставив супернатант, сохраняющий содержимое клетки. Повторное центрифугирование на все более высоких скоростях будет фракционировать гомогенаты клеток на их компоненты. Как правило, чем меньше субклеточный компонент, тем больше центробежная сила, необходимая для его осаждения. Растворимая фракция любого лизата затем может быть далее разделена на составляющие с использованием различных методов.

Дифференциальное центрифугирование

Дифференциальное центрифугирование - это простейший метод фракционирования путем центрифугирования, обычно используемый для разделения органелл и мембран, обнаруженных в клетках. Органеллы обычно отличаются друг от друга плотностью и размером, что делает возможным использование дифференциального центрифугирования и центрифугирования в целом. Затем органеллы можно идентифицировать путем тестирования индикаторов, уникальных для конкретных органелл. Чаще всего этот метод используется для получения неочищенных субклеточных фракций из гомогената ткани, например из печени крысы. Частицы разной плотности или размера в суспензии осаждаются с разной скоростью, при этом более крупные и плотные частицы осаждаются быстрее. Эти скорости осаждения могут быть увеличены за счет использования центробежной силы.

Суспензию клеток подвергают серии циклов возрастающей центробежной силы для получения серии гранул, содержащих клетки со снижающейся скоростью оседания. Гомогенат включает ядра, митохондрии, лизосомы, пероксисомы, листы плазматической мембраны и широкий спектр везикул, происходящих из ряда внутриклеточных мембранных компартментов, а также из плазматической мембраны, обычно в буферной среде.

Центрифугирование в градиенте плотности

Центрифугирование в градиенте плотности, как известно, является одним из наиболее эффективных методов разделения взвешенных частиц и используется как метод разделения, так и метод измерения плотности частиц или молекул в смеси.

Он используется для разделения частиц по размеру, форме и плотности с использованием среды с изменяемой плотностью. Во время относительно короткого или медленного центрифугирования частицы разделяются по размеру, при этом более крупные частицы осаждаются дальше, чем более мелкие. При длительном или быстром центрифугировании частицы перемещаются в места в градиенте, где плотность среды такая же, как и плотность частиц; (ρp - ρm) → 0. Следовательно, небольшая плотная частица изначально осаждается с меньшей легкостью, чем большая частица с низкой плотностью. Крупные частицы рано достигают своего положения равновесной плотности, в то время как мелкие частицы медленно мигрируют через зону крупных частиц и в конечном итоге занимают положение равновесия глубже в градиенте.

Пробирка после центрифугирования этим методом содержит частицы в порядке их плотности в зависимости от высоты. Интересующий объект или частица будет находиться в месте внутри трубки, соответствующем его плотности. Тем не менее, при использовании этого метода все же возможны некоторые неидеальные отложения. Первая потенциальная проблема - это нежелательная агрегация частиц, но это может произойти при любом центрифугировании. Вторая возможность возникает, когда капли раствора, содержащие частицы, осаждаются. Это более вероятно при работе с раствором, который имеет слой суспензии, плавающий на плотной жидкости, которая на самом деле имеет небольшой градиент плотности или его отсутствие.

Другие приложения

Центрифуга может использоваться для отделения небольших количеств твердых частиц, удерживаемых в суспензии, от жидкостей, например, при отделении порошка мела от воды. В биологических исследованиях его можно использовать для очистки клеток млекопитающих, фракционирования субклеточных органелл, фракционирования мембранных везикул, фракционирования макромолекул и макромолекулярных комплексов и т. Д. Центрифугирование используется многими различными способами в пищевой промышленности . Например, в молочной промышленности он обычно используется при осветлении и обезжиривании молока , экстракции сливок, производстве и извлечении казеина , производстве сыра , удалении бактериальных загрязнителей и т. Д. Этот метод обработки также используется при производстве напитков. , соки, кофе, чай, пиво, вино , соевое молоко , переработка / восстановление масел и жиров, какао-масло , производство сахара и т. д. Он также используется для осветления и стабилизации вина .

В криминалистических и исследовательских лабораториях его можно использовать для разделения компонентов мочи и крови . Он также помогает в разделении белков с использованием таких методов очистки, как высаливание , например осаждение сульфатом аммония. Центрифугирование также является важным методом обработки отходов , являясь одним из наиболее распространенных процессов, используемых для обезвоживания осадка . Этот процесс также играет роль в циклонной сепарации , когда частицы отделяются от воздушного потока без использования фильтров . В циклонном коллекторе воздух движется по спирали. Частицы с высокой инерцией разделяются центробежной силой, в то время как более мелкие частицы продолжают движение с воздушным потоком.

Центрифуги также в небольшой степени использовались для выделения соединений легче воды, таких как масло. В таких ситуациях водный сток получается на противоположном выходе, из которого твердые частицы с удельным весом больше единицы являются целевыми веществами для отделения.

История

К 1923 году Теодор Сведберг и его ученик Х. Ринде успешно проанализировали крупнозернистые золи с точки зрения их гравитационного осаждения. Золи состоят из вещества, равномерно распределенного в другом веществе, также известном как коллоид . Однако более мелкозернистые золи, например, содержащие золото, не могли быть проанализированы. Чтобы исследовать эту проблему, Сведберг разработал аналитическую центрифугу, оснащенную фотографической абсорбционной системой, которая будет оказывать гораздо больший центробежный эффект. Кроме того, он разработал теорию, необходимую для измерения молекулярной массы. За это время внимание Сведберга переключилось с золота на белки.

К 1900 году было общепризнано, что белки состоят из аминокислот; однако вопрос о том, являются ли белки коллоидами или макромолекулами, все еще остается открытым. В то время исследовали один белок - гемоглобин . Было установлено, что он содержит 712 атомов углерода, 1130 атомов водорода, 243 атома кислорода, два атома серы и, по крайней мере, один атом железа. Это дало гемоглобину результирующий вес примерно 16000 дальтон (Да), но было неясно, кратно ли это значение одному или четырем (в зависимости от количества присутствующих атомов железа).

В ходе серии экспериментов с использованием метода седиментационного равновесия были сделаны два важных наблюдения: гемоглобин имеет молекулярную массу 68000 Да, что позволяет предположить, что присутствуют четыре атома железа, а не один, и что независимо от того, откуда был выделен гемоглобин, он имели точно такую ​​же молекулярную массу. То, как что-то с такой большой молекулярной массой могло быть последовательно обнаружено, независимо от того, где это было взято в организме, было беспрецедентным и способствовало идее, что белки являются макромолекулами, а не коллоидами. Чтобы исследовать это явление, была необходима центрифуга с еще более высокими скоростями, и поэтому была создана ультрацентрифуга для применения теории седиментации-диффузии. Была определена та же молекулярная масса, и наличие границы растекания позволило предположить, что это была единственная компактная частица. Дальнейшее применение центрифугирования показало, что в различных условиях крупные однородные частицы могут быть разбиты на дискретные субъединицы. Развитие центрифугирования было большим прорывом в экспериментальной науке о белках.

Линдерсторм-Ланг в 1937 году обнаружил, что трубки градиента плотности могут использоваться для измерения плотности. Он обнаружил это при работе с вирусом желтого карлика картофеля. Этот метод также использовался в знаменитом эксперименте Мезельсона и Шталя, в котором они доказали, что репликация ДНК полуконсервативна с использованием различных изотопов азота. Они использовали центрифугирование в градиенте плотности, чтобы определить, какой изотоп или изотопы азота присутствовали в ДНК после циклов репликации.

Смотрите также

• Центрифуга

использованная литература

Источники