Противомикробные пептиды - Antimicrobial peptides

Различные структуры антимикробных пептидов

Противомикробные пептиды ( AMP ), также называемые пептидами защиты хозяина ( HDP ), являются частью врожденного иммунного ответа, обнаруживаемого у всех классов жизни. Между прокариотическими и эукариотическими клетками существуют фундаментальные различия, которые могут представлять собой мишени для антимикробных пептидов . Эти пептиды являются мощными антибиотиками широкого спектра действия, которые демонстрируют потенциал в качестве новых терапевтических агентов. Было продемонстрировано, что противомикробные пептиды убивают грамотрицательные и грамположительные бактерии, оболочечные вирусы, грибы и даже трансформированные или раковые клетки. В отличие от большинства обычных антибиотиков оказывается, что антимикробные пептиды часто дестабилизируют биологические мембраны , могут образовывать трансмембранные каналы , а также могут обладать способностью повышать иммунитет, действуя как иммуномодуляторы .

Состав

Противомикробные пептиды животных, растений и грибов, организованные по содержанию их вторичной структуры. Размер кружка указывает общую молекулярную массу каждого пептида.

Противомикробные пептиды представляют собой уникальную и разнообразную группу молекул, которые делятся на подгруппы на основе их аминокислотного состава и структуры. Антимикробные пептиды обычно содержат от 12 до 50 аминокислот. Эти пептиды включают два или более положительно заряженных остатка, обеспечиваемых аргинином , лизином или, в кислой среде, гистидином , и большую часть (обычно> 50%) гидрофобных остатков. Вторичные структуры этих молекул следуют 4 темам, включая i) α-спираль , ii) β-цепочку из-за наличия 2 или более дисульфидных связей , iii) β-шпильку или петлю из-за наличия одной дисульфидной связи и / или циклизация пептидной цепи, и iv) удлиненная. Многие из этих пептидов не имеют структуры в свободном растворе и образуют свою окончательную конфигурацию при разделении на биологические мембраны. Он содержит гидрофильные аминокислотные остатки, выровненные вдоль одной стороны, и гидрофобные аминокислотные остатки, выровненные вдоль противоположной стороны спиральной молекулы. Эта амфипатичность антимикробных пептидов позволяет им разделяться на липидный бислой мембраны. Способность связываться с мембранами является определяющей характеристикой антимикробных пептидов, хотя в пермеабилизации мембраны нет необходимости. Эти пептиды обладают разнообразной антимикробной активностью, от мембранной проницаемости до действия на ряд цитоплазматических мишеней.

Тип характерная черта AMP
Анионные пептиды богат глутаминовой и аспарагиновой кислотами Максимин H5 от земноводных, Дермицидин от человека
Линейные катионные α-спиральные пептиды недостаток цистеина Цекропины , андропин, морицин , цератотоксин и мелиттин от насекомых, магайнин , дермасептин , бомбинин, бревинин-1, эскулентины и буфорин II от земноводных, CAP18 от кроликов, LL37 от человека
Катионный пептид, обогащенный определенной аминокислотой богат пролином, аргинином, фенилаланином, глицином, триптофаном абаецин и дрозоцин , апидецин, диптерицин и аттацин насекомых, пропенин свиней, индолицидин крупного рогатого скота.
Анионные / катионные пептиды, образующие дисульфидные связи содержат 1 ~ 3 дисульфидной связи

мероприятия

Механизмы действия антимикробных пептидов

Способы действия, с помощью которых антимикробные пептиды убивают микробы, различны и могут отличаться для разных видов бактерий. Некоторые антимикробные пептиды убивают как бактерии, так и грибки, например, псориазин убивает кишечную палочку и несколько мицелиальных грибов. Цитоплазматическая мембрана является частой мишенью, но пептиды могут также мешать ДНК и синтез белка , сворачивания белка, и синтез клеточных стенок. Первоначальный контакт между пептидом и организмом-мишенью является электростатическим, поскольку большинство бактериальных поверхностей являются анионными или гидрофобными, как, например, в антимикробном пептиде Писцидин. Их аминокислотный состав, амфипатичность, катионный заряд и размер позволяют им прикрепляться к бислоям мембраны и вставляться в них с образованием пор с помощью механизмов «бочка-стержень», «ковер» или «тороидальные поры». С другой стороны, они могут проникать в клетку, чтобы связывать внутриклеточные молекулы, которые имеют решающее значение для жизни клетки. Модели внутриклеточного связывания включают ингибирование синтеза клеточной стенки, изменение цитоплазматической мембраны, активацию автолизина, ингибирование синтеза ДНК, РНК и белка, а также ингибирование определенных ферментов. Однако во многих случаях точный механизм убийства неизвестен. Одним из новых методов исследования таких механизмов является интерферометрия с двойной поляризацией . В отличие от многих обычных антибиотиков эти пептиды, по-видимому, обладают бактерицидным действием, а не бактериостатическим . Обычно антимикробную активность этих пептидов определяют путем измерения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), которая представляет собой самую низкую концентрацию лекарственного средства, подавляющего рост бактерий.

AMP могут обладать множественной активностью, включая антиграмположительные бактериальные, антиграмотрицательные бактериальные, противогрибковые, противовирусные, антипаразитарные и противораковые. Большой функциональный анализ AMP показывает, что среди всех активностей AMP, амфипатичности и заряда, два основных свойства AMP лучше всего различают AMP с антиграмм-отрицательной бактериальной активностью и без нее. Это означает, что наличие AMP с антиграмотрицательной бактериальной активностью может предпочесть или даже потребовать сильную амфипатичность и чистый положительный заряд.

Иммуномодуляция

В дополнение к непосредственному уничтожению бактерий, они, как было продемонстрировано, обладают рядом иммуномодулирующих функций, которые могут быть задействованы в устранении инфекции, включая способность изменять экспрессию гена хозяина, действовать как хемокины и / или индуцировать продукцию хемокинов , ингибируя индуцированную липополисахаридом про -продуцирование воспалительных цитокинов , способствующих заживлению ран и модулирование ответов дендритных клеток и клеток адаптивного иммунного ответа. Модели на животных показывают, что пептиды защиты хозяина имеют решающее значение как для предотвращения, так и для избавления от инфекции. Похоже, что многие пептиды, первоначально выделенные и названные «антимикробными пептидами», обладают более значительными альтернативными функциями in vivo (например, гепсидин). Дускетид, например, представляет собой иммуномодулятор, который действует через p62, белок, участвующий в передаче сигналов инфекции на основе толл-подобных рецепторов. Пептид изучается в клинических испытаниях фазы III Soligenix (SGNX), чтобы установить, может ли он помочь в восстановлении радиационно-индуцированных повреждений слизистой оболочки полости рта, возникающих во время лучевой терапии рака головы и шеи.

Механизмы действия

Сканирующие электронные микроскопические изображения (увеличение 50 000X), демонстрирующие действие экспериментального антимикробного пептида (NN2_0050) на клеточную мембрану E. coli (K12 MG1655) [1] ВВЕРХУ: неповрежденные клеточные мембраны в контрольной группе. НИЖЕ: повреждение клеточных мембран и утечка бактериальной хромосомы (зеленый) в группе лечения.

Противомикробные пептиды обычно имеют чистый положительный заряд, что позволяет им взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами, экспонированными на поверхности бактерий и раковых клеток, такими как фосфолипид фосфатидилсерин, O-гликозилированные муцины, сиалилированные ганглиозиды и сульфаты гепарина. Механизм действия этих белков широко варьируется, но его можно разделить на две категории: мембранолитические и немембранолитические антимикробные пептиды. Нарушение мембран мембранолитическими антимикробными пептидами можно описать четырьмя моделями:

  • тороидальная модель
  • неупорядоченная модель тороидальных пор
  • модель ковра
  • бочонок модель клепки

Хотя особенности каждого механизма различаются, все они предполагают вызванный пептидом разрыв мембраны, что приводит к утечке цитоплазмы, что в конечном итоге приводит к смерти.

Недавняя работа нарисовала более сложную картину активности антимикробных пептидов. Немембранолитические антимикробные пептиды могут также действовать как метаболические ингибиторы, напрямую взаимодействуя с ДНК, РНК, синтезом белка и ингибиторами синтеза клеточной стенки или образования перегородки. Также известно, что они вызывают агрегацию рибосом и делокализуют мембранные белки.

Еще больше усложняет ситуацию то, что многие природные антимикробные пептиды обладают слабой бактерицидной активностью. Теперь известно, что вместо прямого подавления роста бактерий они действуют согласованно с иммунной системой хозяина через механизмы, включая индукцию хемокинов, высвобождение гистамина и модуляцию ангиогенеза. На эти иммуномодулирующие эффекты только недавно начали обращать внимание.

Несколько методов были использованы для определения механизмов антимикробной пептидной активности. В частности, исследования твердотельного ЯМР предоставили объяснение разрушения мембраны антимикробными пептидами с разрешением на атомном уровне. В последние годы рентгеновская кристаллография использовалась для детального описания того, как семейство растительных дефенсинов разрывает мембраны, путем идентификации ключевых фосфолипидов в клеточных мембранах патогена. Считается, что человеческие дефенсины действуют посредством аналогичного механизма, воздействуя на липиды клеточных мембран как часть своей функции. Фактически, человеческий бета-дефенсин 2 убивает патогенные грибы Candida albicans посредством взаимодействия со специфическими фосфолипидами. С вычислительной точки зрения, моделирование молекулярной динамики может пролить свет на молекулярный механизм и специфические взаимодействия пептидов с липидами, ионами и растворителем.

Методы Приложения
Микроскопия для визуализации воздействия антимикробных пептидов на микробные клетки
Атомно-эмиссионная спектроскопия для обнаружения потери внутриклеточного калия (признак нарушения целостности бактериальной мембраны)
Флуоресцентные красители для измерения способности антимикробных пептидов повышать проницаемость мембранных везикул
Формирование ионного канала для оценки образования и стабильности поры, индуцированной антимикробным пептидом
Круговой дихроизм и ориентированный круговой дихроизм для измерения ориентации и вторичной структуры антимикробного пептида, связанного с липидным бислоем
Двойная поляризационная интерферометрия для измерения различных механизмов действия антимикробных пептидов
Спектроскопия твердотельного ЯМР для измерения вторичной структуры, ориентации и проникновения антимикробных пептидов в липидные бислои в биологически релевантном жидкокристаллическом состоянии
Дифракция нейтронов и рентгеновских лучей для измерения дифрактограмм пор, индуцированных пептидами, внутри мембран в ориентированных многослойных слоях или жидкостях
Моделирование молекулярной динамики для изучения молекулярного поведения и поиска специфических пептидно-липидных взаимодействий
Масс-спектрометрии для измерения протеомного ответа микроорганизмов на антимикробные пептиды


Терапевтические исследования и использование

Противомикробные пептиды использовались в качестве терапевтических агентов; их использование обычно ограничивается внутривенным введением или местным применением из-за их короткого периода полураспада. По состоянию на январь 2018 г. в клинической практике применялись следующие антимикробные пептиды:

Активность, выходящая за рамки антибактериальных функций

Было обнаружено, что AMP выполняют функции, отличные от уничтожения бактерий и грибков. Эти действия включают противовирусные эффекты, а также роль в защите хозяина, такую ​​как противораковые функции и роль в неврологии. Это привело к движению за ребрендинг AMP как «пептидов защиты хоста», чтобы охватить широкий спектр действий, которые могут иметь AMP.

Противораковые свойства

Некоторые цекропины (например, цекропин A и цекропин B) обладают противораковыми свойствами и называются противораковыми пептидами (ACP). Гибридные ACP на основе цекропина A были изучены на предмет противораковых свойств. Дефенсин плодовой мушки предотвращает рост опухоли, который, как предполагается, связывается с опухолевыми клетками из-за модификаций клеточных мембран, типичных для большинства раковых клеток, таких как воздействие фосфатидилсерина .

Свойства антибиотикопленки

Цекропина А может уничтожить планктонную и сидячую биопленку образующую уропатогенной кишечная палочка (УПЭК) клетку, либо отдельно , либо в сочетании с антибиотиками налидиксовой кислотой , синергически очистками инфекции в естественных условиях (в насекомых - хозяин большой восковой моль ) без выключения-мишени цитотоксичности. Мультицелевой механизм действия включает в себя проницаемость внешней мембраны с последующим разрушением биопленки, вызванным ингибированием активности эффлюксного насоса и взаимодействием с внеклеточными и внутриклеточными нуклеиновыми кислотами.

Другое исследование

Недавно было проведено исследование по выявлению потенциальных антимикробных пептидов прокариот, водных организмов, таких как рыбы и моллюски, а также односторонних животных, таких как ехидны.

Селективность

В конкуренции бактериальных клеток и клеток-хозяев с антимикробными пептидами антимикробные пептиды будут преимущественно взаимодействовать с бактериальной клеткой по отношению к клеткам млекопитающих, что позволяет им убивать микроорганизмы, не будучи значительно токсичными для клеток млекопитающих. Селективность является очень важной характеристикой антимикробных пептидов, и она может гарантировать их функцию в качестве антибиотиков в системах защиты хозяина.

Что касается раковых клеток, они сами также секретируют антимикробные пептиды человека, включая дефенсин , и в некоторых случаях сообщается, что они более устойчивы, чем окружающие нормальные клетки. Следовательно, мы не можем сделать вывод, что избирательность против раковых клеток всегда высока.

Факторы

Есть несколько факторов, которые тесно связаны со свойством селективности антимикробных пептидов, среди которых наибольший вклад вносит катионное свойство. Поскольку поверхность бактериальных мембран более отрицательно заряжена, чем клетки млекопитающих, антимикробные пептиды будут проявлять различное сродство к бактериальным мембранам и мембранам клеток млекопитающих.

Кроме того, на селективность влияют и другие факторы. Хорошо известно, что холестерин обычно широко распространен в мембранах клеток млекопитающих в качестве стабилизирующих мембран агентов, но отсутствует в мембранах бактериальных клеток; и присутствие этих холестеринов также обычно снижает активность антимикробных пептидов либо из-за стабилизации липидного бислоя, либо из-за взаимодействий между холестерином и пептидом. Таким образом, холестерин в клетках млекопитающих будет защищать клетки от атаки антимикробных пептидов.

Кроме того, хорошо известно , что трансмембранный потенциал влияет на пептидно-липидные взаимодействия. Существует внутри-отрицательный трансмембранный потенциал, существующий от внешнего листочка до внутреннего листка клеточных мембран, и этот внутри-отрицательный трансмембранный потенциал будет способствовать проницаемости мембраны, вероятно, облегчая встраивание положительно заряженных пептидов в мембраны. Для сравнения, трансмембранный потенциал бактериальных клеток более отрицательный, чем у нормальных клеток млекопитающих, поэтому бактериальная мембрана будет подвержена атаке положительно заряженных антимикробных пептидов.

Аналогичным образом также считается, что увеличение ионной силы , которая в целом снижает активность большинства антимикробных пептидов, частично способствует селективности антимикробных пептидов за счет ослабления электростатических взаимодействий, необходимых для начального взаимодействия.

Молекулярные основы клеточной селективности антимикробных пептидов

Механизм

Клеточные мембраны бактерий богаты кислыми фосфолипидами , такими как фосфатидилглицерин и кардиолипин . Эти головные группы фосфолипидов сильно заряжены отрицательно. Следовательно, самые внешние створки бислоя, которые подвергаются воздействию внешней части бактериальных мембран, более привлекательны для атаки положительно заряженных антимикробных пептидов. Таким образом, взаимодействие между положительными зарядами антимикробных пептидов и отрицательно заряженными бактериальными мембранами - это в основном электростатические взаимодействия, которые являются основной движущей силой ассоциации клеток. Кроме того, поскольку антимикробные пептиды образуют структуры с положительно заряженной поверхностью, а также с гидрофобной поверхностью, существуют также некоторые гидрофобные взаимодействия между гидрофобными участками антимикробных пептидов и цвиттерионными фосфолипидами (электрически нейтральными) поверхностью бактериальных мембран, которые действуют только как второстепенный эффект в этом случае.

Напротив, внешняя часть мембран растений и млекопитающих в основном состоит из липидов без каких-либо сетевых зарядов, поскольку большинство липидов с отрицательно заряженными головными группами в основном изолированы во внутреннем листке плазматических мембран. Таким образом, в случае клеток млекопитающих внешние поверхности мембран обычно состоят из цвиттерионного фосфатидилхолина и сфингомиелина , хотя небольшая часть внешних поверхностей мембраны содержит некоторые отрицательно заряженные ганглиозиды . Следовательно, гидрофобное взаимодействие между гидрофобной стороной амфипатических антимикробных пептидов и цвиттерионными фосфолипидами на клеточной поверхности клеточных мембран млекопитающих играет важную роль в образовании связывания пептида с клеткой. Однако гидрофобное взаимодействие относительно слабое по сравнению с электростатическим взаимодействием, поэтому антимикробные пептиды будут предпочтительно взаимодействовать с бактериальными мембранами.

Интерферометрия с двойной поляризацией использовалась in vitro для изучения и количественной оценки ассоциации с головной группой, встраивания в бислой, образования пор и возможного разрушения мембраны.

Контроль

Много усилий было вложено в контроль селективности клеток. Например, были предприняты попытки изменить и оптимизировать физико-химические параметры пептидов для контроля селективности, включая суммарный заряд, спиральность , гидрофобность на остаток (H), гидрофобный момент (μ) и угол, образованный положительно заряженной полярной спиралью. лицо (Φ). Считается, что другие механизмы, такие как введение D- аминокислот и фторированных аминокислот в гидрофобную фазу, разрушают вторичную структуру и, таким образом, уменьшают гидрофобное взаимодействие с клетками млекопитающих. Также было обнаружено, что замена Pro → Nlys в Pro-содержащих антимикробных пептидах с β-поворотом является многообещающей стратегией для создания новых селективных для малых бактериальных клеток антимикробных пептидов с внутриклеточными механизмами действия. Было высказано предположение, что прямое прикрепление магаинина к поверхности субстрата снижает неспецифическое связывание клеток и приводит к улучшенному пределу обнаружения бактериальных клеток, таких как Salmonella и E. coli .

Бактериальная резистентность

Бактерии используют различные стратегии устойчивости, чтобы избежать уничтожения антимикробных пептидов. Некоторые микроорганизмы изменяют чистые поверхностные заряды. Staphylococcus aureus переносит D-аланин из цитоплазмы на поверхность тейхоевой кислоты, которая снижает общий отрицательный заряд за счет введения основных аминогрупп. S. aureus также модифицирует свои анионные мембраны через MprF с L-лизином, увеличивая положительный суммарный заряд. Взаимодействие антимикробных пептидов с мембранными мишенями может быть ограничено капсульным полисахаридом Klebsiella pneumoniae . Изменения происходят в липиде A. Виды сальмонелл снижают текучесть своей внешней мембраны за счет увеличения гидрофобных взаимодействий между увеличенным количеством ацильных хвостов липида A путем добавления миристата к липиду A с 2-гидроксимиристатом и образования гептаацилированного липида A путем добавления пальмитата. Считается, что повышенный гидрофобный момент замедляет или отменяет внедрение антимикробного пептида и образование пор. Остатки претерпевают изменения в мембранных белках. У некоторых грамотрицательных бактерий изменение выработки белков внешней мембраны коррелирует с устойчивостью к уничтожению антимикробными пептидами. Нетипируемый Hemophilus influenzae переносит AMP внутрь клетки, где они разлагаются. Кроме того, H. influenzae модифицирует свои мембраны, чтобы создать впечатление, будто бактерия уже была успешно атакована AMP, защищая ее от нападения других AMP. АТФ-связывающие кассетные транспортеры импортируют антимикробные пептиды, а насос оттока при делении клеток резистентности экспортирует антимикробные пептиды. Оба переносчика связаны с устойчивостью к антимикробным пептидам. Бактерии продуцируют протеолитические ферменты, которые могут разрушать антимикробные пептиды, что приводит к их устойчивости. Везикулы наружной мембраны, продуцируемые грамотрицательными бактериями, связывают антимикробные пептиды и изолируют их от клеток, тем самым защищая клетки. Также известно, что везикулы внешней мембраны содержат различные протеазы, пептидазы и другие литические ферменты, которые могут играть роль в разложении внеклеточных молекул пептидов и нуклеиновых кислот, которые, если им позволено достичь бактериальных клеток, могут быть опасны для клеток. Передача сигналов Cyclic-di-GMP также участвует в регуляции устойчивости к антимикробным пептидам у Pseudomonas aeruginosa.

Хотя эти примеры показывают, что резистентность может развиваться естественным путем, растет беспокойство по поводу того, что использование фармацевтических копий антимикробных пептидов может сделать резистентность более частой и быстрой. В некоторых случаях устойчивость к этим пептидам, используемым в качестве фармацевтического средства для лечения медицинских проблем, может привести к устойчивости не только к медицинскому применению пептидов, но и к физиологической функции этих пептидов.

Подход «троянского коня» к решению этой проблемы основан на врожденной потребности патогенов в железе. «Контрабанда» противомикробных препаратов в патоген осуществляется путем связывания их с сидерофорами для транспортировки. Несмотря на простоту концепции, потребовались многие десятилетия работы, чтобы преодолеть трудное препятствие - транспортировку противомикробных препаратов через клеточные мембраны патогенов. Были рассмотрены уроки, извлеченные из успехов и неудач препаратов, конъюгированных с сидерофором, которые оценивались в ходе разработки новых агентов с использованием подхода «троянского коня».

Примеры

Плодовые мушки заражены бактериями, продуцирующими GFP. Красные глаза, лишенные генов антимикробных пептидов, восприимчивы к инфекции, в то время как у белоглазых мух возникает иммунный ответ дикого типа.

Противомикробные пептиды производятся видами на всем древе жизни, в том числе:

В последние годы активизировались исследования по разработке искусственно созданных имитаторов антимикробных пептидов, таких как SNAPP , отчасти из-за непомерно высокой стоимости производства AMP природного происхождения. Примером этого является катионный пептид C18G для лица, который был сконструирован из C-концевого домена фактора IV тромбоцитов человека. В настоящее время наиболее широко используемым антимикробным пептидом является низин ; будучи единственным антимикробным пептидом, одобренным FDA , он обычно используется в качестве искусственного консерванта.

Биоинформатика

Существует несколько биоинформатических баз данных для каталогизации антимикробных пептидов. APD (База данных антимикробных пептидов) - это исходная и модельная база данных для антимикробных пептидов ( https://aps.unmc.edu ). На основе APD также были построены другие базы данных, включая ADAM (База данных антимикробных пептидов), BioPD (База данных биологически активных пептидов), CAMP (Коллекция последовательностей и структур антимикробных пептидов), DBAASP (База данных антимикробных препаратов). Активность и структура пептидов) и LAMP (связывающие AMP).

Базы данных по антимикробным пептидам можно разделить на две категории в зависимости от источника содержащихся в них пептидов: специальные базы данных и общие базы данных. В этих базах данных есть различные инструменты для анализа и прогнозирования антимикробных пептидов. Например, APD имеет широко используемый интерфейс вычисления. Он также предоставляет ссылки на многие другие инструменты. CAMP содержит прогнозирование AMP, калькулятор функций, поиск BLAST, ClustalW, VAST, PRATT, спиральное колесо и т. Д. Кроме того, ADAM позволяет пользователям искать или просматривать взаимосвязи между последовательностью AMP и структурой. Противомикробные пептиды часто включают широкий спектр категорий, таких как противогрибковые, антибактериальные и противотуберкулезные пептиды.

dbAMP: предоставляет онлайн-платформу для изучения антимикробных пептидов с функциональной активностью и физико-химическими свойствами на данных транскриптома и протеома. dbAMP - это онлайн-ресурс, посвященный различным темам, таким как аннотации антимикробных пептидов (AMP), включая информацию о последовательности, антимикробную активность, посттрансляционные модификации (PTM), структурную визуализацию, антимикробную активность, виды-мишени с минимальной ингибирующей концентрацией (MIC), физико-химические свойства, или взаимодействия АМФ-белок.

Такие инструменты, как PeptideRanker, PeptideLocator и AntiMPmod, позволяют прогнозировать антимикробные пептиды, в то время как другие были разработаны для прогнозирования противогрибковой и противотуберкулезной активности.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки