Нуклеаза цинкового пальца - Zinc finger nuclease

Нуклеазы Цинк-пальцевые ( ZFNs ) являются искусственными ферментами рестрикции , генерируемого путем слияния цинкового пальца ДНК-связывающего домена к домену ДНК-расщепление . Домены цинковых пальцев могут быть сконструированы для нацеливания на конкретные желаемые последовательности ДНК , и это позволяет нуклеазам цинковых пальцев нацеливаться на уникальные последовательности в сложных геномах . Используя преимущества механизма репарации эндогенной ДНК, эти реагенты можно использовать для точного изменения геномов высших организмов. Наряду с CRISPR / Cas9 и TALEN , ZFN является важным инструментом в области редактирования генома .

Домены

ДНК-связывающий домен

ДНК-связывающие домены отдельных ZFN обычно содержат от трех до шести отдельных повторов из цинкового пальца, каждый из которых может распознавать от 9 до 18 пар оснований. Если домены с цинковыми пальцами прекрасно распознают последовательность ДНК из 3 пар оснований, они могут генерировать массив из 3 пар оснований, который может распознавать сайт-мишень из 9 пар оснований. В других процедурах могут использоваться модули с одним или двумя пальцами для создания массивов цинковых пальцев с шестью или более отдельными цинковыми пальцами. Основным недостатком этой процедуры является то, что особенности отдельных цинковых пальцев могут перекрываться и могут зависеть от контекста окружающих цинковых пальцев и ДНК. Без методов, учитывающих эту «зависимость от контекста», стандартная процедура модульной сборки часто дает сбой.

Для создания массивов цинковых пальцев, способных нацеливать желаемые последовательности, использовались многочисленные методы отбора. Первоначальные усилия по отбору использовали фаговый дисплей для выбора белков, которые связывают данную ДНК-мишень из большого пула частично рандомизированных массивов цинковых пальцев. В более поздних попытках использовались дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двугибридные системы и клетки млекопитающих. Новый многообещающий метод выбора новых матриц с цинковыми пальцами использует бактериальную двугибридную систему и был назван его создателями «ОТКРЫТЫМ». Эта система объединяет предварительно выбранные пулы отдельных цинковых пальцев, каждый из которых был выбран для связывания данного триплета, а затем использует второй раунд отбора для получения массивов из трех пальцев, способных связывать желаемую последовательность из 9 пар оснований. Эта система была разработана Zinc-Finger Consortium в качестве альтернативы коммерческим источникам инженерных матриц с цинковыми пальцами.

(см .: Химера цинкового пальца для получения дополнительной информации о методах выбора цинкового пальца)

Домен расщепления ДНК

Пара ZFN, каждый с тремя цинковыми пальцами, связывающимися с ДНК-мишенью, представляет собой введение двухцепочечного разрыва в домене FokI, изображенном желтым цветом. Впоследствии показано, что двухцепочечный разрыв восстанавливается посредством гомологически направленной репарации или негомологичного соединения концов .

Неспецифический домен отщепления от эндонуклеазы рестрикции типа II FokI обычно используется в качестве домена отщепления в ZFN. Этот домен расщепления должен димеризоваться, чтобы расщепить ДНК, и, таким образом, пара ZFN необходима для нацеливания на непалиндромные сайты ДНК. Стандартные ZFN соединяют домен расщепления с С-концом каждого домена цинкового пальца. Чтобы позволить двум доменам расщепления димеризоваться и расщеплять ДНК, два отдельных ZFN должны связывать противоположные цепи ДНК с их С-концами на определенном расстоянии друг от друга. Наиболее часто используемые линкерные последовательности между доменом цинкового пальца и доменом расщепления требуют, чтобы 5'-край каждого сайта связывания был разделен на 5-7 п.н.

Для улучшения активности и специфичности нуклеазного домена, используемого в ZFN, было использовано несколько различных методов белковой инженерии . Направленная эволюция была использована для создания варианта FokI с повышенной активностью расщепления, который авторы окрестили «Шарки». Конструирование на основе структуры также использовалось для улучшения специфичности расщепления FokI путем модификации интерфейса димеризации так, чтобы активными были только предполагаемые гетеродимерные частицы.

Приложения

Нуклеазы цинковых пальцев полезны для манипулирования геномами многих растений и животных, включая арабидопсис , табак , сою , кукурузу , Drosophila melanogaster , C. elegans , Platynereis dumerilii , морского ежа , тутового шелкопряда , рыбок данио , лягушек , мышей , крыс , кроликов , свиней и т. Д. крупный рогатый скот и различные типы клеток млекопитающих. Нуклеазы цинковых пальцев также использовались в модели гемофилии на мышах, и клинические испытания показали, что CD4 + человеческие Т-клетки с геном CCR5 , разрушенным нуклеазами цинковых пальцев, безопасны в качестве потенциального средства лечения ВИЧ / СПИДа . ZFN также используются для создания нового поколения моделей генетических заболеваний, называемых моделями изогенных заболеваний человека .

Отключение аллеля

ZFN могут быть использованы для отключения доминантных мутаций у гетерозиготных индивидуумов путем создания двухцепочечных разрывов (DSB) в ДНК (см. Генетическая рекомбинация ) в мутантном аллеле, который в отсутствие гомологичной матрицы будет репарирован негомологичным концевое соединение (NHEJ). NHEJ ремонтирует DSB, соединяя два конца вместе, и обычно не производит мутаций при условии, что разрез чистый и несложный. Однако в некоторых случаях репарация является несовершенной, что приводит к делеции или вставке пар оснований, вызывая сдвиг рамки считывания и предотвращая продукцию вредного белка. Несколько пар ZFN также можно использовать для полного удаления целых больших сегментов геномной последовательности. Чтобы контролировать активность редактирования, ПЦР целевой области амплифицирует оба аллеля и, если один из них содержит вставку, делецию или мутацию, приводит к образованию гетеродуплексного однонитевого пузыря, который можно легко обнаружить с помощью анализов расщепления. ZFN также использовались для модификации вызывающих болезнь аллелей при нарушениях с триплетными повторами. Расширенные участки повторов CAG / CTG являются генетической основой более чем дюжины унаследованных неврологических расстройств, включая болезнь Хантингтона, миотоническую дистрофию и несколько спиноцеребеллярных атаксий. На клетках человека было продемонстрировано, что ZFN могут направлять двухцепочечные разрывы (DSB) на повторы CAG и сокращать повторы с длинных патологических длин до коротких, менее токсичных.

Недавно группа исследователей успешно применила технологию ZFN для генетической модификации гена пигмента gol и гена ntl в эмбрионе рыбок данио. Специфические мотивы «цинковые пальцы» были сконструированы для распознавания различных последовательностей ДНК. МРНК, кодирующую ZFN, вводили в одноклеточные эмбрионы, и большой процент животных несли желаемые мутации и фенотипы. Их исследовательская работа продемонстрировала, что ZFN могут специфически и эффективно создавать наследуемые мутантные аллели в представляющих интерес локусах в зародышевой линии, а ZFN-индуцированные аллели могут размножаться в последующих поколениях.

Подобные исследования использования ZFN для создания специфических мутаций в эмбрионе рыбок данио также проводились другими исследовательскими группами. Ген kdr у рыбок данио кодирует рецептор фактора роста эндотелия-2 сосудов. Мутагенные поражения на этом участке-мишени были вызваны с помощью метода ZFN группой исследователей из США. Они предположили, что метод ZFN позволяет напрямую генерировать целевую аллельную серию мутантов; он не основан на существовании видоспецифичных линий эмбриональных стволовых клеток и применим к другим позвоночным, особенно к тем, чьи эмбрионы легко доступны; наконец, также возможно достичь целенаправленных поражений у рыбок данио, поэтому можно создавать модели заболеваний человека, которые до сих пор были недоступны.

Редактирование аллелей

ZFN также используются для перезаписи последовательности аллеля с помощью механизма гомологичной рекомбинации (HR) для восстановления DSB с использованием предоставленного фрагмента ДНК в качестве матрицы. Механизм HR ищет гомологию между поврежденной хромосомой и внехромосомным фрагментом и копирует последовательность фрагмента между двумя сломанными концами хромосомы, независимо от того, содержит ли фрагмент исходную последовательность. Если субъект гомозиготен по целевому аллелю, эффективность метода снижается, поскольку неповрежденная копия аллеля может использоваться в качестве шаблона для восстановления вместо предоставленного фрагмента.

Генная терапия

Успех генной терапии зависит от эффективной вставки терапевтических генов в соответствующий участок хромосомы- мишени в геноме человека , не вызывая повреждения клеток, онкогенных мутаций или иммунного ответа . Конструкция плазмидных векторов проста и понятна. Специально разработанные ZFN, которые объединяют неспецифический домен расщепления (N) эндонуклеазы Fok I с белками цинковых пальцев (ZFP), предлагают общий способ доставки сайт-специфичных DSB в геном и стимулируют локальную гомологичную рекомбинацию на несколько порядков. величины. Это делает целевую коррекцию генов или редактирование генома жизнеспособным вариантом в человеческих клетках. Поскольку плазмиды, кодирующие ZFN, могут быть использованы для временной экспрессии ZFN для нацеливания DSB на конкретный локус гена в клетках человека, они предлагают отличный способ направленной доставки терапевтических генов в предварительно выбранный хромосомный сайт. Подход на основе плазмид, кодирующих ZFN, может обойти все проблемы, связанные с вирусной доставкой терапевтических генов. Первые терапевтические применения ZFN, вероятно, будут включать терапию ex vivo с использованием собственных стволовых клеток пациента. После редактирования генома стволовых клеток, клетки можно было размножить в культуре и повторно ввести пациенту для получения дифференцированных клеток с исправленными функциями. Первоначальные мишени, вероятно, включают причины моногенных заболеваний, такие как ген IL2Rγ и ген β-глобина для генной коррекции и ген CCR5 для мутагенеза и инвалидности.

Потенциальные проблемы

Нецелевое расщепление

Если домены цинковых пальцев недостаточно специфичны для своего целевого сайта или они не нацелены на уникальный сайт в интересующем геноме, может произойти расщепление вне мишени. Такое нецелевое расщепление может привести к образованию достаточного количества двухцепочечных разрывов, чтобы подавить механизм репарации и, как следствие, привести к хромосомным перестройкам и / или гибели клеток. События нецелевого расщепления также могут способствовать случайной интеграции донорской ДНК. Было продемонстрировано, что два отдельных метода уменьшают расщепление вне мишени для 3-пальцевых ZFN, которые нацелены на два соседних сайта из 9 пар оснований. Другие группы используют ZFN с 4, 5 или 6 цинковыми пальцами, которые нацелены на более длинные и предположительно более редкие сайты, и такие ZFN теоретически могут давать меньшую нецелевую активность. Сравнение пары ZFN с 3 пальцами и пары ZFN с 4 пальцами обнаружило расщепление вне мишени в клетках человека в 31 локусе для ZFN с 3 пальцами и в 9 локусах для ZFN с 4 пальцами. Секвенирование всего генома C. elegans, модифицированных парой 5-пальцевых ZFN, обнаружило только предполагаемую модификацию и делецию в сайте, «не связанном с сайтом ZFN», что указывает на то, что эта пара ZFN способна нацеливаться на уникальный сайт в C. elegans геном.

Иммуногенность

Дополнительная информация: Адаптивный иммунный ответ

Как и в случае со многими чужеродными белками, вставленными в организм человека, существует риск иммунологического ответа против терапевтического агента и клеток, в которых он активен. Однако, поскольку белок должен экспрессироваться только временно, время, в течение которого может развиться ответ, короткое.

Лю и др. соответственно нацеливание ZFNickases на локус эндогенного β-казеина (CSN2) стимулирует лизостафин и добавление гена лизоцима человека путем гомологически направленной репарации и выводит секрет лизостафина коровами.

Перспективы

Способность точно манипулировать геномами растений и животных находит множество применений в фундаментальных исследованиях, сельском хозяйстве и терапии людей. Использование ZFN для модификации эндогенных генов традиционно было сложной задачей, в основном из-за проблемы создания доменов цинковых пальцев, которые нацелены на желаемую последовательность с достаточной специфичностью. Благодаря усовершенствованным методам конструирования доменов с цинковыми пальцами и доступности ZFN от коммерческого поставщика эта технология теперь находится в руках все большего числа исследователей. Несколько групп также разрабатывают другие типы сконструированных нуклеаз, включая сконструированные эндонуклеазы самонаведения и нуклеазы на основе сконструированных эффекторов TAL . Эффекторные нуклеазы TAL (TALEN) особенно интересны, потому что эффекторы TAL, по-видимому, очень просто сконструировать, а TALEN можно использовать для нацеливания на эндогенные локусы в клетках человека. Но на сегодняшний день никто не сообщил о выделении клональных клеточных линий или трансгенных организмов с использованием таких реагентов. Один тип ZFN, известный как SB-728-T, был протестирован на предмет потенциального применения при лечении ВИЧ.

Цинк-пальчиковые никазы

Никазы с цинковыми пальцами (ZFNickases) создаются путем инактивации каталитической активности одного мономера ZFN в димере ZFN, необходимом для двухцепочечного расщепления. ZFNickases демонстрируют нить-специфическую активность по разрезанию in vitro и, таким образом, обеспечивают высокоспецифичные однонитевые разрывы в ДНК. Эти SSBs подвергаются тем же клеточным механизмам для ДНК, что и ZFNs, но они обнаруживают значительно сниженную частоту мутагенных репараций NHEJ в их целевом участке никения. Это уменьшение обеспечивает предвзятость для модификаций генов, опосредованных HR. ZFNickases могут индуцировать целевой HR в культивируемых клетках человека и домашнего скота, хотя и на более низких уровнях, чем соответствующие ZFN, из которых они были получены, потому что зарубки могут быть восстановлены без генетических изменений. Основным ограничением модификаций генов, опосредованных ZFN, является конкуренция между путями восстановления NHEJ и HR. Независимо от присутствия конструкции донора ДНК, оба механизма репарации могут быть активированы после DSB, индуцированных ZFN. Таким образом, ZFNickases - это первая правдоподобная попытка разработки метода, который будет отдавать предпочтение HR-методу репарации ДНК, а не склонной к ошибкам репарации NHEJ. Уменьшая количество ремонтов NHEJ, ZFNickases могут тем самым уменьшить спектр нежелательных изменений, не связанных с целью. Легкость, с которой ZFNickases могут быть получены из ZFN, обеспечивает отличную платформу для дальнейших исследований, касающихся оптимизации ZFNickases и, возможно, повышения их уровней целевой ЧСС при сохранении их пониженной частоты NHEJ.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки