Нацеливание на гены - Gene targeting

Химерный ген мышей мишени для агути гену пальто цвета , с его потомством

Нацеливание на ген (также стратегия замены, основанная на гомологичной рекомбинации ) - это генетический метод, который использует гомологичную рекомбинацию для модификации эндогенного гена . Этот метод можно использовать для удаления гена, удаления экзонов , добавления гена и изменения отдельных пар оснований (введения точечных мутаций ). Нацеливание на гены может быть постоянным или условным. Условия могут быть, например, определенным периодом развития / жизни организма или ограничением определенной ткани . Нацеливание на ген требует создания определенного вектора для каждого интересующего гена. Однако его можно использовать для любого гена, независимо от транскрипционной активности или размера гена.

Методы

Обычно ДНК, содержащая часть целевого гена , репортерный ген и (доминантный) селектируемый маркер , собирается в бактериях .

Методы нацеливания на гены разработаны для нескольких модельных организмов и могут варьироваться в зависимости от используемых видов . Чтобы нацелить гены у мышей , ДНК вставляют в эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре. Клетки со вставкой могут вносить вклад в ткань мыши посредством инъекции эмбриона . Наконец, разводят химерных мышей, у которых модифицированные клетки составляют репродуктивные органы . После этого шага все тело мыши основано на выбранной эмбриональной стволовой клетке.

Physcomitrella дикого типа и нокаут-мхи : отклоняющиеся фенотипы, индуцированные в трансформантах библиотеки с нарушением генов. Physcomitrella дикого типа и трансформированные растения выращивали на минимальной среде Knop для индукции дифференцировки и развития гаметофоров . Для каждого завода показан обзор (верхний ряд, масштабная полоса соответствует 1 мм) и крупный план (нижний ряд, масштабная полоса равна 0,5 мм). A, гаплоидный мох дикого типа, полностью покрытый лиственными гаметофорами, и крупный план листа дикого типа. Б.Д., Разные мутанты.

Чтобы нацелить гены мха , ДНК инкубируют вместе со свежевыделенными протопластами и с полиэтиленгликолем . Поскольку мхи являются гаплоидными организмами, волокна мха ( протонема ) могут быть непосредственно проверены на наличие мишени либо путем обработки антибиотиками, либо с помощью ПЦР . Эта уникальная среди растений процедура обратной генетики так же эффективна, как и в случае дрожжей . Нацеливание на гены успешно применялось к крупному рогатому скоту, овцам, свиньям и многим грибам.

Частота нацеливания на гены может быть значительно увеличена за счет использования сконструированных эндонуклеаз, таких как нуклеазы цинковых пальцев , сконструированные эндонуклеазы самонаведения и нуклеазы на основе сконструированных эффекторов TAL . Этот метод применялся к видам, включая Drosophila melanogaster , табак , кукурузу , клетки человека , мышей и крыс .

Сравнение с улавливанием генов

Захват генов основан на случайной вставке кассеты, в то время как нацеливание на ген манипулирует конкретным геном. Кассеты можно использовать для многих разных целей, в то время как фланкирующие области гомологии кассет нацеливания на гены должны быть адаптированы для каждого гена. Это делает ловушку генов более удобной для крупномасштабных проектов, чем таргетинг. С другой стороны, нацеливание на гены можно использовать для генов с низкой транскрипцией, которые не будут обнаружены при скрининге ловушек. Вероятность захвата увеличивается с размером интрона , в то время как для нацеливания на гены небольшие гены также легко изменяются.

Приложения

Нацеливание на гены широко используется для изучения генетических заболеваний человека путем удаления (« выбивания ») или добавления («выбивания») конкретных представляющих интерес мутаций. Достижения в технологиях нацеливания на гены, которые ранее использовались для создания моделей клеток крыс, позволили создать новую волну моделей изогенных заболеваний человека . Эти модели являются наиболее точными моделями in vitro, доступными исследователям, и облегчают разработку персонализированных лекарств и диагностических средств, особенно в онкологии .

Нобелевская премия 2007 г.

Марио Р. Капеччи , Мартин Дж. Эванс и Оливер Смитис были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года за свою работу над «принципами введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток» или нацеливания на гены.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки