X-gal - X-gal

X-gal
X-Gal.svg
Имена
Название ИЮПАК
5-бром-4-хлор-1 H -индол-3-ил β- D -галактопиранозид
Предпочтительное название IUPAC
(2 S , 3 R , 4 S , 5 R , 6 R ) -2 - [(5-бром-4-хлор- 1H- индол-3-ил) окси] -6- (гидроксиметил) оксан-3, 4,5-триол
Идентификаторы
3D модель ( JSmol )
ЧЭБИ
ChemSpider
ECHA InfoCard 100.027.855 Отредактируйте это в Викиданных
MeSH X-gal
UNII
  • InChI = 1S / C14H15BrClNO6 / c15-5-1-2-6-9 (10 (5) 16) 7 (3-17-6) 22-14-13 (21) 12 (20) 11 (19) 8 ( 4-18) 23-14 / ч1-3,8,11-14,17-21H, 4H2 / t8-, 11 +, 12 +, 13-, 14- / м1 / с1 ☒N
    Ключ: OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N ☒N
  • InChI = 1 / C14H15BrClNO6 / c15-5-1-2-6-9 (10 (5) 16) 7 (3-17-6) 22-14-13 (21) 12 (20) 11 (19) 8 ( 4-18) 23-14 / ч1-3,8,11-14,17-21H, 4H2 / t8-, 11 +, 12 +, 13-, 14- / м1 / с1
    Ключ: OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNEBZ
  • Brc3ccc2c (c (O [C @@ H] 1O [C @@ H] ([C @ H] (O) [C @ H] (O) [C @ H] 1O) CO) c [nH] 2) c3Cl
Характеристики
С 14 Н 15 BrClNO 6
Молярная масса 408,629
Если не указано иное, данные приведены для материалов в их стандартном состоянии (при 25 ° C [77 ° F], 100 кПа).
☒N проверить  ( что есть   ?) проверитьY☒N
Ссылки на инфобоксы

X-gal (также сокращенно BCIG для 5-бром-4-хлор-3-индолил-β- D- галактопиранозида) представляет собой органическое соединение, состоящее из галактозы, связанной с замещенным индолом . Это соединение было синтезировано Джеромом Хорвицем и его сотрудниками в 1964 году. Официальное химическое название часто сокращается до менее точных, но также менее громоздких фраз, таких как бромхлориндоксилгалактозид. X из индоксила может быть источником X в сокращении X-gal. X-gal часто используется в молекулярной биологии для проверки наличия фермента β-галактозидазы вместо его обычной мишени, β-галактозида. Он также используется для определения активности этого фермента в гистохимии и бактериологии . X-gal является одним из многих индоксилгликозидов и сложных эфиров, которые дают нерастворимые синие соединения, подобные красителю индиго, в результате гидролиза, катализируемого ферментами.

Использует

X-Gal является аналогом из лактозы , и , следовательно , может быть гидролизован с помощью β-галактозидаза фермента , который расщепляет бета- гликозидных св зи в D -lactose. X-gal при расщеплении β-галактозидазой дает галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол - 1 . Последний затем самопроизвольно димеризуется и окисляется до 5,5'-дибром-4,4'- дихлориндиго - 2 , сильно синего продукта, который нерастворим. Сама X-gal бесцветна, поэтому наличие продукта синего цвета можно использовать в качестве теста на наличие активной β-галактозидазы. Это также позволяет использовать бактериальную β-галактозидазу (так называемую lacZ ) в качестве репортера в различных приложениях.

Реакция

X-Gal response.png

Клонирование

При клонировании генов X-gal используется в качестве визуального индикатора того, экспрессирует ли клетка функциональный фермент β-галактозидазы, с помощью метода, называемого скринингом синего / белого . Этот метод скрининга - удобный способ отличить успешный продукт клонирования от других неудачных.

Метод скрининга «синий / белый» основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы, где фрагмент гена lacZ (lacZα) в плазмиде может дополнять другой мутантный ген lacZ (lacZΔM15) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержащая lacZα , трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы может быть обнаружено, когда клетки выращивают в чашках, содержащих X-gal, продукт синего цвета, осажденный внутри клеток, дает характерные синие колонии. Однако сайт множественного клонирования, где представляющий интерес ген может быть лигирован в плазмидный вектор, находится внутри гена lacZα . Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα , следовательно , α-комплементация также нарушается, и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, затем можно легко отличить по ее белой окраске от неудачных синих. Примером векторов клонирования, используемых для этого теста, являются векторы pUC19 , pBluescript , pGem-T, и он также требует использования конкретных штаммов-хозяев E. coli , таких как DH5α, который несет мутантный ген lacZΔM15. Часто планшет также содержит X-Gal. содержат IPTG (изопропил-β- D -1-тиогалактопиранозид). IPTG - аналог лактозы по химическому строению. Однако IPTG не может гидролизоваться β-галактозидазой. IPTG используется в качестве индуктора, который связывается с lac-репрессором, высвобождая ДНК и обеспечивая транскрипцию. Таким образом, присутствие IPTG в чашке с агаром увеличивает синтез β-галактозидазы.

Варианты

X-gal имеет несколько разновидностей, которые представляют собой похожие молекулы с небольшими различиями, служащие в основном для получения цветов, отличных от синего, в качестве сигнала.

Короткое имя Длинное имя Цвет
Blue-Gal, Bluo-Gal 5-бром-3-индолил β- D -галактопиранозид Темно-синий
Роуз-Гал, Лосось-Гал, И-Гал, Ред-Гал 6-хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозид Розовый
Пурпурный-β- D- Гал 5-йод-3-индолил-β- D -галактопиранозид Фиолетовый
Пурпурный глюкозид, Magenta-GLC, Magenta gal 5-бром-6-хлор-3-индолил-β- D- глюкопиранозид Пурпурный
Зеленый-β- D- Гал N-Метилиндолил-β- D -галактопиранозид Зеленый
КРУЖКА, МУГА 4-Метилумбеллиферил β- D -галактопиранозид Флуоресцентный (λ ex = 365, λ em = 455)

Белково-белковые взаимодействия

В двухгибридном анализе β-галактозидаза может использоваться в качестве репортера для идентификации белков, которые взаимодействуют друг с другом. В этом методе библиотеки генома могут быть проверены на взаимодействие с белками с использованием дрожжевой или бактериальной системы. При успешном взаимодействии между проверяемыми белками происходит связывание домена активации с промотором. Если промотор связан с геном lacZ , продукция β-галактозидазы, которая приводит к образованию колоний с синим пигментом в присутствии X-gal, будет, следовательно, указывать на успешное взаимодействие между белками. Этот метод может быть ограничен скрининговыми библиотеками размером менее 10 6 . Успешное расщепление X-gal также создает заметно неприятный запах из-за испарения индола .

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Horwitz JP et al., 1964. Субстраты для цитохимической демонстрации ферментативной активности. I. Некоторые замещенные 3-индолил-β- D- гликопиранозиды. Журнал медицинской химии 7: 574-575.
  2. ^ Kiernan JA 2007. Индигогенные субстраты для обнаружения и локализации ферментов. Биотехника и гистохимия 82 (2): 73-103.
  3. ^ Санда, Sardul Singh (2010). Технология рекомбинантной ДНК . ИК Международный издательский дом. п. 116. ISBN 978-9380578446.
  4. ^ "IPTG - Биолайн" . www.bioline.com . Проверено 15 мая 2018 .
  5. ^ http://www.edvotek.com/300.051205.pdf
  6. ^ «5-Бром-3-индолил β-D-галактопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 года .
  7. ^ "Лосось-Гал - PubChem" . Проверено 4 февраля 2014 года .
  8. ^ "Purple-beta-D-Gal - PubChem" . Проверено 4 февраля 2014 года .
  9. ^ «5-Бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 года .
  10. ^ "Green-β-D-Gal - Biotium, Inc." . Проверено 4 февраля 2014 года .
  11. ^ «4-Метилумбеллиферил β-D-галактопиранозид» . Проверено 4 февраля 2014 года .
  12. ^ Б Joung Дж, Рамм Е, Pabo С (2000). «Бактериальная двухгибридная селекционная система для изучения взаимодействий белок-ДНК и белок-белок» . Proc Natl Acad Sci USA . 97 (13): 7382–7. Bibcode : 2000PNAS ... 97.7382J . DOI : 10.1073 / pnas.110149297 . PMC  16554 . PMID  10852947 .