Бета-галактозидаза - Beta-galactosidase

β-галактозидаза
β-галактозидаза из Penicillum sp.
Идентификаторы
ЕС нет.	3.2.1.23
№ CAS	9031-11-2
Базы данных
IntEnz	Просмотр IntEnz
BRENDA	BRENDA запись
ExPASy	Просмотр NiceZyme
КЕГГ	Запись в KEGG
MetaCyc	метаболический путь
ПРИАМ	профиль
Структуры PDB	RCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтология	Amigo / QuickGO
Поиск ЧВК статьи PubMed статьи NCBI белки

β-галактозидаза , которая также называется лактаза , бета-галы или β-галы , представляет собой семейство гликозид гидролазы ферментов , которые катализируют на гидролиз в бета-галактозидах в моносахариды через преломление в гликозидной связи . β-галактозиды включают углеводы, содержащие галактозу, где гликозидная связь расположена выше молекулы галактозы. Субстраты различных β-галактозидаз включают ганглиозид GM1, лактозилцерамиды, лактозу и различные гликопротеины .

Номенклатура

Комиссия по ферментам отвечает за создание системы классификации ферментов на основе чисел. Первое число описывает, к какому классу принадлежит фермент, второе число ссылочного подкласса, третье значение указывает природу субстрата, а четвертое число представляет собой порядковый номер, присвоенный ферментам в пределах подкласса. Номер EC ( Комиссия по ферментам) β-галактозидазы составляет 3.2.1.23  β-галактозидаза относится к классу 3, который относится к гидролазам . β-gal относится к подклассу гликозилаз с кислородной субстратной природой.

Функция

β-галактозидаза представляет собой экзогликозидазу, которая гидролизует β- гликозидную связь, образованную между галактозой и ее органической частью. Он также может расщеплять фукозиды и арабинозиды, но с гораздо меньшей эффективностью. Это важный фермент в организме человека. Недостатки белка может привести к galactosialidosis или синдром моркио B . В кишечной палочки , то LacZ ген представляет собой структурный ген для бета-галактозидазы; который присутствует как часть индуцибельного системного lac- оперона, который активируется в присутствии лактозы при низком уровне глюкозы . Синтез β-галактозидазы останавливается, когда уровень глюкозы становится достаточным.

Бета-галактозидаза имеет много гомологов, основанных на сходных последовательностях. Некоторые из них - это эволюционировавшая бета-галактозидаза (EBG), бета-глюкозидаза , 6-фосфо-бета-галактозидаза, бета-маннозидаза и лактаза-флоризингидролаза. Хотя они могут быть похожи по конструкции, все они выполняют разные функции. Бета-гал ингибируется L-рибозой , неконкурентным ингибитором йодом и конкурентными ингибиторами 2-фенилэтил-1-тио-бета-D-галактопиранозид (PETG), D-галактонолактон, изопропилтио-бета-D-галактозид (IPTG) , и галактоза.

β-галактозидаза важна для организмов, поскольку она является ключевым поставщиком энергии и источником углерода в результате расщепления лактозы до галактозы и глюкозы. Это также важно для сообщества с непереносимостью лактозы, поскольку оно отвечает за производство безлактозного молока и других молочных продуктов. Многим взрослым людям не хватает фермента лактазы , который выполняет ту же функцию, что и бета-гал, поэтому они не могут правильно переваривать молочные продукты. Бета-галактоза используется в таких молочных продуктах, как йогурт, сметана и некоторые сыры, которые обрабатываются ферментом для расщепления любой лактозы перед употреблением в пищу человеком. В последние годы бета-галактозидаза была исследована в качестве потенциального средства лечения непереносимости лактозы с помощью генной заместительной терапии, где ее можно было бы поместить в ДНК человека, чтобы люди могли расщеплять лактозу самостоятельно.

Состав

В 1,023 аминокислоты из кишечной палочки -галактозидазы были точно секвенировали в 1983 году, а его структура определяется через одиннадцать лет в 1994 году белок является 464- кДа гомотетрамер с 2,2,2-точечной симметрии . Каждая единица β-галактозидазы состоит из пяти доменов ; домен 1 представляет собой β- бочонок типа мармелад , домены 2 и 4 представляют собой бочки, подобные фибронектину III типа , домен 5 - новый бета-сэндвич, а центральный домен 3 представляет собой искаженный бочонок типа TIM , в котором отсутствует пятая спираль с искажение шестой нити.

Третий домен содержит активный сайт. Активный сайт состоит из элементов двух субъединиц тетрамера, и диссоциация тетрамера на димеры удаляет критические элементы активного сайта. Аминоконцевая последовательность β-галактозидазы, α-пептида, участвующего в α-комплементации, участвует в интерфейсе субъединиц. Его остатки 22-31 помогают стабилизировать пучок из четырех спиралей, который формирует основную часть этого интерфейса, а остатки 13 и 15 также вносят вклад в активирующий интерфейс. Эти структурные особенности обеспечивают объяснение феномена α-комплементации, когда делеция аминоконцевого сегмента приводит к образованию неактивного димера.

Реакция

β-галактозидазная реакция

β-галактозидаза может катализировать три разные реакции в организмах. С одной стороны, он может пройти процесс, называемый трансгалактозилированием, с образованием аллолактозы , создавая петлю положительной обратной связи для производства β-гал. Аллолактоза также может расщепляться с образованием моносахаридов. Он также может гидролизовать лактозу до галактозы и глюкозы, которые перейдут в гликолиз . Активный центр β-галактозидазы катализирует гидролиз ее дисахаридного субстрата через «мелкое» (непродуктивный сайт) и «глубокое» (продуктивный сайт) связывание. Галактозиды, такие как PETG и IPTG, будут связываться в мелком сайте, когда фермент находится в «открытой» конформации, в то время как аналоги переходного состояния, такие как L-рибоза и D-галактонолактон, будут связываться в глубоком сайте, когда конформация «закрыта».

Ферментативная реакция состоит из двух химических стадий: галактозилирования (k ₂ ) и дегалактозилирования (k ₃ ). Галактозилирование - это первая химическая стадия реакции, при которой Glu461 отдает протон гликозидному кислороду, что приводит к ковалентной связи галактозы с Glu537. На втором этапе, дегалактозилировании, ковалентная связь разрывается, когда Glu461 принимает протон, заменяя галактозу водой. Два переходных состояния происходят в глубоком участке фермента во время реакции, по одному разу после каждого шага. Когда вода участвует в реакции, образуется галактоза, в противном случае, когда D-глюкоза действует как акцептор на второй стадии, происходит трансгалактозилирование. Кинетически измерено, что отдельные тетрамеры белков катализируют реакции со скоростью 38 500 ± 900 реакций в минуту. Одновалентный калий ионы (K ⁺ ), а также двухвалентный магний ионы (Mg ²⁺ ) требуются для оптимальной активности фермента. Бета-связывание субстрата расщепляется с помощью терминальной карбоксильной группы на боковой цепи в виде глутаминовой кислоты .

Изображение слева представляет собой ленточную диаграмму бета-галактозидазы, отображающую расположение Glu 461, Glu 537 и Gly 794. Изображение справа представляет собой увеличенную версию, показывающую взаимодействие между аминокислотами.

В E. coli Glu-461 считался нуклеофилом в реакции замещения . Однако теперь известно, что Glu-461 является кислотным катализатором. Вместо этого Glu-537 является фактическим нуклеофилом, связывающимся с промежуточным галактозилом. В организме человека , то нуклеофил из гидролизной реакции является Glu-268. Gly794 важен для активности β-гал. Он отвечает за перевод фермента в «закрытую», связанную с лигандом конформацию или «открытую» конформацию, действуя как «шарнир» для петли активного сайта. Различные конформации гарантируют, что в активном центре происходит только предпочтительное связывание. В присутствии медленного субстрата активность Gly794 увеличивалась, а также увеличивалось галактозилирование и уменьшалось дегалактозилирование.

Приложения

Анализ β-галактозидазы часто используется в генетике , молекулярной биологии и других науках о жизни . Активный фермент может быть обнаружен с использованием искусственного хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-галактопиранозида, X-gal . β-галактозидаза расщепляет гликозидную связь в X-gal и образует галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол, который димеризуется и окисляется до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго, интенсивно синий продукт, который легко идентифицировать и количественно оценить. Он используется, например, на сине-белом экране . Его производство может быть вызвано не-гидролизуемым аналогом из аллолактоза , IPTG , который связывает и освобождает лаковый репрессор от оператора лакового, позволяя ту самую инициацию транскрипции , чтобы продолжить.

Он обычно используется в молекулярной биологии в качестве репортерного маркера для мониторинга экспрессии генов. Он также демонстрирует явление, называемое α-комплементацией, которое формирует основу для скрининга рекомбинантных клонов сине-белого цвета . Этот фермент может быть расщеплен на два пептида, LacZ α и LacZ Ω , ни один из которых не является активным сам по себе, но когда оба присутствуют вместе, спонтанно снова собираются в функциональный фермент. Это свойство используется во многих векторах клонирования, где присутствие гена lacZα в плазмиде может дополнять транс другой мутантный ген, кодирующий LacZΩ в конкретных лабораторных штаммах E. coli . Однако, когда фрагменты ДНК вставляются в вектор, продукция LacZα нарушается, поэтому клетки не проявляют активности β-галактозидазы. Присутствие или отсутствие активной β-галактозидазы может быть обнаружено с помощью X-gal , которая продуцирует характерный синий краситель при расщеплении β-галактозидазой, тем самым обеспечивая простой способ отличить присутствие или отсутствие клонированного продукта в плазмиде. В исследованиях хромосомных транслокаций лейкемии Добсон и его коллеги использовали слитый белок LacZ у мышей, используя склонность β-галактозидазы к олигомеризации, чтобы предположить потенциальную роль олигомеризации в функции слитого белка MLL.

Новая изоформа бета-галактозидазы с оптимальной активностью при pH 6,0 (связанная со старением бета-гал или SA-бета-гал ), которая специфически выражается в старении (необратимой остановке роста клеток). Для его обнаружения даже были разработаны специальные количественные анализы. Однако теперь известно, что это происходит из-за сверхэкспрессии и накопления лизосомальной эндогенной бета-галактозидазы, и ее экспрессия не требуется для старения. Тем не менее, он остается наиболее широко используемым биомаркером стареющих и стареющих клеток, поскольку он надежен и легко обнаруживается.

Эволюция

Некоторые виды бактерий, в том числе E. coli , имеют дополнительные гены β-галактозидазы. Второй ген, называемый геном развитой β-галактозидазы ( ebgA ), был обнаружен, когда штаммы с удаленным геном lacZ (но все еще содержащие ген галактозидпермеазы, lacY ) были помещены на среду, содержащую лактозу (или другие 3-галактозиды) в качестве единственного источник углерода. Через некоторое время некоторые колонии начали расти. Однако белок EbgA является неэффективной лактазой и не позволяет расти на лактозе. Два класса точечных мутаций резко улучшают активность фермента ebg по отношению к лактозе. и, как результат, мутантный фермент способен заменять lacZ-β-галактозидазу. EbgA и LacZ идентичны на 50% на уровне ДНК и на 33% на уровне аминокислот. Активный фермент ebg представляет собой совокупность продуктов ebgA-гена и ebgC-гена в соотношении 1: 1, причем активная форма ферментов ebg представляет собой гетерооктамер α 4 β4.

Распространение видов

Большая часть работы, проделанной с β-галактозидазой, была получена из E. coli. Однако β-гал может быть обнаружен во многих растениях (особенно фруктах), млекопитающих, дрожжах, бактериях и грибах. Гены β-галактозидазы могут различаться длиной кодирующей последовательности и длиной белков, образованных аминокислотами. Это разделяет β-галактозидазы на четыре семейства: GHF-1, GHF-2, GHF-35 и GHF- 42. E. Coli принадлежит к GHF-2, все растения принадлежат к GHF-35, а Thermus thermophilus принадлежит к GHF. -42. Различные фрукты могут экспрессировать несколько генов β-gal. В развитии плодов томатов экспрессируется по крайней мере 7 генов β-gal, аминокислотное сходство которых составляет от 33% до 79%. Исследование, направленное на определение размягчения плодов персиков, обнаружило 17 различных экспрессий генов β-галактозидаз. Единственная другая известная кристаллическая структура β-гал, полученная от Thermus thermophilus .

использованная литература

внешние ссылки

• бета-галактозидаза в Национальных медицинских предметных рубриках США (MeSH)