Органоид - Organoid

Органоид миниатюризированный и упрощенный вариант из органа , полученный в пробирке в трех измерениях , что показывает реалистичные микро-анатомия. Они получены из одной или нескольких клеток из ткани , эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток , которые могут самоорганизовываться в трехмерной культуре благодаря их самообновлению и дифференциации мощностей. Техника выращивания органоидов быстро улучшилась с начала 2010-х годов, и The Scientist назвал ее одним из крупнейших научных достижений 2013 года. Органоиды используются учеными для изучения болезней и методов лечения в лаборатории .

История

Попытки создать органы in vitro начались с одного из первых экспериментов по диссоциации-реагрегации, в котором Генри Ван Петерс Вильсон продемонстрировал, что механически диссоциированные клетки губок могут реагировать и самоорганизовываться, образуя целый организм. В последующие десятилетия несколько лабораторий смогли создать различные типы органов in vitro посредством диссоциации и реагрегации тканей органов, полученных от амфибий и эмбриональных цыплят. Феномен механически диссоциированных клеток на общую и реорганизации реформировать ткани они были получены из впоследствии привело к разработке гипотезы дифференциальной адгезии с помощью Malcolm Steinberg . С появлением области стволовых клеток биологии, потенциал стволовых клеток для формирования органов в пробирке была реализованы на ранних стадиях с наблюдением , что , когда стволовые клетки образуют тератомы или эмбриональных телец , что дифференцированные клетки могут объединяться в различные структуры , напоминающие те , что в несколько типов тканей . Появление области органоидов началось с перехода от культивирования и дифференциации стволовых клеток в 2D-средах к 3D-средам, что позволило создать сложные трехмерные структуры органов. С 1987 года исследователи разработали различные методы трехмерного культивирования и смогли использовать разные типы стволовых клеток для создания органоидов, напоминающих множество органов. В 2006 году Яаков Нахмиас и Дэвид Одде продемонстрировали самосборку сосудистых органоидов печени, сохраняемых более 50 дней in vitro . В 2008 году Йошики Сасай и его команда из института RIKEN продемонстрировали, что стволовые клетки могут быть превращены в шары нервных клеток, которые самоорганизуются в отличительные слои. В 2009 году лаборатория Hans Clevers в Hubrecht Institute и University Medical Center Utrecht , Нидерланды, показали, что одиночные LGR5-экспрессирующие кишечные стволовые клетки самоорганизуются в структуры крипта-ворсинки in vitro без необходимости мезенхимальной ниши. В 2010 году Mathieu Unbekandt и Jamie A. Davies продемонстрировали производство почечных органоидов из реногенных стволовых клеток, полученных из плодов мыши. Последующие отчеты показали значительную физиологическую функцию этих органоидов in vitro и in vivo .

В 2013 год Мэдлин Ланкастер в Институте молекулярной биотехнологии в Австрийской академии наук установил протокол для культивирования церебральных органоидов , полученных из стволовых клеток , которые имитируют клеточную организацию развивающегося человеческого мозга. В 2014 году Артем Шкуматов и соавт. в Университете Иллинойса в Урбана-Шампейн продемонстрировали, что сердечно-сосудистые органоиды могут образовываться из ES-клеток посредством модуляции жесткости субстрата, к которому они прикрепляются. Физиологическая жесткость способствовала трехмерности БЭ и кардиомиогенной дифференциации.

Takebe et al. продемонстрировать обобщенный метод формирования зачатка органа из различных тканей путем комбинирования тканеспецифичных предшественников, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, или соответствующих образцов тканей с эндотелиальными клетками и мезенхимальными стволовыми клетками. Они предположили, что менее зрелые ткани или зачатки органов, созданные с помощью принципа самоорганизованной конденсации, могут быть наиболее эффективным подходом к восстановлению функций зрелых органов после трансплантации, а не конденсаты, образованные из клеток более продвинутой стадии.

Характеристики

Ланкастер и Кноблих определяют органоид как совокупность органоспецифических типов клеток, которые развиваются из стволовых клеток или органов-предшественников, самоорганизуются посредством сортировки клеток и пространственно ограниченного предопределения клонов аналогично in vivo и проявляют следующие свойства:

• он имеет несколько типов клеток, специфичных для органа;
• он способен воспроизводить некоторые специфические функции органа (например, сокращение , нервную активность, эндокринную секрецию, фильтрацию, экскрецию );
• его клетки сгруппированы и пространственно организованы, подобно органу.

Процесс

Формирование органоидов обычно требует культивирования стволовых клеток или клеток-предшественников в 3D-среде. 3D - среда может быть сделана с использованием внеклеточного матрикса гидрогеля , такими как Матригель или Cultrex BME, который представляет собой ламинин -богатого внеклеточного матрикса , который секретируется опухоль линии Engelbreth-Holm-Swarm. Затем можно получить органоидные тела путем встраивания стволовых клеток в трехмерную среду. Когда для создания органоида используются плюрипотентные стволовые клетки, клеткам обычно, но не всегда, позволяют образовывать эмбриоидные тела . Затем эти эмбриоидные тельца фармакологически обрабатывают факторами формирования паттерна, чтобы стимулировать формирование желаемой идентичности органоидов. Органоиды также были созданы с использованием взрослых стволовых клеток, извлеченных из органа-мишени, и культивированы в трехмерной среде.

Типы

Множество структур органов были воспроизведены с использованием органоидов. Этот раздел призван обрисовать состояние области на данный момент посредством предоставления сокращенного списка органоидов, которые были успешно созданы, наряду с кратким описанием, основанным на самой последней литературе по каждому органоиду, и примерами того, как он был использован. в исследованиях.

Церебральный органоид

Церебральный Органоид описывает искусственно выращен, в пробирке , миниатюрных органах , напоминающих мозг . Церебральные органоиды создаются путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека в трехмерной структуре с использованием ротационного биореактора и развиваются в течение месяцев. Эта процедура имеет потенциальное применение при изучении развития, физиологии и функций мозга. Органоиды головного мозга могут испытывать «простые ощущения» в ответ на внешнюю стимуляцию, и нейробиологи Андреа Лавацца , Элан Охайон и Хидея Сакагути относятся к числу тех, кто выражает озабоченность по поводу того, что такие органы могут развить чувствительность . Они предполагают, что дальнейшее развитие техники должно подлежать строгой процедуре надзора.

Органоид кишечника

Органоиды кишечника относятся к органоидам, которые воспроизводят структуры желудочно-кишечного тракта. Желудочно-кишечный тракт возникает из энтодермы , которая в процессе развития образует трубку, которую можно разделить на три отдельных участка, которые, наряду с другими органами, дают начало следующим отделам желудочно-кишечного тракта:

1. Передняя кишка дает начало ротовой полости и желудку.
2. Средняя кишка дает начало тонкой кишке и восходящей толстой кишке.
3. Задняя кишка дает начало прямой кишке и остальной части толстой кишки.

Органоиды созданы для следующих структур желудочно-кишечного тракта:

Органоид кишечника

Органоиды кишечника до сих пор входили в число органоидов кишечника, которые вырабатывались непосредственно из плюрипотентных стволовых клеток. Один из способов заставить плюрипотентные стволовые клетки человека образовывать органоиды кишечника - это сначала применение активина А для приведения клеток в мезоэндодермальную идентичность с последующим фармакологическим усилением сигнальных путей Wnt3a и Fgf4, поскольку они, как было продемонстрировано, способствуют развитию задней части кишечника. судьба. Органоиды кишечника также были получены из стволовых клеток кишечника, извлеченных из тканей взрослого организма и культивированных в трехмерных средах. Эти органоиды, полученные из взрослых стволовых клеток, часто называют энтероидами или колоноидами, в зависимости от сегмента их происхождения, и были обнаружены как в кишечнике человека, так и в кишечнике мыши. Органоиды кишечника состоят из одного слоя поляризованных эпителиальных клеток кишечника, окружающих центральный просвет. Таким образом, воссоздайте структуру крипта-ворсинка кишечника, повторяя ее функцию, физиологию и организацию, и поддерживая все типы клеток, обычно встречающиеся в структуре, включая стволовые клетки кишечника. Таким образом, кишечные органоиды представляют собой ценную модель для изучения кишечного транспорта питательных веществ, абсорбции лекарств, секреции инкретинового гормона и инфекции различными энтеропатогенами. Органоиды кишечника воспроизводят структуру крипта-ворсинка с высокой степенью достоверности, поскольку они были успешно трансплантированы в кишечник мыши и, следовательно, высоко ценятся как ценная модель для исследований. Одна из областей исследования кишечных органоидов - это ниша стволовых клеток. Органоиды кишечника использовались для изучения природы ниши кишечных стволовых клеток , и исследования, проведенные с ними, продемонстрировали положительную роль IL-22 в поддержании в кишечных стволовых клетках, а также продемонстрировали роль других типов клеток, таких как нейроны и фибробласты, в поддержании. стволовых клеток кишечника. В области биологии инфекций были изучены различные модельные системы кишечных органоидов. С одной стороны, органоиды можно заразить в большом количестве, просто смешав их с интересующим энтеропатогеном . Однако для моделирования инфекции более естественным путем, начиная с просвета кишечника, требуется микроинъекция патогена . Кроме того, полярность органоидов кишечника может быть инвертирована, и они могут быть даже диссоциированы на отдельные клетки и культивированы как 2D-монослои, чтобы сделать апикальную и базолатеральную стороны эпителия более доступными. Органоиды кишечника также продемонстрировали терапевтический потенциал.

Чтобы более точно воспроизвести кишечник in vivo , были разработаны совместные культуры органоидов кишечника и иммунных клеток . Кроме того, модели «орган на чипе» объединяют органоиды кишечника с другими типами клеток, такими как эндотелиальные или иммунные клетки, а также с перистальтическим потоком.

Желудок или желудочный органоид

Органоиды желудка повторяют, по крайней мере, частично физиологию желудка . Органоиды желудка были получены непосредственно из плюрипотентных стволовых клеток посредством временных манипуляций с путями передачи сигналов FGF , WNT , BMP , ретиноевой кислоты и EGF в трехмерных условиях культивирования. Органоиды желудка также были получены с использованием LGR5, экспрессирующих взрослые стволовые клетки желудка . Органоиды желудка использовались в качестве модели для изучения рака наряду с заболеваниями и развитием человека. Например, в одном исследовании изучались основные генетические изменения, лежащие в основе популяции метастатической опухоли пациента , и было установлено, что, в отличие от первичной опухоли пациента, в метастазе были мутированы оба аллеля гена TGFBR2 . Чтобы дополнительно оценить роль TGFBR2 в метастазировании, исследователи создали органоиды, в которых экспрессия TGFBR2 подавлена, с помощью которых они смогли продемонстрировать, что снижение активности TGFBR2 приводит к инвазии и метастазированию раковых опухолей как in vitro, так и in vivo .

Лингвальный органоид

Лингвальные органоиды - это органоиды, которые повторяют, по крайней мере частично, аспекты физиологии языка. Эпителиально-язычные органоиды были созданы с использованием BMI1, экспрессирующих эпителиальные стволовые клетки в трехмерных условиях культивирования посредством манипуляции с EGF , WNT и TGF-β . В этой органоидной культуре, однако, отсутствуют вкусовые рецепторы , поскольку эти клетки не возникают из эпителиальных стволовых клеток, экспрессирующих Bmi1. Органоиды язычных вкусовых рецепторов, содержащие вкусовые клетки, однако, были созданы с использованием LGR5 + или CD44 + стволовых / предшественников клеток циркумваллятной (CV) ткани сосочка. Эти органоиды вкусовых рецепторов были успешно созданы как непосредственно из изолированных Lgr5- или LGR6-экспрессирующих вкусовые стволовые клетки / клетки-предшественники. и косвенно, посредством выделения, переваривания и последующего культивирования ткани CV, содержащей Lgr5 + или CD44 + стволовые / предшественники клетки.

Другие виды органоидов

• Органоид щитовидной железы
• Органоид тимуса

Органоиды тимуса повторяют, по крайней мере, частично архитектуру и функциональность ниши стволовых клеток тимуса , который является лимфоидным органом, в котором созревают Т-клетки. Органоиды тимуса были получены путем посева стромальных клеток тимуса в трехмерной культуре. Органоиды тимуса, по-видимому, успешно воспроизводят функцию тимуса, поскольку совместное культивирование гемопоэтических стволовых клеток или стволовых клеток костного мозга человека с органоидами тимуса мыши привело к образованию Т-клеток .

• Органоид яичка
• Органоид простаты
• Органоид печени
• Органоид поджелудочной железы

Недавние достижения в области микротитрационных планшетов с репеллентом клеток позволили быстро и экономически эффективно проводить скрининг больших и малых молекул, таких как библиотеки, на трехмерных моделях рака поджелудочной железы. Эти модели согласуются по фенотипу и профилям экспрессии с моделями, обнаруженными в лаборатории доктора Дэвида Тувсона .

• Эпителиальный органоид
• Органоид легких
• Органоид почек
• Гаструлоид (эмбриональный органоид) - генерирует все оси эмбриона и полностью реализует коллинеарные паттерны экспрессии гена Hox вдоль переднезадней оси.
• Бластоид (органоид, похожий на бластоцисту)
• Сердечный органоид - в 2018 году полые сердечные органоиды были созданы, чтобы биться и реагировать на стимулы, чтобы биться быстрее или медленнее.
• Органоид сетчатки
• Органоид глиобластомы

Трехмерные органоидные модели рака мозга, полученные либо из эксплантатов, полученных от пациента (PDX), либо непосредственно из раковой ткани, теперь легко достижимы и позволяют проводить высокопроизводительный скрининг этих опухолей по сравнению с текущей группой одобренных лекарств по всему миру.

Фундаментальные исследования

Органоиды позволяют изучать, как клетки взаимодействуют вместе в органе, их взаимодействие с окружающей средой, как болезни влияют на них и действие лекарств. Культивирование in vitro позволяет легко манипулировать этой системой и облегчает их мониторинг. Хотя органы трудно культивировать, поскольку их размер ограничивает проникновение питательных веществ, небольшой размер органоидов ограничивает эту проблему. С другой стороны, они не обладают всеми особенностями органов, и взаимодействия с другими органами не воспроизводятся in vitro . Хотя исследования стволовых клеток и регуляции стволовости были первой областью применения кишечных органоидов, теперь они также используются для изучения, например, поглощения питательных веществ, транспорта лекарств и секреции инкретиновых гормонов. Это имеет большое значение в контексте заболеваний, связанных с нарушением всасывания, а также нарушений обмена веществ, таких как ожирение , инсулинорезистентность и диабет .

Модели болезни

Органоиды дают возможность создавать клеточные модели болезней человека, которые можно изучать в лаборатории, чтобы лучше понять причины заболевания и определить возможные методы лечения. В одном примере система редактирования генома под названием CRISPR была применена к плюрипотентным стволовым клеткам человека для введения целевых мутаций в гены, относящиеся к двум различным заболеваниям почек, поликистозу почек и фокально-сегментарному гломерулосклерозу . Эти модифицированные CRISPR плюрипотентные стволовые клетки были впоследствии выращены в органоиды почек человека, которые проявляли специфические для заболевания фенотипы. Органоиды почек из стволовых клеток с мутациями при поликистозе почек образовывали большие полупрозрачные структуры кисты из почечных канальцев. При культивировании в отсутствие прикрепленных сигналов (в суспензии) эти кисты достигали размеров 1 см в диаметре в течение нескольких месяцев. Органоиды почек с мутациями в гене, связанном с фокальным сегментарным гломерулосклерозом, развивают дефекты соединения между подоцитами, фильтрующими клетками, пораженными этим заболеванием. Важно отметить, что эти фенотипы заболевания отсутствовали в контрольных органоидах с идентичным генетическим фоном, но не имели мутаций CRISPR. Сравнение этих органоидных фенотипов с больными тканями мышей и людей показало сходство с дефектами в раннем развитии.

Как впервые разработали Такахаши и Яманака в 2007 году, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) также могут быть перепрограммированы из фибробластов кожи пациента. Эти стволовые клетки несут в себе точный генетический фон пациента, включая любые генетические мутации, которые могут способствовать развитию болезней человека. Дифференциация этих клеток на органоиды почек была проведена у пациентов с синдромом Лоу из-за мутаций ORCL1 . В этом отчете сравнивали органоиды почек, дифференцированные от ИПСК пациента, с неродственными контрольными ИПСК и продемонстрировали неспособность почечных клеток пациента мобилизовать фактор транскрипции SIX2 из комплекса Гольджи . Поскольку SIX2 является хорошо охарактеризованным маркером клеток-предшественников нефрона в мезенхиме шапочки , авторы пришли к выводу, что почечное заболевание, часто наблюдаемое при синдроме Лоу (глобальная недостаточность реабсорбции проксимальных канальцев или почечный синдром Фанкони ), может быть связано с изменением паттерна нефронов, возникающим из-за нефрона. клетки-предшественники, лишенные экспрессии этого важного гена SIX2 .

В других исследованиях использовалось редактирование гена CRISPR для исправления мутации пациента в клетках ИПСК пациента для создания изогенного контроля, который можно выполнять одновременно с перепрограммированием ИПСК. Сравнение органоида, полученного из ИПСК пациента, с изогенным контролем является текущим золотым стандартом в этой области, поскольку оно позволяет изолировать интересующую мутацию как единственную переменную в экспериментальной модели. В одном из таких отчетов почечные органоиды, полученные из ИПСК пациента с синдромом Майнцера-Салдино из-за сложных гетерозиготных мутаций в IFT140, сравнивались с изогенным контрольным органоидом, в котором вариант IFT140, приводящий к нежизнеспособному транскрипту мРНК, был исправлен с помощью CRISPR. . Органоиды почек пациентов продемонстрировали аномальную морфологию ресничек, согласующуюся с существующими моделями на животных, которые были спасены от морфологии дикого типа в органоидах, скорректированных с помощью генов. Сравнительное профилирование транскрипции эпителиальных клеток, очищенных от органоидов пациента и контрольной группы, выявило пути, участвующие в клеточной полярности , межклеточных соединениях и сборке динеина , некоторые из которых были задействованы для других генотипов в фенотипическом семействе почечных цилиопатий. Другой отчет с использованием изогенного контроля продемонстрировал аномальную локализацию нефрина в клубочках органоидов почек, образовавшихся у пациента с врожденным нефротическим синдромом .

Персонализированная медицина

Органоиды кишечника, выращенные из ректальной биопсии с использованием протоколов культивирования, установленных группой Clevers, были использованы для моделирования муковисцидоза и привели к первому применению органоидов для индивидуального лечения. Муковисцидоз - это наследственное заболевание, вызываемое мутациями гена трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза, который кодирует эпителиальный ионный канал, необходимый для здоровых поверхностных жидкостей эпителия. Исследования лаборатории Джеффри Бикмана (Детская больница Вильгельмина, Университетский медицинский центр Утрехта, Нидерланды) описали в 2013 году, что стимуляция колоректальных органоидов агонистами, повышающими цАМФ, такими как форсколин или холерный токсин, вызывала быстрое набухание органоидов полностью зависимым от CFTR образом. . В то время как органоиды субъектов, не страдающих кистозным фиброзом, набухают в ответ на форсколин в результате переноса жидкости в просвет органоидов, в органоидах, полученных от людей с кистозным фиброзом, это сильно снижено или отсутствует. Набухание может быть восстановлено терапевтическими средствами, которые восстанавливают белок CFTR (модуляторы CFTR), что указывает на то, что индивидуальные ответы на терапию, модулирующую CFTR, можно количественно оценить в доклинических лабораторных условиях. Schwank et al. также продемонстрировали, что органоидный фенотип кистозного фиброза кишечника может быть исправлен с помощью редактирования гена CRISPR-Cas9 в 2013 году.

Последующие исследования Dekkers et al. в 2016 году показали, что количественные различия в вызванном форсколином набухании между органоидами кишечника, полученными от людей с муковисцидозом, связаны с известными диагностическими и прогностическими маркерами, такими как мутации гена CFTR или биомаркеры функции CFTR in vivo. Кроме того, авторы продемонстрировали, что ответы модулятора CFTR в органоидах кишечника со специфическими мутациями CFTR коррелируют с опубликованными данными клинических испытаний этих методов лечения. Это привело к доклиническим исследованиям, в которых было обнаружено, что органоиды пациентов с чрезвычайно редкими мутациями CFTR, для которых не было зарегистрировано лечение, сильно реагировали на клинически доступный модулятор CFTR. Предполагаемая клиническая польза лечения для этих субъектов, основанная на доклиническом исследовании органоидов, была впоследствии подтверждена после клинического внедрения лечения членами клинического центра МВ под наблюдением Корса ван дер Энта (отделение детской пульмонологии, детская больница Вильгельмина, Университетский медицинский центр. Утрехт, Нидерланды). Эти исследования впервые показывают, что органоиды можно использовать для индивидуальной терапии или индивидуальной медицины .

Как модель для биологии развития

Органоиды предлагают исследователям исключительную модель для изучения биологии развития . С момента идентификации плюрипотентных стволовых клеток были достигнуты большие успехи в управлении судьбой плюрипотентных стволовых клеток in vitro с использованием 2D-культур. Эти достижения в направлении судьбы ПСХ вместе с достижениями в методах трехмерного культивирования позволили создать органоиды, которые воспроизводят свойства различных специфических субрегионов множества органов. Таким образом, использование этих органоидов внесло большой вклад в расширение нашего понимания процессов органогенеза и области биологии развития. В центральной нервной системе развития, например, органоиды внесли свой вклад в наше понимание физических сил, лежащих в основе формирования сетчатки чашки. Более поздняя работа расширила периоды роста кортикальных органоидов в значительной степени, и почти через год при определенных условиях дифференцировки органоиды сохраняются и имеют некоторые особенности стадий развития человеческого плода.

использованная литература

дальнейшее чтение