Репортерная система GUS - GUS reporter system

Пыльники риса и стиль, показывающий выражение GUS

Система GUS - репортер ( GUS : β-глюкуронидаза ) представляет собой ген - репортера система, особенно полезна в растительной молекулярной биологии и микробиологии. Доступно несколько видов анализа репортерного гена GUS , в зависимости от используемого субстрата. Термин « окрашивание GUS» относится к наиболее распространенному из них - гистохимическому методу.

Цель

Целью этого метода является анализ активности промотора транскрипции гена (с точки зрения экспрессии так называемого репортерного гена под регуляторным контролем этого промотора) либо количественным образом, включая некоторую меру активности, либо качественно ( включен по сравнению с выключением) посредством визуализации его активности в различных клетках, тканях или органах. В методе используется ген uidA кишечной палочки , кодирующий фермент β-глюкуронидазу ; этот фермент при инкубации со специфическими бесцветными или нефлуоресцентными субстратами может превращать их в стабильные окрашенные или флуоресцентные продукты. Наличие GUS-индуцированного цвета указывает на то, где ген активно экспрессировался. Таким образом, сильная промоторная активность вызывает сильное окрашивание, а слабая промоторная активность вызывает меньшее окрашивание.

Ген uidA также может быть слит с представляющим интерес геном, создавая слияние генов . Вставка гена uidA вызовет продукцию GUS, которую затем можно обнаружить с использованием различных глюкуронидов в качестве субстратов.

Субстраты

Существуют различные возможные глюкурониды, которые можно использовать в качестве субстратов для β-глюкуронидазы, в зависимости от типа необходимого обнаружения ( гистохимического , спектрофотометрического , флуориметрического ). Наиболее распространенным субстратом для гистохимического окрашивания GUS является 5-бром-4-хлор-3 -индолилглюкуронид ( X-Gluc ). X-Gluc гидролизуется GUS в продукт 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго (ди-X-индиго). DiX-индиго будет казаться синим, и его можно будет увидеть с помощью светового микроскопа. Этот процесс аналогичен гидролиза X-гал с помощью бета-галактозидазы для получения синих клеток , как это обычно практикуется в бактериальных анализах репортерных генов.

Для других типов обнаружения обычными субстратами являются п-нитрофенил-β-D-глюкуронид для спектрофотометрического анализа и 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкуронид (MUG) для флуориметрического анализа.

История

Система была первоначально разработана Ричардом Энтони Джефферсоном во время его докторской диссертации. в Университете Колорадо в Боулдере . Он приспособил технику для использования с растениями , как он работал в селекционной институте в Кембридже , в период с 1985 по 1987 год С тех пор тысячи лабораторий использовали систему, что делает его одним из наиболее широко используемых инструментов в молекулярной биологии растений, а подчеркнуты тысячами цитат в научной литературе.

Эмбрион риса с выражением GUS

Целевые организмы

Организм подходит для анализа GUS, если он не обладает природной активностью β-глюкуронидазы или если активность очень низкая ( фоновая активность). По этой причине анализ не подходит для большинства позвоночных и многих моллюсков . Поскольку активность GUS не обнаруживается у высших растений , мхов , водорослей , папоротников , грибов и большинства бактерий , анализ идеально подходит для изучения экспрессии генов в этих организмах и считается предпочтительным репортерным геном в науке о растениях.

Преимущества и ограничения

Анализ GUS не требует присутствия каких-либо кофакторов или ионов для функционирования. Бета-глюкуронидаза может функционировать в широком диапазоне значений pH и довольно устойчива к термической инактивации. Однако GUS подвержен ингибированию со стороны определенных ионов тяжелых металлов, таких как Cu 2+ и Zn 2+ .

Кроме того, интерпретация анализа ограничена перемещением diX-индиго по клетке. DiX-индиго может ассоциироваться с липидами, чтобы диффундировать далеко от места активности фермента, что свидетельствует об отсутствии цитозольной локализации и неравномерности проникновения субстрата. Это потенциально может привести к неправильной интерпретации локализации белка GUS. Несмотря на отсутствие клеточной локализации, ядерная локализация GUS хорошо наблюдалась. Анализы GUS можно проводить в присутствии феррицианида калия, чтобы предотвратить диффузию пятна.

Другие репортерные системы

Система GUS - не единственная доступная система-репортер генов для анализа активности промоторов. Другие конкурирующие системы основаны, например, на люциферазе , GFP , бета-галактозидазе , хлорамфениколацетилтрансферазе (CAT), щелочной фосфатазе . Использование той или иной системы в основном зависит от интересующего организма и технологий визуализации и микроскопии, доступных лабораториям, проводящим исследования.

Другое использование

Слой алейронов семян риса, показывающий экспрессию GUSPlus

Анализ GUS, как и другие системы репортерных генов, можно использовать для других видов исследований, кроме классического анализа активности промотора. Репортерные системы использовались для определения эффективности систем доставки генов, внутриклеточной локализации генного продукта, обнаружения взаимодействий белок-белок или белок-ДНК, эффективности сигналов инициации трансляции и успеха усилий по молекулярному клонированию.

Источники

  1. ^ а б Джефферсон, РА ; Кавана, TA; Беван, MW (1987). «Слияния GUS: бета-глюкуронидаза как чувствительный и универсальный маркер слияния генов у высших растений» . Журнал EMBO . 6 (13): 3901–7. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1987.tb02730.x . PMC  553867 . PMID  3327686 .
  2. ^ Ванде Брук, A; Ламбрехт, М; Вандерлейден, Дж (1998). «Бактериальная хемотаксическая подвижность важна для инициации колонизации корней пшеницы Azospirillum brasilense». Микробиология . 144 (9): 2599–606. DOI : 10.1099 / 00221287-144-9-2599 . PMID  9782509 .
  3. ^ Бланко, C; Ritzenthaler, P; Мата-Гилсингер, М. (1982). «Клонирование и анализ эндонуклеазной рестрикции генов uidA и uidR в Escherichia coli K-12: Определение направления транскрипции для гена uidA» . Журнал бактериологии . 149 (2): 587–94. DOI : 10.1128 / JB.149.2.587-594.1982 . PMC  216546 . PMID  6276362 .
  4. ^ а б Джефферсон, РА; Берджесс, С.М. Хирш, Д. (1986). «Бета-глюкуронидаза из Escherichia coli как маркер слияния генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (22): 8447–51. Bibcode : 1986PNAS ... 83.8447J . DOI : 10.1073 / pnas.83.22.8447 . PMC  386947 . PMID  3534890 .
  5. ^ a b c Guivarc'h, A .; Caissard, JC; Азми, А .; Эльмаян, Т .; Chriqui, D .; Тепфер, М. (1996-09-01). «Обнаружение in situ экспрессии репортерного гена thegus в трансгенных растениях: десять лет генов синего» . Трансгенные исследования . 5 (5): 281–288. DOI : 10.1007 / BF01968938 . ISSN  1573-9368 . S2CID  21151079 .
  6. ^ a b c Патент США 5268463
  7. ^ a b Веб-сайт организации Камбии : биография Ричарда А. Джефферсона
  8. ^ Джефферсон, Ричард А. (1987-12-01). «Анализ химерных генов в растениях: система слияния генов GUS» . Репортер по молекулярной биологии растений . 5 (4): 387–405. DOI : 10.1007 / BF02667740 . ISSN  1572-9818 . S2CID  5619830 .
  9. ^ Кессар, Жан-Клод; Гиварч, Энн; Рембур, Жак; Азми, Абделькрим; Чрики, Доминик (1994-05-01). «Ложные локализации микрокристаллов diX-индиго, полученные с помощью гистохимического анализа GUS» . Трансгенные исследования . 3 (3): 176–181. DOI : 10.1007 / BF01973985 . ISSN  1573-9368 . S2CID  797978 .
  10. ^ Цитовский, В .; Zupan, J .; Warnick, D .; Замбрыски, П. (1992-06-26). «Ядерная локализация белка Agrobacterium VirE2 в клетках растений» . Наука . 256 (5065): 1802–1805. Bibcode : 1992Sci ... 256.1802C . DOI : 10.1126 / science.1615325 . ISSN  0036-8075 . PMID  1615325 .