Водородно-дейтериевый обмен - Hydrogen–deuterium exchange

Обмен водорода и дейтерия (также называемый обменом H – D или H / D) - это химическая реакция, в которой ковалентно связанный атом водорода заменяется атомом дейтерия или наоборот. Его проще всего применить к обмениваемым протонам и дейтронам, где такое превращение происходит в присутствии подходящего источника дейтерия без какого-либо катализатора. Использование кислотных, основных или металлических катализаторов в сочетании с условиями повышенной температуры и давления может облегчить обмен незаменяемыми атомами водорода, если субстрат устойчив к условиям и используемым реагентам. Это часто приводит к пердейтерированию: обмену между водородом и дейтерием всех необмениваемых атомов водорода в молекуле.

Примером обмениваемых протонов, которые обычно исследуют таким образом, являются протоны амидов в основной цепи белка . Метод дает информацию о доступности растворителя для различных частей молекулы и, следовательно, о третичной структуре белка. Теоретическая основа для понимания водородного обмена в белках была впервые описана Каем Ульриком Линдерстрём-Лангом, и он был первым, кто применил обмен H / D для изучения белков.

Обменная реакция

В протонном растворе обмениваемые протоны, такие как протоны в гидроксильной или аминогруппе, обмениваются протонами с растворителем . Если D ₂ O является растворителем, дейтроны будут включены в эти положения. За реакцией обмена можно следить, используя множество методов (см. Обнаружение). Поскольку этот обмен является равновесной реакцией, молярное количество дейтерия должно быть высоким по сравнению с обмениваемыми протонами субстрата. Например, дейтерий добавляют к белку в H ₂ O путем разбавления раствора H ₂ O D ₂ O (например, в десять раз). Обычно обмен осуществляется при физиологическом pH (7,0–8,0), когда белки находятся в своем наиболее естественном ансамбле конформационных состояний.

Реакция обмена H / D может также катализироваться кислотными, основными или металлическими катализаторами, такими как платина. Для амидных атомов водорода основной цепи белков минимальная скорость обмена наблюдается в среднем при pH 2,6. Выполняя обмен при нейтральном pH и затем быстро меняя pH, скорости обмена амидных водородов основной цепи можно резко замедлить или погасить . PH, при котором реакция гасится, зависит от метода анализа. Для обнаружения с помощью ЯМР значение pH можно довести до 4,0–4,5. Для обнаружения с помощью масс-спектрометрии значение pH снижают до минимума кривой обмена, pH 2,6. В самом простом эксперименте реакции дают возможность протекать в течение заданного времени, прежде чем ее гасят.

Паттерн дейтерирования молекулы, подвергшейся H / D обмену, может сохраняться в апротонных средах. Однако некоторые методы анализа дейтерирования таких молекул, как белки, выполняются в водном растворе, что означает, что обмен будет продолжаться с медленной скоростью даже после того, как реакция будет погашена. Нежелательный дейтерий-водородный обмен называется обратным обменом, и для его исправления были разработаны различные методы.

Обнаружение

Обмен H – D был первоначально измерен отцом водородного обмена Каем Ульриком Линдерстрём-Лангом с использованием трубок для градиента плотности. В наше время обмен H – D в основном контролируется методами: спектроскопии ЯМР , масс-спектрометрии и нейтронной кристаллографии . У каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки.

ЯМР-спектроскопия

Ядра водорода и дейтерия сильно различаются по своим магнитным свойствам. Таким образом, их можно различить с помощью ЯМР-спектроскопии . Дейтроны не будут наблюдаться в спектре ¹ H ЯМР, и, наоборот, протоны не будут наблюдаться в спектре ² H ЯМР. Если в ¹ H ЯМР-спектре сильно дейтерированного образца наблюдаются небольшие сигналы , они называются остаточными сигналами. Их можно использовать для расчета уровня дейтерирования в молекуле. Аналогичные сигналы не наблюдаются в спектрах ² H ЯМР из-за низкой чувствительности этого метода по сравнению с ¹ H анализом. Дейтроны обычно демонстрируют очень похожие химические сдвиги с аналогичными протонами. Анализ с помощью ¹³ С - ЯМР - спектроскопии также возможно: различные значения спинов водорода ( ¹ / ₂ ) и дейтерия (1) приводит к различным расщепляющих кратностей. ЯМР-спектроскопия может использоваться для определения сайт-специфичного дейтерирования молекул.

Другой метод использует спектры HSQC. Обычно спектры HSQC записываются в серию моментов времени, когда водород обменивается с дейтерием. Поскольку эксперимент HSQC специфичен для водорода, сигнал будет экспоненциально затухать по мере обмена водорода. Затем можно подобрать экспоненциальную функцию к данным и получить константу обмена. Этот метод дает остаточную -специфические информацию для всех остатков в белке одновременно Основной недостатком является то , что он требует предварительного назначения спектра для рассматриваемого белка. Это может быть очень трудоемким и обычно ограничивает метод белками менее 25 кДа . Поскольку для записи спектра HSQC требуются от нескольких минут до часов, амиды с быстрым обменом должны быть измерены с использованием других последовательностей импульсов.

Масс-спектрометрии

Иллюстрация экспериментального рабочего процесса по обмену водород / дейтерий, измеренному с помощью масс-спектрометрии (HDX-MS). Черная волнистая линия представляет собой основу белка. Синяя буква « H » обозначает атомы водорода, связанные в амидах основной цепи, красная буква « D » обозначает дейтерий, связанный в амидах основной цепи. Сверху насыщенный водородом белковый раствор разбавляется концентрированным оксидом дейтерия, после чего водород, содержащийся в амидах основной цепи, будет обмениваться на дейтерий из раствора. В обычные моменты времени (t ₁ -t ₄ ) реакцию обмена гасят подкислением и охлаждением. Затем полученный образец белка можно подвергнуть перевариванию и обессоливанию, а иногда и газофазной фрагментации. Если белок был переварен, полученные пептиды разделяют с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС). Для каждой временной точки, включая недейтерированный контроль (t ₀ ), измеряют среднюю массу каждого пептида. Затем, хотя это и не является общепринятой практикой, можно подвергнуть каждый аналит фрагментации, чтобы сублокализовать содержащийся водород и дейтерий. Чтобы упростить интерпретацию, здесь в спектре МС / МС показаны только ионы c-типа. Однако можно наблюдать и другие типы фрагментных ионов.

Масс-спектрометрия с водородно-дейтериевым обменом может определить общее содержание дейтерия в молекулах, подвергшихся обмену H / D. Из-за того, что требуется подготовка образца, обычно считается, что он обеспечивает точное измерение только незаменяемых атомов водорода. Он также может включать обмен H / D в газовой фазе или фазовый обмен раствора перед ионизацией. Он имеет несколько преимуществ в ЯМР-спектроскопии по сравнению с анализом реакций обмена H – D: требуется гораздо меньше материала, концентрация образца может быть очень низкой (всего 0,1 мкМ), предел размера намного больше, и данные могут быть обычно собираются и интерпретируются гораздо быстрее.

Ядро дейтерия вдвое тяжелее ядра водорода, потому что оно содержит нейтрон, а также протон. Таким образом, молекула, содержащая некоторое количество дейтерия, будет тяжелее, чем молекула, содержащая весь водород. По мере того, как белок становится все более дейтерированным, молекулярная масса соответственно увеличивается. Обнаружение изменения массы белка при дейтерировании стало возможным благодаря современной масс-спектрометрии белков, о которой впервые сообщили в 1991 году Катта и Чайт.

Определение сайт-специфического дейтерирования с помощью масс-спектрометрии более сложно, чем с помощью ЯМР-спектроскопии. Например, местоположение и относительное количество обмена дейтерия вдоль пептидного остова можно приблизительно определить, подвергая белок протеолизу после того, как реакция обмена была погашена. Затем отдельные пептиды анализируют на общую дейтерированность каждого пептидного фрагмента. При использовании этого метода разрешение обмена дейтерия определяется размером пептидов, образующихся в процессе пищеварения. Пепсин , кислотная протеаза , обычно используется для протеолиза, поскольку во время протеолитической реакции необходимо поддерживать pH гашения. Чтобы свести к минимуму обратный обмен, протеолиз и последующий масс-спектрометрический анализ должны выполняться как можно быстрее. ВЭЖХ- разделение пептического гидролизата часто проводят при низкой температуре непосредственно перед масс-спектрометрией с электрораспылением, чтобы минимизировать обратный обмен. Совсем недавно UPLC стал использоваться из-за его превосходных возможностей разделения.

В 1999 году было предложено достичь разрешения по одному остатку с помощью фрагментации дейтерированных пептидов, индуцированной столкновениями (CID), в сочетании с тандемной масс-спектрометрией . Вскоре было обнаружено, что CID вызывает «скремблирование» положения дейтерия в пептидах. Однако фрагментация, вызванная распадом MALDI в источнике (ISD), диссоциацией с захватом электронов (ECD) и диссоциацией с переносом электрона (ETD), протекает с небольшим скремблированием или без него в правильных экспериментальных условиях. Скремблирование изотопного мечения вызывается столкновительным нагревом перед диссоциацией иона, и хотя CID действительно вызывает скремблирование, столкновительный нагрев также может происходить во время ионизации и переноса ионов. Однако путем тщательной оптимизации параметров прибора, которые вызывают нагрев ионов, водородное скремблирование может быть минимизировано до степени, которая сохраняет изотопное мечение в фазе раствора до тех пор, пока фрагментация не может быть выполнена с использованием техники, в которой скремблирование не происходит. Совсем недавно ультрафиолетовая фотодиссоциация (УФФД) также была исследована как возможный метод фрагментации для локализации дейтерия внутри пептидов и белков. В этом отношении выводы были неоднозначными, хотя можно получить фрагменты UVPD, которые не подвергались скремблированию при определенных условиях, другие показали, что скремблирование может происходить как для пептидов, так и для белков во время самой стадии фрагментации UVPD. Теория, объединяющая эти очевидные противоречия, имеет отношение к пути двойной фрагментации, который может возникнуть в результате УФ-облучения пептидов и белков, то есть прямой и статистической диссоциации. То есть, если экспериментальные условия благоприятствуют прямой диссоциации и ион-предшественник сохраняется при низких внутренних энергиях до и во время фрагментации, уровень дейтерия в полученных фрагментах будет соответствовать незашифрованному предшественнику. Однако экспериментальные условия могут способствовать статистической диссоциации во время УФ-облучения, особенно при длительном облучении и низком давлении газа, что приводит к внутреннему преобразованию энергии электронного возбуждения, вносимой УФ-фотонами. Результатом является колебательное возбуждение облучаемой молекулы, которая, в свою очередь, претерпевает скремблирование.

Нейтронная кристаллография

Водород-дейтериевый обмен быстро обменивающихся частиц (например, гидроксильных групп) можно измерить с атомным разрешением количественно с помощью нейтронной кристаллографии и в реальном времени, если обмен проводится во время дифракционного эксперимента.

Пучки нейтронов высокой интенсивности обычно генерируются отколом на линейных ускорителях частиц, таких как источник нейтронов отщепления . Нейтроны дифрагируют кристаллы подобно рентгеновским лучам и могут использоваться для определения структуры. Атомы водорода с числом электронов от одного до нуля в биологических условиях плохо дифрагируют рентгеновские лучи и практически невидимы в нормальных экспериментальных условиях. Нейтроны рассеиваются от атомных ядер и, следовательно, способны обнаруживать атомы водорода и дейтерия.

Атомы водорода обычно заменяются дейтерием, что приводит к сильному положительному коэффициенту рассеяния. Часто достаточно заменить только растворитель и лабильные атомы водорода в кристалле белка диффузией пара. В такой структуре степень заполнения обмениваемого атома дейтерия в кристалле будет уменьшаться от 0 до 100%, что напрямую определяет количество обмена.

Приложения

Рассеяние нейтронов

Пердейтерирование одного компонента многокомпонентной системы может обеспечить контраст для экспериментов по рассеянию нейтронов , где контраст, полученный с использованием дейтерированных растворителей, недостаточен.

Белковая структура

Невозможно определить структуру белка с обменом H / D, кроме нейтронной кристаллографии, а также невозможно определить вторичные структурные элементы. Причины этого связаны с тем, как структура белка замедляет обмен. Скорость обмена зависит от двух параметров: доступности растворителя и водородных связей. Таким образом, амид, который является частью внутримолекулярной водородной связи, будет обмениваться медленно, если вообще будет, тогда как амид на поверхности белка, водородно связанного с водой, будет обмениваться быстро. Амиды, захороненные в растворителе, но не связанные водородными связями, также могут иметь очень низкую скорость обмена. Поскольку и доступность растворителя, и водородная связь влияют на скорость обмена, становится трудно приписать данную скорость обмена структурному элементу без кристаллографии или структурных данных ЯМР.

Обмен H – D был использован для характеристики пути сворачивания белков путем рефолдинга белка в условиях обмена. В эксперименте по прямому обмену (с H на D) импульс дейтерия добавляется после различного количества времени рефолдинга. Части структуры, которые образуются быстро, будут защищены и, таким образом, не будут заменены, тогда как области, которые складываются в конце пути, будут подвергаться обмену в течение более длительных периодов времени. Таким образом, обмен H / D может использоваться для определения последовательности различных событий сворачивания. Факторами, определяющими временное разрешение этого подхода, являются эффективность смешивания и то, как быстро можно выполнить резкое охлаждение после этикетирования.

Обмен H – D был использован для характеристики белковых структур и межбелковых взаимодействий. Реакцию обмена необходимо проводить с изолированными белками и с комплексом. Затем сравниваются обменивающиеся регионы. Если область скрыта за счет связывания, амиды в этой области могут быть защищены в комплексе и обмениваться медленно. Однако необходимо иметь в виду, что обмен H – D не может быть использован для определения границ связывания для всех взаимодействий белок-белок. Некоторые белок-белковые взаимодействия управляются электростатическими силами боковых цепей и вряд ли изменят скорость обмена амидных водородов основной цепи, особенно если амидные водороды расположены в стабильных структурных элементах, таких как альфа-спирали .

Наконец, обмен H – D можно использовать для мониторинга конформационных изменений в белках, поскольку они связаны с функцией белка. Если конформация изменена в результате посттрансляционной модификации , активации фермента, связывания лекарственного средства или других функциональных событий, вероятно, произойдет изменение обмена H / D, которое может быть обнаружено.

HDXsite (онлайн-сервер)

HDXsite - это онлайн-веб-сервер, который включает в себя некоторые приложения, такие как HDX modeller, повышающие разрешение экспериментальных данных HDX и моделирующие факторы защиты для отдельных остатков. ( https://hdxsite.nms.kcl.ac.uk/ )

Рекомендации

дальнейшее чтение