Пероксидаза хрена - Horseradish peroxidase

Пероксидаза хрена
HRP-xray.png
Пероксидаза хрена C1
Идентификаторы
Организм Арморация деревенская
Условное обозначение Пероксидаза C1A
Альт. символы PRXC1A
PDB 1W4W Другие конструкции
UniProt P00433
Прочие данные
Номер ЕС 1.11.1.7

Фермент пероксидаза хрена ( HRP ), найденный в корнях хрена , широко используются в биохимии приложениях. Это металлофермент с множеством изоформ, из которых наиболее изучен тип C. Он катализирует окисление различных органических субстратов перекисью водорода.

Состав

Структура фермента была впервые решена с помощью рентгеновской кристаллографии в 1997 году и с тех пор несколько раз решалась с использованием различных субстратов. Это большой альфа-спиральный гликопротеин, который связывает гем в качестве окислительно-восстановительного кофактора .

Субстраты

Сам по себе фермент HRP или его конъюгаты не представляют большой ценности; его присутствие необходимо сделать видимым с помощью субстрата, который при окислении HRP с использованием перекиси водорода в качестве окислителя дает характерное изменение цвета, которое можно обнаружить спектрофотометрическими методами.

Были описаны и коммерциализированы многочисленные субстраты для пероксидазы хрена с целью использования желательных свойств HRP. Эти субстраты делятся на несколько различных категорий. HRP катализирует превращение хромогенных субстратов (например, TMB , DAB , ABTS ) в окрашенные продукты и производит свет при воздействии на хемилюминесцентные субстраты (например, усиленная хемилюминесценция люминолом ).

Некоторые из наиболее распространенных хромогенных субстратов HRP. Люминол является исключением, поскольку он не является хромофором, и свет генерируется после реакции, катализируемой HRP.

Приложения

Пероксидаза хрена представляет собой гликопротеин массой 44 173,9 дальтон с 6 остатками лизина, который может быть конъюгирован с меченой молекулой. Он производит окрашенное, флуориметрическое или люминесцентное производное меченой молекулы при инкубации с подходящим субстратом, что позволяет его обнаруживать и количественно определять. HRP часто используется в конъюгатах (молекулах, которые были соединены генетически или химически) для определения присутствия молекулярной мишени. Например, антитело, конъюгированное с HRP, можно использовать для обнаружения небольшого количества определенного белка при вестерн-блоттинге . Здесь антитело обеспечивает специфичность для определения местоположения интересующего белка, а фермент HRP в присутствии субстрата вырабатывает детектируемый сигнал. Пероксидаза хрена также широко используется в таких методах, как ELISA и иммуногистохимия, из-за ее мономерной природы и легкости получения окрашенных продуктов. Пероксидаза, гемсодержащая оксидоредуктаза, является коммерчески важным ферментом, который катализирует восстановительное расщепление пероксида водорода донором электронов.

Пероксидаза хрена во многих отношениях идеальна для этих целей, потому что она меньше, стабильнее и дешевле, чем другие популярные альтернативы, такие как щелочная фосфатаза . Он также имеет высокую скорость оборота, что позволяет генерировать сильные сигналы за относительно короткий промежуток времени. Высокие концентрации фосфата серьезно снижают стабильность пероксидазы хрена. Помимо биомедицинских применений, пероксидаза хрена является одним из ферментов, важных для окружающей среды. Этот фермент подходит для удаления гидроксилированных ароматических соединений (HAC), которые считаются основными загрязнителями в самых разных промышленных сточных водах.

Более того, «в последние годы техника маркировки нейронов ферментом пероксидазой хрена стала основным инструментом. За свою короткую историю этот метод, вероятно, использовался большим количеством нейробиологов, чем краситель Гольджи с момента его открытия в 1870 году».

Усиленная хемилюминесценция (ECL)

Основная статья: Хемилюминесценция

Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола до 3-аминофталата через несколько промежуточных соединений. Реакция сопровождается испусканием света низкой интенсивности на длине волны 428 нм. Однако в присутствии определенных химических веществ излучаемый свет усиливается до 1000 раз, что облегчает обнаружение света и повышает чувствительность реакции. Увеличение светового излучения называется усиленной хемилюминесценцией (ECL). Можно использовать несколько усилителей, таких как общеизвестные модифицированные фенолы (в основном йодфенол). Однако на рынке есть несколько субстратов, в которых используются другие усилители, которые дают люминесцентные сигналы в 13 раз больше, чем субстраты, усиленные фенолом. Интенсивность света является мерой количества реагирующих молекул фермента и, следовательно, количества гибрида. ECL прост в настройке и является чувствительным, обнаруживая около 0,5 мкг нуклеиновой кислоты в Саузерн-блотах и в Нозерн-блотах . Обнаружение на хемилюминесцентных субстратах имеет ряд преимуществ перед хромогенными субстратами. Чувствительность в 10–100 раз выше, и количественное определение светового излучения возможно в широком динамическом диапазоне, тогда как для окрашенных выделений это гораздо более ограничено, примерно на порядок меньше. При использовании хемилюминесцентных подложек очистить фильтры намного проще.

Имитирует HRP

Было исследовано множество материалов, имитирующих естественный HRP. Например, наночастицы оксида железа и гемина -содержащих комплексы были использованы для имитации HRP. Эти HRP-подобные искусственные ферменты используются во многих областях, от обнаружения биомаркеров и иммуноокрашивания опухолей до образования антибиообрастания.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки