Нозерн-блот - Northern blot
Нозерн - блот , или РНК - блот, является метод , используемый в молекулярной биологии исследований для изучения экспрессии генов путем детекции РНК (или изолированных мРНК ) в образце.
С помощью Нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией, определяя частоту экспрессии конкретных генов во время дифференцировки и морфогенеза , а также в аномальных или болезненных условиях. Нозерн-блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и детекцию гибридизационным зондом, комплементарным части или всей целевой последовательности. Термин «нозерн-блот» на самом деле относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют Нозерн-блоттингом. Техника северного блоттинга была разработана в 1977 году Джеймсом Алвином, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком из Стэнфордского университета . Нозерн-блоттинг получил свое название от сходства с первым методом блоттинга - саузерн-блоттингом , названным в честь биолога Эдвина Саузерна . Основное отличие состоит в том, что в Нозерн-блоте анализируется скорее РНК, чем ДНК .
Процедура
Общая процедура блоттинга начинается с извлечения общей РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем мРНК эукариот можно выделить с помощью хроматографии на олиго (dT) целлюлозе, чтобы выделить только те РНК с поли (A) хвостом . Затем образцы РНК разделяют гель-электрофорезом. Поскольку гели хрупкие и зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносятся на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.
Нейлоновая мембрана с положительным зарядом является наиболее эффективной для использования в Нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к ним. Буфер для переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид, поскольку он снижает температуру отжига взаимодействия зонд-РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. После того, как РНК была перенесена на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-света или тепла. После того, как зонд был помечен, он гибридизируется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, которые могут влиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований. Мембрану промывают, чтобы обеспечить специфическое связывание зонда и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Затем гибридные сигналы обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно определены денситометрией . Для создания контролей для сравнения в Нозерн-блоте образцы, не отображающие интересующий генный продукт, можно использовать после определения с помощью микрочипов или ОТ-ПЦР .
Гели
Образцы РНК чаще всего разделяют на агарозных гелях, содержащих формальдегид в качестве денатурирующего агента для РНК, ограничивающего вторичную структуру. Гели можно окрашивать бромистым этидием (EtBr) и рассматривать в ультрафиолетовом свете для определения качества и количества РНК перед блоттингом. Электрофорез в полиакриламидном геле с мочевиной также можно использовать для разделения РНК, но чаще всего он используется для фрагментированных РНК или микроРНК. Лестницу РНК часто проводят рядом с образцами на геле для электрофореза, чтобы наблюдать размер полученных фрагментов, но в образцах общей РНК субъединицы рибосом могут действовать как маркеры размера. Поскольку большая рибосомная субъединица - это 28S (приблизительно 5kb), а малая рибосомная субъединица - это 18S (приблизительно 2kb), на геле появляются две заметные полосы, большая примерно в два раза интенсивнее меньшей.
Зонды
Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной всей или части интересующей РНК, они могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотидами с минимум 25 основаниями, комплементарными целевой последовательности. Зонды РНК (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая некоторый фоновый шум. Обычно кДНК создают с помощью меченых праймеров для интересующей последовательности РНК, чтобы действовать как зонд в нозерн-блоттинге. Зонды должны быть помечены либо радиоактивными изотопами ( 32 P), либо хемилюминесценцией, при которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP) разрушают хемилюминесцентные субстраты, вызывая обнаруживаемое излучение света. Хемилюминесцентное мечение может происходить двумя способами: либо зонд прикреплен к ферменту, либо зонд помечен лигандом (например, биотином ), для которого лиганд (например, авидин или стрептавидин ) присоединен к ферменту (например, HRP). . Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, потому что они быстрее, более чувствительны и уменьшают опасность для здоровья, связанную с радиоактивными метками. Одну и ту же мембрану можно исследовать до пяти раз без значительной потери целевой РНК.
Приложения
Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать характер экспрессии определенного гена между тканями, органами, стадиями развития, уровнями экологического стресса, инфекцией патогена и в ходе лечения. Этот метод был использован для демонстрации сверхэкспрессии онкогенов и подавления экспрессии генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальной» тканью, а также экспрессии генов при отторжении трансплантированных органов. Если повышенная регуляция гена наблюдается по обилию мРНК на нозерн-блоте, образец можно затем секвенировать, чтобы определить, известен ли ген исследователям или это новое открытие. Паттерны экспрессии, полученные в данных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, разница в уровне каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предлагая альтернативные продукты сплайсинга одного и того же гена или повторяющиеся мотивы последовательностей. Различия в размере продукта гена также могут указывать на делеции или ошибки в обработке транскриптов. Изменяя зонд-мишень, используемый вдоль известной последовательности, можно определить, какая область РНК отсутствует.
Преимущества и недостатки
Анализ экспрессии генов может быть выполнен несколькими различными методами, включая ОТ-ПЦР, анализы защиты от РНКаз, микроматрицы, RNA-Seq , серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг. Микроматрицы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью Нозерн-блотов; однако иногда нозерн-блоттинг может обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, которые не могут быть обнаружены с помощью микрочипов. Преимущество микроматриц перед нозерн-блоттингом состоит в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, в то время как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов.
Проблема в северном блоттинга часто образец деградация с помощью РНКазов (как эндогенная к образцу и через загрязнение окружающей среды), в котором можно избежать пути надлежащей стерилизации стеклянной посуды и применением ингибиторов РНКазов , такие как DEPC ( диэтилпирокарбонат ). Химические вещества, используемые в большинстве северных пятен, могут представлять опасность для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивный материал, бромид этидия, DEPC и УФ-свет вредны при определенных воздействиях. По сравнению с ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг имеет низкую чувствительность, но он также обладает высокой специфичностью, что важно для уменьшения количества ложноположительных результатов.
Преимущества использования Нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение за альтернативными продуктами сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле до блоттинга, а мембраны можно хранить. и осуждался годами после промокания.
Для Нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК ацетилхолинэстеразы нерадиоактивный метод сравнивали с радиоактивным, и было обнаружено, что он такой же чувствительный, как и радиоактивный, но не требует защиты от излучения и занимает меньше времени.
Обратное северное пятно
Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блот. В этой процедуре нуклеиновая кислота субстрата (которая прикреплена к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд представляет собой РНК, извлеченную из ткани и радиоактивно помеченную. Использование ДНК-микрочипов, которые получили широкое распространение в конце 1990-х - начале 2000-х годов, больше похоже на обратную процедуру, поскольку они включают использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, изготовленным из клеточной РНК. . Таким образом, обратная процедура, хотя изначально необычная, позволила северному анализу развиться в профилирование экспрессии генов , при котором можно отслеживать экспрессию многих (возможно, всех) генов в организме.
Смотрите также
- Вестерн-блоттинг
- Восточная клякса
- Северо-западное пятно
- Дальневосточная клякса
- Дальневосточный блот
- Дифференциальный дисплей
использованная литература
внешние ссылки
|
Ресурсы библиотеки о Нозерн-блоте |