Гетероядерная одноквантовая когерентная спектроскопия - Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy
Гетероядерной одной квантовой когерентности или гетероядерной одной квантовой корреляции эксперимент, как правило , сокращенно HSQC , часто используется в ЯМР - спектроскопии органических молекул и имеет особое значение в области ЯМР белка . Эксперимент был впервые описан Джеффри Боденхаузеном и DJ Рубеном в 1980 году. Полученный спектр является двумерным (2D) с одной осью для протона ( 1 H), а другой - для гетероядра ( атомного ядра, отличного от протона), который как правило , 13 С или 15 Н . Спектр содержит пик для каждого уникального протона, присоединенного к рассматриваемому гетероядру. 2D HSQC также можно комбинировать с другими экспериментами в экспериментах с ЯМР более высокой размерностью, такими как NOESY-HSQC или TOCSY-HSQC.
Общая схема
Эксперимент HSQC представляет собой высокочувствительный 2D-ЯМР- эксперимент и впервые был описан в системе 1 H — 15 N, но также применим к другим ядрам, таким как 1 H — 13 C и 1 H — 31 P. Основная схема этого Эксперимент включает в себя передачу намагниченности протона второму ядру, которая может составлять 15 Н, 13 C или 31 P, через этап INEPT (нечувствительные ядра, усиленные передачей поляризации). После временной задержки ( t 1 ) намагниченность передается обратно протону через этап ретро-INEPT, и затем сигнал записывается. В HSQC записывается серия экспериментов, в которых увеличивается время задержки t 1 . 1 сигнал Н обнаруживается в непосредственно измеренного измерения в каждом эксперименте, в то время как химический сдвиг в 15 N или 13 C, записывается в косвенном измерении , который образуется из серии экспериментов.
HSQC в белковом ЯМР
1 H— 15 Н HSQC
15 Н HSQC эксперимент является одним из наиболее часто регистрируемых в экспериментах ЯМР белка. Эксперимент HSQC может быть выполнен с использованием природного изотопа 15 N , но обычно для белкового ЯМР используются белки, меченные изотопами. Такие меченые белки обычно получают путем экспрессии белка в клетках, выращенных в 15 N-меченых средах.
Каждый остаток от белка , за исключением пролина , имеет амидный протон , прикрепленный к азоту в пептидной связи . HSQC обеспечивает корреляцию между протоном азота и амида, и каждый амид дает пик в спектрах HSQC. Следовательно, каждый остаток (кроме пролина) может давать наблюдаемый пик в спектрах, хотя на практике не все пики всегда видны из-за ряда факторов. Обычно N-концевой остаток (к которому присоединена группа NH 3 + ) трудно наблюдать из-за обмена с растворителем. В дополнение к резонансам амида основной цепи, боковые цепи с протонами, связанными с азотом, также будут давать пики.
В типичном спектре HSQC пики NH 2 от боковых цепей аспарагина и глутамина появляются в виде дублетов в верхнем правом углу, а меньший пик может появляться на вершине каждого пика из-за обмена дейтерия из D 2 O, обычно добавляемого к Образец ЯМР, придающий этим пикам боковой цепи характерный вид. Пики аминов боковой цепи триптофана обычно смещены в нижнее поле и появляются в нижнем левом углу. Пики амида основной цепи глицина обычно появляются в верхней части спектра.
15 Н HSQC , как правило , первый гетероядерной спектр приобретенным для назначения резонансов , где каждый пик амида назначаются для конкретного остатка в белке. Если белок свернут, пики обычно хорошо диспергированы, и можно различить большинство индивидуальных пиков. Если в середине спектра имеется большой кластер сильно перекрывающихся пиков, это может указывать на присутствие значительных неструктурированных элементов в белке. В таких случаях, когда имеется сильное перекрытие резонансов, отнесение резонансов в спектрах может быть затруднено. Назначение спектра HSQC требует других экспериментов, в идеале с использованием экспериментов с тройным резонансом с белками, меченными 15 N и 13 C, которые обеспечивают последовательную связь между остатками, так что резонансы могут быть связаны с конкретными остатками и последовательно назначены. Назначение спектра важно для осмысленной интерпретации более сложных экспериментов ЯМР, таких как определение структуры и релаксационный анализ.
Химические вещества, меченные изотопом 15 N , относительно недороги, а 15 N HSQC - чувствительный эксперимент, благодаря которому спектр может быть получен за относительно короткое время, поэтому 15 N HSQC часто используется для отбора кандидатов на их пригодность для определения структуры с помощью ЯМР. , а также оптимизация условий выборки. Длительный процесс определения структуры обычно не предпринимается, пока не будет получен хороший спектр HSQC. Эксперимент HSQC также полезен для обнаружения границы связывания во взаимодействии белок-белок, а также взаимодействий с лигандами, такими как лекарства. Сравнивая HSQC свободного белка с белком, связанным с лигандом, можно наблюдать изменения химических сдвигов некоторых пиков, и эти пики, вероятно, лежат на поверхности связывания, где связывание нарушает их химические сдвиги. 15 Н HSQC также может быть использован при анализе релаксации в исследованиях молекулярной динамики белков, определения константы ионизации и других исследований.
1 H— 13 C HSQC
Этот эксперимент обеспечивает корреляцию между углеродом и присоединенными к нему протонами. Обычно используется версия 1 H– 13 C HSQC с постоянным временем (CT), поскольку она позволяет обойти проблему расщепления сигнала из-за гомоядерных связей 13 C– 13 C J, что снижает спектральное разрешение. «Постоянное время» относится ко всему периоду эволюции между двумя этапами INEPT, который поддерживается постоянным в этом эксперименте. Если этот период эволюции установлен как обратный константе J-связи , то знак намагниченности этих атомов углерода с нечетным числом присоединенных алифатических атомов углерода будет противоположен знакам намагниченности с четным числом. Например, если С β из лейцина появляется в качестве положительного пика (прилагается 2 алифатические атомы углерода), то С γ (3 алифатических атомов углерода присоединен) и С & alpha ; (1 алифатические атомы углерода , присоединенные) представляется отрицательным.
HSQC в липидном ЯМР
1 H— 31 P HSQC
Использование 1 H- 31 P HSQC относительно редко в липидомике, однако использование 31 P в липидомике восходит к 1990-м годам. Использование этого метода ограничено в отношении масс-спектрометрии из-за того, что для него требуется гораздо больший размер образца, однако комбинация 1 H- 31 P HSQC с масс-спектрометрией рассматривается как основательный подход к липидомике и методам «двойной спектроскопии». становятся доступными.
Смотрите также
Рекомендации
Общие ссылки
- ЯМР-спектроскопия белков: принципы и практика (1995) Джон Кавана, Уэйн Дж. Фэйрбротер, Артур Г. Палмер III, Николас Дж. Скелтон, Academic Press