Направленная дифференциация - Directed differentiation

Направленный дифференциации является биоинженерии методология на стыке биологии стволовых клеток , биологии развития и тканевой инженерии . По сути, это использование потенциала стволовых клеток путем ограничения их дифференциации in vitro в направлении определенного типа клеток или представляющих интерес тканей . Стволовые клетки по определению плюрипотентны , способны дифференцироваться на несколько типов клеток, таких как нейроны , кардиомиоциты , гепатоциты и т. Д. Эффективная направленная дифференцировка требует детального понимания клонов и решения судьбы клеток , что часто обеспечивается биологией развития.

Концептуальная рамка

Во время дифференцировки плюрипотентные клетки принимают ряд решений, связанных с развитием, для создания первых трех зародышевых слоев ( эктодермы , мезодермы и энтодермы ) эмбриона и промежуточных предшественников, за которыми следуют последующие решения или контрольные точки, дающие начало всем зрелым тканям организма. Процесс дифференциации можно смоделировать как последовательность бинарных решений на основе вероятностных или стохастических моделей. Биология развития и эмбриология дают базовые знания о дифференциации типов клеток посредством анализа мутаций , отслеживания клонов, микроманипуляций с эмбрионами и исследований экспрессии генов . Дифференцировка клеток и органогенез тканей включают ограниченный набор сигнальных путей развития . Таким образом, возможно управлять судьбой клеток, контролируя решения клеток посредством внеклеточной передачи сигналов, имитируя сигналы развития.

Исходный материал

Направленная дифференцировка в первую очередь применяется к плюрипотентным стволовым клеткам (PSC) происхождения млекопитающих, в частности к клеткам мыши и человека, для биомедицинских исследований . С момента открытия эмбриональных стволовых (ES) клеток (1981) и индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток (2006) исходный материал потенциально неограничен. Исторически также использовались клетки эмбриональной карциномы (ЕС). Фибробласты или другие типы дифференцированных клеток использовались для стратегий прямого репрограммирования .

Методы

Дифференцировка клеток включает переход от пролиферативного режима к режиму дифференцировки. Направленная дифференцировка заключается в имитации решений, связанных с развитием (развитием эмбриона) in vitro, с использованием стволовых клеток в качестве исходного материала. Для этой цели плюрипотентные стволовые клетки (PSC) культивируют в контролируемых условиях с участием определенного субстрата или внеклеточных матриц, способствующих клеточной адгезии и дифференцировке, и определяют состав культуральной среды . Ограниченное количество сигнальных факторов, таких как факторы роста или небольшие молекулы , контролирующие дифференцировку клеток, применяют последовательно или комбинаторным образом с различными дозировками и временем воздействия. Правильная дифференциация интересующего типа клеток подтверждается путем анализа маркеров конкретных типов клеток , профиля экспрессии генов и функциональных анализов.

Ранние методы

поддерживающие клетки и матрицы обеспечивают сигналы окружающей среды, подобные развитию.

  • Формирование трехмерных клеточных агрегатов, называемых эмбриоидными тельцами (ЭТ): агрегаты стремятся имитировать раннее эмбриональное развитие и инструктировать дифференцировку клеток.
  • посев в присутствии фетальной бычьей сыворотки , удаление факторов плюрипотентности.

Текущие методологии

Направленная дифференциация

Этот метод заключается в воздействии на клетки специфических модуляторов сигнальных путей и манипулировании условиями культивирования клеток (экологическими или экзогенными) для имитации естественной последовательности решений, связанных с развитием, для получения данного типа клеток / тканей. Недостатком этого подхода является необходимость хорошо понимать, как формируется интересующий тип клеток.

Прямое перепрограммирование

Этот метод, также известный как трансдифференцировка или прямое преобразование, заключается в сверхэкспрессии одного или нескольких факторов, обычно факторов транскрипции, введенных в клетки. Исходным материалом могут быть либо плюрипотентные стволовые клетки (PSC), либо дифференцированный тип клеток, например фибробласты. Принцип был впервые продемонстрирован в 1987 году с миогенными факторами MyoD. Недостатком этого подхода является введение чужеродной нуклеиновой кислоты в клетки и принудительная экспрессия факторов транскрипции, эффекты которых полностью не изучены.

Отбор по линии / типу клеток

Этот метод заключается в выборе интересующего типа клеток, обычно с устойчивостью к антибиотикам . С этой целью клетки исходного материала модифицируют, чтобы они содержали кассету устойчивости к антибиотикам под промотором, специфичным для определенного типа клеток-мишеней . Только клетки, преданные интересующей линии, выживают при отборе .

Приложения

Направленная дифференцировка обеспечивает потенциально неограниченный и управляемый источник клеток и тканей. Некоторым применениям мешает незрелый фенотип типа клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток (PSC), что ограничивает возможные физиологические и функциональные исследования. Возникло несколько прикладных областей:

Модельная система для фундаментальной науки

Для фундаментальной науки , в частности биологии развития и клеточной биологии , клетки , производные от PSC, позволяют изучать на молекулярном и клеточном уровнях фундаментальные вопросы in vitro, которые в противном случае было бы чрезвычайно трудно или невозможно изучить по техническим и этическим причинам in vivo, например, эмбриональный. развитие человека. В частности, дифференцирующиеся клетки поддаются количественным и качественным исследованиям. Более сложные процессы также могут быть изучены in vitro, и описано образование органоидов, включая цереброиды, глазной бокал и почки .

Открытие лекарств и токсикология

Типы клеток, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), оцениваются в качестве доклинических моделей заболеваний человека in vitro. Типы человеческих клеток в чашке представляют собой альтернативу традиционным доклиническим исследованиям с использованием иммортализованных клеток животных, человека или первичных культур из биопсий , которые имеют свои ограничения. Клинически значимые типы клеток, то есть типы клеток, пораженные болезнями, являются основным объектом исследований, включая гепатоциты , бета-клетки островков Лангерганса , кардиомиоциты и нейроны . Скрининг лекарств выполняется на миниатюрных клеточных культурах в многолуночных планшетах или на чипе.

Моделирование заболеваний

Клетки, полученные от пациентов, используются in vitro для воссоздания конкретных патологий. В основе модели лежит конкретный тип клеток, пораженный патологией. Например, мотонейроны используются для изучения спинальной мышечной атрофии (СМА), а кардиомиоциты - для изучения аритмии . Это может позволить лучше понять патогенез и разработку новых методов лечения через открытие лекарств. Незрелые клетки, происходящие из PSC, могут созревать in vitro с помощью различных стратегий, таких как старение in vitro , для моделирования возрастного заболевания in vitro. Основными заболеваниями, моделируемыми клетками, происходящими из PSC, являются боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), синдром ломкой Х-хромосомы (FXS), болезнь Хантингтона (HD), синдром Дауна , спинальная мышечная атрофия (SMA), мышечные дистрофии , муковисцидоз , синдром удлиненного интервала QT и диабет I типа .

Регенеративная медицина

Потенциально неограниченный источник клеток и тканей может иметь прямое применение для тканевой инженерии , замены клеток и трансплантации после острых травм и реконструктивных операций . Эти применения ограничены типами клеток, которые можно эффективно и безопасно дифференцировать от человеческих ПСХ с надлежащим органогенезом . Децеллюляризованные органы также используются в качестве тканевого каркаса для органогенеза. Исходным материалом могут быть нормальные здоровые клетки от другого донора (гетерологичная трансплантация) или генетически исправленные от того же пациента (аутологичные). Были высказаны опасения по поводу безопасности пациентов из-за возможности заражения недифференцированных клеток. Первое клиническое испытание с использованием клеток, полученных из hIPSC, было проведено в 2011 году. Первое клиническое испытание с использованием клеток, полученных из hiPSC, началось в 2014 году в Японии.

Смотрите также

использованная литература