Просвечивающая электронная криомикроскопия - Transmission electron cryomicroscopy

CryoTEM-изображение GroEL, взвешенного в аморфном льду на 50 000 × увеличение
Структура алкогольоксидазы из Pichia pastoris по CryoTEM

Просвечивающая электронная криомикроскопия ( CryoTEM ), широко известная как крио-ЭМ , представляет собой форму криогенной электронной микроскопии , а точнее вид просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), при которой образец исследуется при криогенных температурах (обычно температурах жидкого азота ). Крио-ЭМ набирает популярность в структурной биологии .

Полезность просвечивающей электронной криомикроскопии заключается в том, что она позволяет наблюдать образцы, которые не были окрашены или не зафиксированы каким-либо образом, показывая их в естественной среде. Это контрастирует с рентгеновской кристаллографией , которая требует кристаллизации образца, что может быть затруднительно, и помещения его в нефизиологическую среду, что иногда может приводить к функционально несущественным конформационным изменениям.

Достижения в технологии электронных детекторов , в частности, DDE (прямые электронные детекторы), а также более мощные программные алгоритмы визуализации позволили определять макромолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. Изображенные макромолекулы включают вирусы , рибосомы , митохондрии , ионные каналы и ферментные комплексы. Начиная с 2018 года крио-ЭМ можно применять к структурам размером с гемоглобин (64 кДа ) и с разрешением до 1,8 Å . В 2019 году крио-ЭМ-структуры составляли 2,5% структур, депонированных в банке данных белков , и это число продолжает расти. Применение крио-ЭМ - криоэлектронная томография (крио-ЭТ), где 3D-реконструкция образца создается из наклонных 2D-изображений.

Развитие

Первоначальное обоснование использования CryoTEM было как средство борьбы с радиационным повреждением биологических образцов. Количество излучения, необходимое для получения изображения образца в электронном микроскопе, достаточно велико, чтобы стать потенциальным источником повреждения образца для хрупких структур. Кроме того, высокий вакуум, необходимый для колонки электронного микроскопа, делает среду для образца довольно суровой.

Проблема вакуума была частично решена введением отрицательных пятен, но даже при отрицательных пятнах биологические образцы склонны к структурному разрушению при обезвоживании образца. Возможность погружения образцов во лед при температуре ниже температуры сублимации была рассмотрена на раннем этапе, но вода имеет тенденцию образовывать кристаллическую решетку более низкой плотности при замерзании, и это может разрушить структуру всего, что в ней заключено.

В начале 1980-х годов несколько групп, изучающих физику твердого тела, пытались получить стекловидный лед различными способами, такими как замораживание под высоким давлением или мгновенное замораживание. В основополагающей статье 1984 года группа под руководством Жака Дюбоше из Европейской лаборатории молекулярной биологии показала изображения аденовируса, заключенного в застеклованный слой воды. Обычно считается, что эта бумага указывает на происхождение крио-ЭМ, и эта методика была разработана до такой степени, что стала рутинной во многих лабораториях по всему миру.

Энергия электронов, используемых для визуализации (80–300 кВ), достаточно высока для разрыва ковалентных связей . Когда визуализирующие образцы уязвимы для радиационного повреждения, необходимо ограничить электронное облучение, используемое для получения изображения. Эти низкие экспозиции требуют, чтобы изображения тысяч или даже миллионов идентичных замороженных молекул были выбраны, выровнены и усреднены для получения карт высокого разрешения с использованием специализированного программного обеспечения. Значительное улучшение структурных характеристик было достигнуто в 2012 году за счет внедрения прямых электронных детекторов и улучшенных вычислительных алгоритмов.

В 2015 году Бриджит Каррагер и ее коллеги из Национального ресурса автоматизированной молекулярной микроскопии Скриппса использовали методы, разработанные ею и Клинтом Поттером для определения первой крио-ЭМ-структуры с разрешением менее 3 Å, тем самым превратив CryoTEM в инструмент, сравнимый и потенциально превосходящий традиционным методам рентгеновской кристаллографии. С тех пор были достигнуты более высокие разрешения, в том числе структура бактериального фермента β-галактозидазы 2,2 Å в 2015 г. и структура глутаматдегидрогеназы 1,8 Å в 2016 г. Крио-ЭМ также использовалась для определения структуры различных вирусов, в том числе Зика вирус , и был применен к большим комплексам, таким как сплайсосома . В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена совместно Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением».

Биологические образцы

Тонкая пленка

Биологический материал наносится на сетку электронной микроскопии и сохраняется в замороженном-гидратированном состоянии путем быстрого замораживания, обычно в жидком этане при температуре около жидкого азота . Поддерживая образцы при температуре жидкого азота или более низкой температуре, они могут быть введены в высокотемпературной вакуумной части электронного микроскопа колонки. Большинство биологических образцов чрезвычайно радиочувствительны , поэтому для их визуализации необходимо использовать методы с низкой дозой (полезно, низкая температура просвечивающей электронной криомикроскопии обеспечивает дополнительный фактор защиты от радиационного повреждения).

Следовательно, изображения получаются очень зашумленными . Для некоторых биологических систем возможно усреднение изображений для увеличения отношения сигнал / шум и получения информации с высоким разрешением об образце с помощью метода, известного как анализ отдельных частиц . Этот подход в целом требует, чтобы усредняемые объекты были идентичными, хотя теперь можно изучить некоторую ограниченную конформационную гетерогенность (например, рибосомы ). Трехмерные реконструкции из изображений белковых комплексов и вирусов с помощью CryoTEM были решены с субнанометровым или почти атомным разрешением, что позволило по-новому взглянуть на структуру и биологию этих больших сборок.

Анализ упорядоченных массивов белка, такие как 2-D кристаллы из трансмембранных белков или спиральных массивов белков, а также позволяет своего рода усреднение , который может обеспечить высокое разрешение информации о образце. Этот метод называется электронной кристаллографией .

Стекловидные секции

Метод тонких пленок ограничен тонкими образцами (обычно <500 нм), потому что электроны не могут пересекать более толстые образцы без многократного рассеяния. Более толстые образцы могут быть остеклованы замораживанием погружением ( криофиксацией ) в этане (толщиной до десятков мкм) или, чаще, замораживанием под высоким давлением (до сотен мкм). Затем их можно разрезать на тонкие срезы (толщиной от 40 до 200 нм) с помощью алмазного ножа в криоультрамикротоме при температуре ниже -135 ° C (температура расстекловывания). Срезы собираются на сетке электронного микроскопа и отображаются таким же образом, как и образец, остеклованный в тонкой пленке. Этот метод называется просвечивающей электронной криомикроскопией стекловидных срезов (CEMOVIS) или просвечивающей электронной криомикроскопией замороженных гидратированных срезов.

Образцы материалов

Помимо возможности визуализации застеклованных биологических образцов, CryoTEM также может использоваться для визуализации образцов материалов, которые слишком летучие в вакууме для получения изображений с помощью стандартной электронной микроскопии при комнатной температуре. Например, застеклованные участки поверхности раздела жидкость-твердое тело можно извлечь для анализа с помощью CryoTEM, а серу, которая склонна к сублимации в вакууме электронных микроскопов, можно стабилизировать и отобразить в CryoTEM.

Методы

В CryoTEM можно использовать различные методы. Популярные техники включают:

  1. Электронная кристаллография
    1. Анализ двумерных кристаллов
    2. Анализ спиральных нитей или трубок
    3. Дифракция электронов на микрокристаллах (MicroED)
  2. Анализ отдельных частиц (SPA)
    1. CryoTEM с временным разрешением
  3. Электронная криотомография (криоЭТ)

Смотрите также

Рекомендации

дальнейшее чтение

внешние ссылки

Библиотечные ресурсы по
криомикроскопии