Подсчет клеток - Cell counting
Подсчет клеток представляют собой любой из различных методов подсчета или аналогичных количественный из клеток в биологических науках , в том числе медицинской диагностики и лечения . Это важный раздел цитометрии , который находит применение в исследованиях и клинической практике. Например, общий анализ крови может помочь врачу определить, почему пациент плохо себя чувствует и что делать, чтобы помочь. Подсчет клеток в жидких средах (таких как кровь , плазма , лимфа или лабораторный промывочный раствор ) обычно выражается как количество клеток на единицу объема , выражая таким образом концентрацию (например, 5000 клеток на миллилитр).
Использует
Многочисленные процедуры в биологии и медицине требуют подсчета клеток. Концентрация может быть опосредована подсчетом клеток в известном небольшом объеме . Примеры необходимости подсчета клеток включают:
- В медицине концентрация различных клеток крови , таких как эритроциты и лейкоциты , может дать важную информацию о состоянии здоровья человека (см. Полный анализ крови ).
- В клеточной терапии - для контроля дозы клеток, вводимых пациенту.
- Точно так же концентрация бактерий , вирусов и других патогенов в крови или других жидкостях организма может раскрыть информацию о развитии инфекционного заболевания и о степени успеха, с которым иммунная система справляется с инфекцией .
- Концентрация клеток должна быть известна для многих экспериментов в молекулярной биологии, чтобы соответствующим образом отрегулировать количество реагентов и химикатов, которые будут применяться в эксперименте.
- Исследования, рассматривающие на темпы роста в микроорганизмов (другими словами, как быстро они разделяют , чтобы создать новые клетки) требуют подсчета клеток.
- Расчет доли мертвых и живых клеток как меры жизнеспособности клеток, например клеток, подвергшихся воздействию яда.
Ручной подсчет клеток
Есть несколько методов подсчета клеток. Некоторые из них примитивны и не требуют специального оборудования, поэтому могут быть выполнены в любой биологической лаборатории , тогда как другие полагаются на сложные электронные устройства.
Счетная камера
Счетная камера , это стекло микроскопа , который специально предназначен для того, чтобы подсчет клеток. Гемоцитометры и счетные камеры Sedgewick Rafter - это два типа счетных камер. Гемоцитометр имеет две камеры с сеткой в центре, которые при подсчете закрываются специальным предметным стеклом. Капля культуры клеток помещается в пространство между камерой и стеклянной крышкой, заполняя его за счет капиллярного действия . Глядя на образец под микроскопом , исследователь использует сетку для ручного подсчета количества клеток в определенной области известного размера. Расстояние между камерой и крышкой задано заранее, поэтому можно рассчитать объем подсчитываемой культуры и, таким образом, концентрацию клеток. Жизнеспособность клеток также может быть определена, если в жидкость добавлены красители для определения жизнеспособности.
Их преимущество - дешево и быстро; это делает их предпочтительным методом подсчета в быстрых биологических экспериментах, где необходимо только определить, выросла ли культура клеток, как ожидалось. Обычно исследуемую культуру необходимо разбавить, иначе высокая плотность клеток сделает подсчет невозможным. Необходимость разбавления является недостатком, поскольку каждое разбавление увеличивает неточность измерения.
Покрытие и подсчет КОЕ
Чтобы количественно определить количество клеток в культуре, клетки можно просто высеять на чашку Петри со средой для выращивания . Если клетки эффективно распределены на планшете, можно в целом предположить, что каждая клетка даст начало одной колонии или колониеобразующей единице (КОЕ) . Затем можно подсчитать количество колоний и рассчитать концентрацию клеток на основе известного объема культуры, нанесенной на чашку. Это часто выполняется в соответствии со стандартом ASTM D5465.
Как и в случае с счетными камерами, культуры обычно необходимо сильно разбавить перед посевом; в противном случае вместо получения отдельных колоний, которые можно будет подсчитать, образуется так называемая «лужайка»: тысячи колоний, лежащих друг на друге. Кроме того, посев - самый медленный из всех методов: большинству микроорганизмов требуется не менее 12 часов для образования видимых колоний.
Хотя этот метод может занять много времени, он дает точную оценку количества жизнеспособных клеток (потому что только они смогут расти и образовывать видимые колонии). Поэтому он широко используется в экспериментах, направленных на количественное определение количества клеток, устойчивых к лекарствам или другим внешним условиям (например, эксперимент Луриа-Дельбрюка или анализ защиты от гентамицина ). Кроме того, подсчет колоний на чашках с агаром можно значительно облегчить, если использовать счетчики колоний .
Автоматический подсчет клеток
Электрическое сопротивление
Коултер счетчиком является устройством , которое может рассчитывать клетки, а также измерить их объем. Он основан на том факте, что клетки обладают большим электрическим сопротивлением ; Другими словами, они почти не проводят электричество . В счетчике Коултера клетки, плавающие в растворе, проводящем электричество, засасываются одна за другой в крошечный промежуток. По бокам зазора расположены два электрода, которые проводят электричество. Когда в зазоре нет ячейки, электричество течет не ослабевая, но когда ячейка засасывается в зазор, току сопротивляется. Счетчик Коултера подсчитывает количество таких событий, а также измеряет ток (и, следовательно, сопротивление), которое напрямую коррелирует с объемом захваченной ячейки. Похожая система - это технология подсчета клеток CASY .
Счетчики Coulter и CASY намного дешевле, чем проточные цитометры, и для приложений, требующих количества и размера клеток , таких как исследование клеточного цикла , они являются предпочтительным методом. Его преимущество перед методами, описанными выше, заключается в большом количестве ячеек, которые можно обработать за короткое время, а именно: тысячи ячеек в секунду. Это обеспечивает большую точность и статистическую значимость .
Проточной цитометрии
Проточная цитометрия на сегодняшний день является наиболее сложным и дорогим методом подсчета клеток. В проточном цитометре клетки текут узким потоком перед лазерным лучом. Луч попадает в них один за другим, а световой датчик улавливает свет, отраженный от ячеек.
Проточные цитометры обладают многими другими возможностями, такими как анализ формы клеток и их внутренних и внешних структур, а также измерение количества определенных белков и других биохимических веществ в клетках. Поэтому проточные цитометры редко приобретаются исключительно для подсчета клеток.
Анализ изображений
Недавние подходы рассматривают использование высококачественных микроскопических изображений, по которым используется алгоритм статистической классификации для выполнения автоматического обнаружения и подсчета клеток, в качестве задачи анализа изображений . Обычно выполняется с постоянной частотой ошибок как автономный (пакетный) процесс. Для этой цели можно использовать ряд методов классификации изображений .
Стереологический подсчет клеток
В настоящее время стереологический подсчет клеток с ручным решением о включении объекта в соответствии с несмещенными правилами стереологического подсчета остается единственным адекватным методом объективной количественной оценки клеток в гистологических срезах ткани, поэтому его недостаточно для полной автоматизации.
Косвенный подсчет клеток
Спектрофотометрия
Суспензии клеток мутные . Клетки поглощают и рассеивают свет. Чем выше концентрация клеток, тем выше мутность. Спектрофотометры могут очень точно измерять интенсивность света. Культуру клеток помещают в прозрачную кювету и измеряют абсорбцию только относительно среды. Оптическая плотность (ОП) прямо пропорциональна биомассе в клеточной суспензии в заданном диапазоне, который зависит от типа клеток. Использование спектрофотометрии для измерения мутности культур известно как турбидометрия .
Это сделало спектрофотометрию методом выбора для измерения роста бактерий и связанных приложений. Недостатком спектрофотометрии является ее неспособность обеспечить абсолютный подсчет или различить живые и мертвые клетки.
Импедансная микробиология
Импедансная микробиология - это быстрый микробиологический метод, используемый для измерения концентрации микробов (в основном бактерий, но также дрожжей ) в образце путем мониторинга электрических параметров питательной среды. Он основан на том факте, что метаболизм бактерий превращает незаряженные (или слабо заряженные) соединения в сильно заряженные соединения, тем самым изменяя электрические свойства питательной среды . Концентрация микробов оценивается по времени, необходимому для отклонения контролируемых электрических параметров от начального исходного значения.
Доступны различные инструменты (встроенные в лабораторию или имеющиеся в продаже) для измерения концентрации бактерий с помощью импедансной микробиологии.