Счетчик сошников - Coulter counter
Коултер Счетчик представляет собой устройство для подсчета и размеров частиц , взвешенных в электролитах . Принцип Коултера и основанный на нем счетчик Коултера - это коммерческий термин для метода, известного как резистивное импульсное считывание или определение электрической зоны.
Типичный счетчик Коултера имеет один или несколько микроканалов , разделяющих две камеры, содержащие растворы электролита . Поскольку содержащие жидкость частицы или клетки протягиваются через каждый микроканал, каждая частица вызывает кратковременное изменение электрического сопротивления жидкости. Счетчик обнаруживает эти изменения электрического сопротивления.
Принцип соултера
Принцип Коултера гласит, что частицы, проталкиваемые через отверстие, одновременно с электрическим током , вызывают изменение импеданса , которое пропорционально объему частицы, проходящей через отверстие. Этот импульс импеданса возникает из-за смещения электролита, вызванного частицей. Принцип Коултера был назван в честь его изобретателя Уоллеса Х. Коултера . Этот принцип нашел коммерческий успех в медицинской промышленности, особенно в гематологии , где его можно применять для подсчета и определения размера различных клеток, составляющих цельную кровь.
Клетки, будучи плохо проводящими частицами, изменяют эффективное поперечное сечение проводящего микроканала. Если эти частицы обладают меньшей проводимостью, чем окружающая жидкая среда, электрическое сопротивление в канале увеличивается, в результате чего электрический ток, проходящий через канал, на короткое время уменьшается. Отслеживая такие импульсы электрического тока, можно подсчитать количество частиц для данного объема жидкости. Величина изменения электрического тока связана с размером частицы, что позволяет измерить распределение частиц по размерам, которое может быть коррелировано с подвижностью, поверхностным зарядом и концентрацией частиц.
Счетчик Коултера - жизненно важный элемент современной больничной лаборатории . Его основная функция - быстрый и точный анализ общих показателей крови (часто называемый общим анализом крови ). Общий анализ крови используется для определения количества или доли белых и красных кровяных телец в организме. Раньше эта процедура включала подготовку мазка периферической крови и ручной подсчет каждого типа клеток под микроскопом , процесс, который обычно занимал полчаса.
Счетчики Coulter находят широкое применение, включая краску, керамику, стекло, расплавленные металлы и производство продуктов питания. Они также обычно используются для контроля качества.
Счетчик Коултера сыграл важную роль в разработке первого в истории клеточного сортировщика и был задействован в первые дни развития проточной цитометрии . Даже сегодня некоторые проточные цитометры используют принцип Коултера для получения высокоточной информации о размере и количестве клеток.
Многие исследователи разработали множество устройств, основанных на принципе Коултера, и создали рецензируемые публикации, содержащие данные с этих устройств. Некоторые из этих устройств также поступили в продажу. Все реализации принципа Коултера обеспечивают компромисс между чувствительностью, защитой от шума, совместимостью с растворителями, скоростью измерения, объемом образца, динамическим диапазоном и надежностью изготовления устройства.
Разработка
Уоллес Х. Коултер открыл принцип Коултера в конце 1940-х годов, хотя патент не был выдан до 20 октября 1953 года. На Колтера повлияли атомные бомбы, сброшенные на Хиросиму и Нагасаки . Эти события побудили Коултера упростить и улучшить анализ клеток крови, чтобы можно было быстро обследовать большие группы населения, что было бы необходимо в случае ядерной войны. Частичное финансирование проекта было получено за счет гранта Управления военно-морских исследований .
Колтер был награжден патентом США № 2 656 508, Средство для подсчета частиц, взвешенных в жидкости . Принцип Коултера чаще всего используется в счетчике Коултера, который представляет собой аналитический прибор, предназначенный для конкретной задачи, такой как подсчет клеток. Однако есть множество других способов реализовать принцип Коултера. Некоторые из них были предприняты, некоторые с коммерческим успехом, а некоторые чисто для академических исследований. На сегодняшний день наиболее коммерчески успешное применение принципа Коултера - это гематология, где он используется для получения информации о клетках крови пациентов.
Принцип Коултера основан на том факте, что частицы, движущиеся в электрическом поле, вызывают измеримые возмущения в этом поле. Величины этих возмущений пропорциональны размеру частиц в поле. Коултер выделил несколько требований, необходимых для практического применения этого явления. Сначала частицы следует суспендировать в проводящей жидкости. Затем электрическое поле должно быть физически ограничено, чтобы движение частиц в поле вызывало заметные изменения тока. Наконец, частицы должны быть достаточно разбавленными, чтобы через физическое сужение проходила только одна частица, предотвращая появление артефакта, известного как совпадение.
Хотя принцип Коултера может быть реализован в различных конструкциях, есть два, которые стали наиболее коммерчески актуальными. К ним относятся формат апертуры и формат проточной кюветы. На рисунке выше показаны несколько других геометрических форм, запатентованных Coulter.
Формат диафрагмы
Формат апертуры используется в большинстве коммерческих счетчиков Coulter. В этой установке отверстие определенного размера создается в драгоценном диске (сделанном из того же материала, что и подшипники драгоценных камней в часах) с использованием специальных производственных процессов. Полученное отверстие затем внедряется в стенку стеклянной трубки, создавая то, что обычно называют трубкой с отверстием. Во время использования апертурная трубка помещается в жидкость, так что драгоценный диск полностью погружается, и трубка может заполняться жидкостью. Электроды расположены как внутри, так и снаружи апертурной трубки, что позволяет току течь через апертуру. Насос используется для создания вакуума в верхней части трубки, который втягивает жидкость через отверстие. Затем образцы для анализа медленно добавляются к проводящей жидкости, окружающей апертурную трубку. В начале эксперимента включается электрическое поле, и насос начинает втягивать разбавленную суспензию через отверстие. Полученные данные собираются путем регистрации электрических импульсов, генерируемых при прохождении частиц через апертуру.
Хотя базовая физическая настройка формата апертуры одинакова для каждого счетчика Коултера, количество и качество данных сильно различаются в зависимости от реализованной схемы обработки сигналов . Например, усилители с более низкими порогами шума и большим динамическим диапазоном могут повысить чувствительность системы. Точно так же цифровые анализаторы амплитуды импульсов с переменной шириной ячейки обеспечивают данные с гораздо более высоким разрешением по сравнению с аналоговыми анализаторами с фиксированной шириной ячейки. Кроме того, объединение счетчика Коултера с цифровым компьютером позволяет регистрировать многие характеристики электрических импульсов, в то время как аналоговые счетчики обычно хранят гораздо более ограниченный объем информации о каждом импульсе.
Формат проточной кюветы
Формат проточной кюветы чаще всего используется в гематологических инструментах, а иногда и в проточных цитометрах. В этом формате электроды встроены в оба конца проточного канала, и электрическое поле прикладывается через канал. Этот формат имеет несколько преимуществ по сравнению с форматом диафрагмы. Такое расположение позволяет проводить непрерывный анализ образца, тогда как формат апертуры является однократным. Кроме того, использование проточной ячейки позволяет добавлять поток оболочки, который удерживает частицы в центре проточного канала. Это позволяет выполнять измерения одновременно, например, зондировать объект лазером. Основными недостатками формата проточной кюветы является то, что он намного дороже в производстве и обычно фиксируется на ширину одного канала, тогда как формат апертуры предлагает широкий выбор размеров апертуры.
Микрожидкостные версии
Принцип Коултера был применен к подходам « лаборатория на кристалле» к обнаружению частиц с использованием микрофлюидных подходов, которые позволяют создавать поры гораздо меньшего размера, чем те, которые могут быть легко достигнуты при использовании объемных методов, используемых для изготовления традиционных счетчиков Коултера. Эти подходы, известные под общим термином «микрожидкостное резистивное импульсное зондирование» , позволили расширить принцип Коултера на глубокий субмикронный диапазон, позволив, например, непосредственно обнаруживать вирусные частицы в жидкости.
Экспериментальные соображения
Совпадение
Аномальные электрические импульсы могут возникать, если концентрация образца настолько высока, что в апертуру одновременно попадают несколько частиц. Эта ситуация известна как совпадение. Это происходит потому, что невозможно гарантировать, что один большой импульс является результатом одновременного попадания одной большой частицы или нескольких мелких частиц в апертуру. Чтобы избежать этой ситуации, образцы должны быть достаточно разбавленными.
Путь частицы
Форма генерируемого электрического импульса меняется в зависимости от пути частицы через отверстие. Плечи и другие артефакты могут возникать из-за того, что плотность электрического поля изменяется по диаметру апертуры. Эта разница является результатом как физического ограничения электрического поля, так и того факта, что скорость жидкости изменяется в зависимости от радиального положения в отверстии. В формате проточной ячейки этот эффект сводится к минимуму, поскольку поток в оболочке гарантирует, что каждая частица проходит почти идентичный путь через проточную ячейку. В формате апертуры алгоритмы обработки сигналов могут использоваться для коррекции артефактов, возникающих из-за траектории частицы.
Проводящие частицы
Проводящие частицы - обычная проблема для людей, рассматривающих принцип Коултера. Хотя эта тема поднимает интересные научные вопросы, на практике она редко влияет на результаты эксперимента. Это связано с тем, что разница проводимости между большинством проводящих материалов и ионами в жидкости (называемая потенциалом разряда) настолько велика, что большинство проводящих материалов действуют как изоляторы в счетчике Коултера. Напряжение, необходимое для преодоления этого потенциального барьера, называется напряжением пробоя. Для тех материалов с высокой проводимостью, которые представляют проблему, напряжение, используемое во время эксперимента Коултера, должно быть уменьшено до уровня ниже потенциала пробоя (который может быть определен эмпирически).
Пористые частицы
Принцип Коултера измеряет объем объекта, поскольку возмущение электрического поля пропорционально объему электролита, вытесненного из отверстия. Это приводит к некоторой путанице среди тех, кто привык к оптическим измерениям с помощью микроскопов или других систем, которые просматривают только два измерения, а также показывают границы объекта. С другой стороны, принцип Коултера измеряет три измерения и объем, перемещаемый объектом. Полезнее всего думать о губках; Даже если влажная губка может показаться очень большой, она вытеснит значительно меньше жидкости, чем полнотелый кирпич тех же размеров.
Постоянный ток и переменный ток
Счетчик Коултера, изобретенный Уоллесом Коултером, применяет постоянный ток (DC) для подсчета частиц (ячеек) и производит электрические импульсы с амплитудой, зависящей от размера ячеек. Ячейки можно смоделировать как электрические изоляторы, окруженные проводящей жидкостью, которые блокируют часть электрического пути, тем самым мгновенно увеличивая измеренное сопротивление . Это наиболее распространенная измерительная система, использующая принцип Коултера.
Последующие изобретения позволили расширить информацию, полученную с помощью переменного тока (AC), чтобы исследовать комплексный электрический импеданс ячеек, а не только их размер. Затем клетку можно приблизительно смоделировать как изолирующую клеточную мембрану, окружающую цитоплазму клетки , которая является проводящей. Тонкость клеточной мембраны создает электрическую емкость между цитоплазмой и электролитом, окружающим клетку. Затем можно измерить электрический импеданс на той или иной частоте переменного тока. На низких частотах (значительно ниже 1 МГц ) импеданс аналогичен сопротивлению постоянному току. Однако более высокие частоты в диапазоне МГц определяют толщину клеточной мембраны (которая определяет ее емкость). Однако на гораздо более высоких частотах (значительно выше 10 МГц) импеданс емкости мембраны падает до точки, где больший вклад в измеряемый импеданс вносит сама цитоплазма (мембрана по существу «закорочена»). Таким образом, используя разные частоты, устройство становится больше, чем счетчиком ячеек, а также чувствительным к внутренней структуре и составу ячеек.
Основные приложения
Гематология
Наиболее успешное и важное применение принципа Коултера - это характеристика клеток крови человека. Этот метод использовался для диагностики множества заболеваний и является стандартным методом для определения количества эритроцитов (эритроцитов) и лейкоцитов (лейкоцитов), а также ряда других общих параметров. В сочетании с другими технологиями, такими как флуоресцентная маркировка и светорассеяние, принцип Коултера может помочь получить подробный профиль клеток крови пациента.
Количество и размер ячеек
В дополнение к клиническому подсчету клеток крови (диаметр клеток обычно составляет 6–10 микрометров), принцип Коултера зарекомендовал себя как самый надежный лабораторный метод для подсчета большого количества клеток, начиная от бактерий (размером <1 микрометра) и жировых клеток. клетки (около 400 микрометров), агрегаты растительных клеток (> 1200 микрометров) и эмбриоидные тела стволовых клеток (около 900 микрометров).
Характеристика частиц
Принцип Коултера оказался полезным для приложений, выходящих далеко за рамки клеточных исследований. Тот факт, что он индивидуально измеряет частицы, не зависит от каких-либо оптических свойств, чрезвычайно чувствителен и хорошо воспроизводится, привлекает внимание к широкому спектру полей. Следовательно, принцип Коултера был адаптирован к наномасштабу для создания методов определения характеристик наночастиц, известных как микрожидкостное резистивное импульсное зондирование, а также одно коммерческое предприятие, которое продает метод, который он называет настраиваемым резистивным импульсным зондированием , или TRPS. TRPS позволяет проводить высокоточный анализ разнообразного набора наночастиц, включая функционализированные наночастицы для доставки лекарств , вирусоподобные частицы (VLP), липосомы , экзосомы , полимерные наночастицы и микропузырьки .
Смотрите также
использованная литература
- ^ WR Hogg, W. Coulter; Устройство и способ измерения размера разделяемых частиц системы твердых частиц; Патент США 3557352
- ^ Патент США 7,397,232 Счетчик Coulter
- ^ Грэм Маршалл (2020-01-01). «ПРИНЦИП КУЛЬТЕРА: НА БЛАГО ЧЕЛОВЕЧЕСТВА» . Диссертация и диссертации - История . DOI : 10.13023 / etd.2020.495 .
- ^ а б Маршалл Дон. Грэм (2003). «Принцип Коултера: основа индустрии» . Журнал автоматизации лабораторий . 8 (6): 72–81. DOI : 10.1016 / S1535-5535-03-00023-6 .
- ^ Cytometry volume 10 , серия DVD, выпущенная лабораториями цитометрии Университета Пердью http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/coulter.html
- ^ JJ Kasianowicz и др .. "Характеристика отдельных полинуклеотидных молекул с использованием мембранного канала", P. Natl. Акад. Sci. США 93,13770–13773 (1996)
- ^ О. Салех и Л. Л. Сон, "Искусственные нанопоры для молекулярного зондирования", Nano Lett. 3, 37–38 (2003)
- ^ J.-L. Fraikin, T. Teesalu, CM McKenney, E. Ruoslahti и AN Cleland, «Высокопроизводительный анализатор наночастиц без меток», Nature Nanotechnology 6, 308–313 (2011)
- ^ Ючунь Сюй; XinwuXie; Юн Дуань; Лэй Ван; Чжэнь Чэн; Цзин Чэн (15 марта 2016 г.). «Обзор измерений импеданса целых клеток» . Биосенсоры и биоэлектроника . 77 : 824–836. DOI : 10.1016 / j.bios.2015.10.027 . PMID 26513290 .
внешние ссылки
- https://web.archive.org/web/20080424022037/http://web.mit.edu/invent/iow/coulter.html
- US 2656508 « Средство для подсчета частиц, взвешенных в жидкости» , 20 октября 1953 г., Уоллес Х. Коултер.
- «Апертуры нанометрового размера с динамически изменяемым размером для молекулярного зондирования»; Стивен Дж. Соуэрби, Мюррей Ф. Брум, Джордж Б. Петерсен; Датчики и исполнительные механизмы B: Chemical Volume 123, Issue 1 (2007), страницы 325–330