Визуализация кальция - Calcium imaging

Визуализация кальция - это метод микроскопии для оптического измерения кальциевого (Ca ²⁺ ) статуса изолированной клетки , ткани или среды. Визуализация кальция использует индикаторы кальция, флуоресцентные молекулы, которые реагируют на связывание ионов Ca ^{2+ за} счет флуоресцентных свойств. Существует два основных класса индикаторов кальция: химические индикаторы и генетически закодированные индикаторы кальция (GECI). Этот метод позволил изучить передачу сигналов кальция в самых разных типах клеток. В нейронах электрическая активность всегда сопровождается притоком ионов Са ²⁺ . Таким образом, визуализация кальция может быть использована для мониторинга электрической активности сотен нейронов в клеточной культуре или у живых животных, что позволило проанализировать функцию нейронных цепей .

Химические индикаторы

Схема типичной установки для кальциевой флуоресцентной визуализации изолированных сердечных миоцитов

Химические индикаторы - это небольшие молекулы, которые могут хелатировать ионы кальция. Все эти молекулы основаны на гомологе EGTA, называемом BAPTA , с высокой селективностью по ионам кальция (Ca ²⁺ ) по сравнению с ионами магния (Mg ²⁺ ).

В эту группу индикаторов входят фура-2 , индо-1 , флуо-3 , флуо-4 , кальций-зеленый-1.

Эти красители часто используются с карбоксильными группами хелатора , замаскированными под ацетоксиметиловые эфиры , чтобы сделать молекулу липофильной и облегчить проникновение в клетку. Когда эта форма индикатора находится в клетке, клеточные эстеразы высвободят карбоксильные группы, и индикатор сможет связывать кальций. Свободная кислотная форма красителей (то есть без модификации ацетоксиметилового эфира) также может быть непосредственно введена в клетки через микроэлектрод или микропипетку, что устраняет неопределенности относительно клеточного компартмента, содержащего краситель (ацетоксиметиловый эфир также может попадать в эндоплазматический ретикулум и митохондрии. ). Связывание Ca ²⁺ иона до флуоресцентных молекул приводит индикатор либо к увеличению квантового выхода из флуоресценции или выбросов / возбуждения длины волны сдвига. Индивидуальные химические флуоресцентные индикаторы Ca ²⁺ используются для измерения цитозольного кальция в самых разных клеточных препаратах. Первое получение изображений Ca ^{2+ в} реальном времени (с частотой видеосигнала) было выполнено в 1986 году в сердечных клетках с использованием усиленных видеокамер. Позже разработка методики с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопы показали , Ca субклеточных ²⁺ сигналов в форме Ca ²⁺ искр и Са ²⁺ всплесков. Относительные ответы от комбинации химических флуоресцентных индикаторов Ca ²⁺ также использовались для количественной оценки переходных процессов кальция во внутриклеточных органеллах, таких как митохондрии .

Визуализация кальция, также называемая картированием кальция, также используется для исследования ткани миокарда. Картирование кальция - это повсеместный метод, используемый для целых изолированных сердец, таких как мыши, крысы и кролики.

Генетически закодированные индикаторы кальция

Генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI) - мощные инструменты, полезные для визуализации in vivo клеточных, онтогенетических и физиологических процессов. GECI не нужно загружать в ячейки; вместо этого гены, кодирующие эти белки, можно легко трансфицировать в клеточные линии. Также возможно создать трансгенных животных, экспрессирующих краситель во всех клетках или выборочно в определенных клеточных подтипах. GECI использовались в исследованиях нейронов, Т-клеток , кардиомиоцитов и т. Д. Вообще говоря, GECI можно разделить на классы, в которых обнаружение кальция основано на флуоресценции или люминесценции; однако оба они неизбежно полагаются на флуоресцентные белки в качестве репортеров, включая зеленый флуоресцентный белок GFP и его варианты (eGFP, YFP, CFP).

Из флуоресцентных вариантов системы индикаторов кальция можно далее разделить на системы с одним флуоресцентным белком (FP) и системы с парными флуоресцентными белками. Камгаро были одними из первых разработанных вариантов, включающих единую белковую систему. Камгаро использует кальмодулин (CaM), связывающий кальций белок. В этих структурах CaM вставлен в середину желтого флуоресцентного белка (YFP) в Y145. Предыдущие исследования мутагенеза показали, что мутации в этом положении придают стабильность pH при сохранении флуоресцентных свойств, что делает Y145 интересной точкой вставки. Кроме того, N- и C-концы YFP связаны пептидным линкером (GGTGGS). Когда CaM связывается с Ca2 +, эффективная pKa снижается, что позволяет депротонировать хромофор. Это приводит к усилению флуоресценции при связывании кальция интенсиометрическим способом. Такое обнаружение отличается от логометрических систем, в которых наблюдается изменение спектров поглощения / излучения в результате связывания Ca2 +. Позднее разработанная система с одним FP, получившая название G-CaMP , также вызывает GFP с циклической перестановкой. Один из концов слит с CaM, а другой конец слит с M13 (кальмодулин-связывающий домен легкой миозиновой киназы). Белок сконструирован таким образом, что концы расположены близко в пространстве, что позволяет связыванию Ca2 + вызывать конформационные изменения и модуляцию хромофора, обеспечивая повышенную флуоресценцию. G-CaMP и его усовершенствованные варианты имеют наномолярные значения сродства связывания. Последним вариантом единственного белка является CatchER, который обычно считается индикатором более низкого сродства. Его связывающий кальций карман весьма отрицателен; Связывание катиона помогает экранировать большую концентрацию отрицательного заряда и позволяет восстановить флуоресценцию.

В отличие от этих систем парные флуоресцентные белковые системы, в которые входят прототипы камелеонов . Камелеоны состоят из двух разных флуоресцентных белков, CaM, M13 и глицилглицинового линкера. В отсутствие Ca2 + флуоресцентным будет только донорский флуоресцентный белок со смещенным синим сдвигом. Однако конформационное изменение, вызванное связыванием кальция, перемещает флуоресцентный белок с красным смещением, обеспечивая возможность FRET (резонансный перенос энергии Форстера). Индикаторы Cameleon выдают логометрический сигнал (т. Е. Измеренная эффективность FRET зависит от концентрации кальция). Исходные варианты камелеонов изначально были более чувствительны к Ca2 + и подвергались кислотному тушению. Такие недостатки были устранены мутациями Q69K и V68L. Оба этих остатка были близки к скрытому анионному хромофору, и эти мутации, вероятно, препятствуют протонированию, обеспечивая большую устойчивость к pH.

Все большее значение в обнаружении кальция приобретают GECI в ближнем ИК-диапазоне (NIR), которые могут открыть возможности для мультиплексирования различных индикаторных систем и обеспечения более глубокого проникновения в ткани. NIR полагаются на биливердин-связывающие флуоресцентные белки, которые в основном происходят из бактериальных фитохромов . Системы NIR похожи на перикамы inGCverse в том, что оба испытывают снижение флуоресценции при связывании Ca2 +. RCaMP и RGECO работают на длине волны 700+ нм, но они довольно тусклые и сильно рассеяны. Аналог Cameleon, использующий NIR FRET, также был успешно построен.

Специальный класс GECI предназначен для формирования постоянной флуоресцентной метки в активных нейронах. Они основаны на фотопереключаемом белке Eos, который меняет цвет с зеленого на красный в результате фотокаталитического (с фиолетовым светом) расщепления основной цепи. В сочетании с CaM фиолетовый свет фотопреобразует только нейроны с повышенным уровнем кальция. SynTagMA - это версия CaMPARI2, ориентированная на синапсы.

В то время как флуоресцентные системы широко используются, биолюминесцентные репортеры Ca2 + могут также иметь потенциал из-за их способности устранять аутофлуоресценцию, фотообесцвечивание (длина волны возбуждения не требуется), биологическое разложение и токсичность, в дополнение к более высокому отношению сигнал / шум. Такие системы могут полагаться на эккорин и коэлентеразин люциферина. Связывание Ca2 + вызывает конформационные изменения, которые облегчают окисление целентеразина. Полученный фотопродукт излучает синий свет, когда возвращается в основное состояние. Совместная локализация акворина с GFP способствует BRET / CRET (биолюминесценция или хемилюминесцентный резонансный перенос энергии), что приводит к увеличению яркости на 19–65. Такие структуры можно использовать для измерения концентраций кальция от миллимолярных до наномолярных. Аналогичная система задействует обелин и его целентерамид люциферина, которые могут обладать более быстрым откликом на кальций и нечувствительностью к Mg2 +, чем его аналог акеорина. Такие системы могут также использовать самосборку компонентов люциферазы. В системе, получившей название «нано-фонарь», люцифераза RLuc8 расщепляется и размещается на разных концах CaM. Связывание с кальцием сближает компоненты RLuc8, реформируя люциферазу и позволяя ей перейти к акцепторному флуоресцентному белку.

Чтобы свести к минимуму повреждение визуализируемых клеток, часто используют двухфотонную микроскопию для обнаружения флуоресценции репортеров. Использование длин волн ближнего ИК-диапазона и минимизация осевого разброса точечной функции обеспечивает нанометровое разрешение и глубокое проникновение в ткань. Динамический диапазон часто определяется из таких измерений. Для не-ратиометрических индикаторов (обычно индикаторов одного белка) это отношение интенсивностей флуоресценции, полученных в условиях насыщения и истощения Ca2 +, соответственно. Однако для логометрических показателей динамический диапазон - это отношение максимального коэффициента эффективности FRET (насыщенный кальцием) к минимальному коэффициенту эффективности FRET (обедненный кальцием). Еще одна общая величина, используемая для измерения сигналов, производимых потоками концентрации кальция, - это отношение сигнала к базовой линии (SBR), которое представляет собой просто отношение изменения флуоресценции (F - F0) к базовой флуоресценции. Это можно связать с отношением сигнал / шум (SNR), умножив SBR на квадратный корень из числа подсчитанных фотонов.

Особый класс генетически кодируемых индикаторов кальция разработан для формирования постоянной флуоресцентной метки в активных нейронах. Они основаны на фотопереключаемом белке mEos, который меняет цвет с зеленого на красный при освещении фиолетовым светом. В сочетании с датчиком кальция кальмодулином фиолетовый свет фотопреобразует только нейроны с повышенным уровнем кальция. SynTagMA - это версия CaMPARI2, ориентированная на синапсы.

использование

Независимо от типа используемого индикатора процедура визуализации в целом очень похожа. Клетки, загруженные индикатором или экспрессирующие его в случае GECI, могут быть просмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа и захвачены камерой Scientific CMOS (sCMOS) или камерой CCD . Конфокальные и двухфотонные микроскопы обеспечивают возможность оптического разделения, так что сигналы кальция могут быть разделены в микродоменах, таких как дендритные шипы или синаптические бутоны , даже в толстых образцах, таких как мозг млекопитающих. Изображения анализируются путем измерения изменений интенсивности флуоресценции для одной длины волны или двух длин волн, выраженных в виде отношения (ратиометрические показатели). При необходимости полученные значения интенсивности и соотношения флуоресценции могут быть нанесены на график против откалиброванных значений для известных уровней Ca ²⁺ для измерения абсолютных концентраций Ca ²⁺ . Методы световой микроскопии расширяют функциональные возможности считывания нейронной активности в трехмерных объемах.

использованная литература

дальнейшее чтение

• Нуччителли, Ричард, изд. (1994). «Практическое руководство по изучению кальция в живых клетках» . Методы клеточной биологии. Бостон: Academic Press. ISBN 978-0-12-564141-8.