Экуорин - Aequorin
| Экуорин 1 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Ленточная диаграмма Aequorin из PDB 1ej3 с целентеразином простетической группы синего цвета
| |||||||
| Идентификаторы | |||||||
| Организм | |||||||
| Условное обозначение | N / A | ||||||
| UniProt | P07164 | ||||||
| Прочие данные | |||||||
| Номер ЕС | 1.13.12.5 | ||||||
| |||||||
Aequorin - это активируемый кальцием фотопротеин, выделенный из гидрозоа Aequorea victoria . Его биолюминесценция была изучена за десятилетия до того, как белок был изолирован от животного Осаму Шимомурой в 1962 году. У животных белок встречается вместе с зеленым флуоресцентным белком, чтобы производить зеленый свет путем резонансной передачи энергии , в то время как эккорин сам по себе генерирует синий свет.
Обсуждения «ДНК медуз», которые могут вызывать «светящихся» животных, часто относятся к трансгенным животным, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, а не эккорин, хотя оба они изначально происходят от одного и того же животного.
Апоэкуорин, белковая часть экворина, входит в состав биологически активной добавки Prevagen. В США Федеральная комиссия по торговле (FTC) поручила мейкер с ложной рекламой для своих требований по улучшению памяти.
Открытие
Работа над аквориным началась с Э. Ньютон Харвьте в 1921 году , хотя Харви не удались продемонстрировать классические люциферазы - люциферин реакции, он показал , что вода может производить свет от высушенных photocytes и что свет может быть получен даже при отсутствии кислорода. Позже Симомура начала работу в биолюминесценцию из Aequorea в 1961 г. Это включало утомительный сбор десятков тысяч медуз из доков в Friday Harbor, Вашингтон . Было установлено, что свет может быть получен из экстрактов с морской водой, а точнее с кальцием . Также было отмечено, что во время экстракции животное излучает зеленый свет из-за присутствия зеленого флуоресцентного белка , который меняет естественный синий свет экворина на зеленый.
Хотя основное внимание в его работе было уделено биолюминесценции, Шимомура и двое других, Мартин Чалфи и Роджер Циен , были удостоены Нобелевской премии в 2008 году за свою работу над зелеными флуоресцентными белками .
Состав
Экворин является голопротеин состоит из двух отдельных единиц, апобелки , что называется apoaequorin , которая имеет приблизительную молекулярную массу 21 кДа , и простетической группа коэлентеразина , люциферина. Другими словами, апоаэкорин - это фермент, вырабатываемый фотоцитами животного, а целентеразин - это субстрат, окисление которого фермент катализирует. Когда целентеразин связан, он называется экворин. Примечательно, что белок содержит три ручных мотива EF, которые функционируют как сайты связывания для ионов Ca 2+ . Белок является членом суперсемейства кальций-связывающих белков, из которых насчитывается около 66 подсемейств.
Кристаллическая структура показала , что акворина связывает коэлентеразин и кислород в виде пероксида , коэлентеразином-2-гидропероксида. Сайт связывания для первых двух атомов кальция показывает в 20 раз большее сродство к кальцию, чем третий сайт. Однако более ранние утверждения о том, что только две EF-руки связывают кальций, были подвергнуты сомнению, когда более поздние структуры показали, что все три сайта действительно могут связывать кальций. Таким образом, исследования титрования показывают, что все три сайта связывания кальция активны, но для запуска ферментативной реакции необходимы только два иона.
Другие исследования показали наличие внутренней цистеиновой связи, которая поддерживает структуру экворина. Это также объясняет потребность в тиоловом реагенте, таком как бета-меркаптоэтанол, для регенерации белка, поскольку такие реагенты ослабляют сульфгидрильные связи между остатками цистеина, ускоряя регенерацию экворина.
Химическая характеристика акворина указывает на то, что белок в некоторой степени устойчив к суровым воздействиям. Экуорин термостойкий. После выдержки при 95 ° C в течение 2 минут белок потерял только 25% активности. Денатуранты, такие как 6-М мочевина или 4-М гуанидин гидрохлорид, не разрушали белок.
Генетика
Aequorin предположительно кодируется в геноме Aequorea. По крайней мере, четыре копии гена были выделены в виде кДНК от животного. Поскольку геном не был секвенирован, неясно, могут ли варианты кДНК составлять все изоформы белка.
Механизм действия
Ранние исследования биолюминесценции из Aequorea по Э. Ньютон Харви отметили , что биолюминесценции появляются в виде кольца вокруг колокола, и происходят даже в отсутствии воздуха. Это было замечательно, потому что для большинства реакций биолюминесценции требуется кислород , и привело к мысли, что животные каким-то образом хранят кислород. Позже было обнаружено, что апопротеин может стабильно связывать целентеразин-2-гидропероксид, и для регенерации до этой активной формы экворина требуется кислород. Однако в присутствии ионов кальция белок претерпевает конформационные изменения и превращает свою простетическую группу, целентеразин-2-гидропероксид в возбужденный целентерамид и CO 2 . Когда возбужденный целентерамид релаксирует до основного состояния, излучается синий свет ( длина волны 465 нм). До замены целентерамида весь белок все еще имеет флуоресцентный синий цвет. Из - за связи между биолюминесценцией и флуоресценцией , это свойством было в конечном счете , важно в открытии люциферина коэлентеразина .
Приложения
Поскольку излучаемый свет можно легко обнаружить с помощью люминометра , эккорин стал полезным инструментом в молекулярной биологии для измерения уровней внутриклеточного Ca 2+ . Ранняя успешная очистка эккорина привела к первым экспериментам, включающим инъекцию белка в ткани живых животных для визуализации физиологического высвобождения кальция в мышечных волокнах ракушечника. С тех пор белок широко используется во многих модельных биологических системах , включая рыбок данио , крыс , мышей и культивируемые клетки .
Культивируемые клетки, экспрессирующие ген акворина , могут эффективно синтезировать апоаэкорин; однако рекомбинантная экспрессия дает только апопротеин . Следовательно, необходимо добавить коэлентеразин в культуральную среду клеток для получения функционального белка и, таким образом, использовать его синее излучение для измерения концентрации Ca 2+ . Целентеразин представляет собой гидрофобную молекулу и поэтому легко проникает через клеточные стенки растений и грибов , а также через плазматическую мембрану высших эукариот, что делает экуорин пригодным в качестве репортера Ca 2+ в растениях, грибах и клетках млекопитающих.
Экуорин имеет ряд преимуществ перед другими индикаторами Ca 2+ . Поскольку белок большой, он имеет низкую скорость утечки из клеток по сравнению с липофильными красителями, такими как DiI . В нем отсутствуют явления внутриклеточной компартментализации или секвестрации, которые часто наблюдаются для чувствительных к напряжению красителей , и не нарушаются функции клеток или развитие эмбриона. Более того, свет, излучаемый при окислении целентеразина, не зависит от какого-либо оптического возбуждения, поэтому проблемы с автофлуоресценцией устраняются. Основным ограничением экворина является то, что коэлентеразин простетической группы необратимо расходуется для получения света и требует постоянного добавления коэлентеразина в среду. Такие проблемы привели к разработке других генетически закодированных сенсоров кальция, включая сенсор Cameleon на основе кальмодулина , разработанный Роджером Циеном , и сенсор на основе тропонина TN-XXL , разработанный Оливером Грисбеком.
Маркетинговые и юридические проблемы
Апоэкуорин является ингредиентом Prevagen, который продается Quincy Bioscience как добавка для улучшения памяти. В 2017 году Федеральная торговая комиссия США (FTC) обвинила производителя в ложной рекламе о том, что продукт улучшает память, обеспечивает когнитивные преимущества и «клинически доказал» свою эффективность. Согласно FTC, «маркетологи Prevagen опирались на страхи пожилых потребителей, испытывающих возрастную потерю памяти ». Куинси сказал, что будет оспаривать обвинения.
Перед иском клиническое испытание, проведенное исследователями, нанятыми Quincy Bioscience, «не выявило общего преимущества по сравнению с плацебо для его основных конечных точек, включая память и познание», в то время как реклама компании вводила в заблуждение несколько оспариваемых анализов подгрупп, которые показали небольшие улучшения.
Иск ( Спат и др. Против Quincy Bioscience Holding Company, Inc. и др. , Дело № 18-cv-12416, штат Нью-Джерси) был отклонен в окружном суде, но была подана апелляция с просьбой об отмене увольнения. . Иск был объединен с другим иском против Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Дело № 17-cv-784, D. NJ), которое было основным делом.
21 февраля 2019 года Апелляционный суд США второго округа постановил, что Федеральная торговая комиссия и штат Нью-Йорк могут продолжить судебный процесс против Quincy Bioscience по его утверждениям о том, что Prevagen может улучшить память. Приказ поступил менее чем через две недели после того, как стороны обсудили дело перед коллегией из трех судей округа, где юристы компании признали, что они «не оспаривали, что если вы посмотрите на всех 211 человек, завершивших исследование, статистически значимых результатов не было. разница". Суд решительно отклонил утверждения юристов компании о том, что FTC преследовала свои действия по политическим мотивам.
23 марта 2020 года федеральный судья магистрата в окружном суде США по Южному округу штата Флориды поступил доклад и рекомендацию , удостоверяющий общенациональную акцию класса для класса потребителей , которые приобрели Prevagen за предыдущие четыре года. Судебный процесс по делу назначен на октябрь 2020 года.
Доктор Харриет Холл , пишущий для Science-Based Medicine , отмечает, что исследование, спонсируемое Куинси (известное как «Мэдисонское исследование памяти»), было отрицательным, но компания использовала p-hacking для получения благоприятных результатов. Она отмечает, что все цитируемые ими исследования безопасности - это исследования на крысах, и их утверждение о том, что апоэкуорин проникает через гематоэнцефалический барьер , основано исключительно на исследовании на собаках. Американская ассоциация фармацевтов предупреждает , что Apoaequorin «вряд ли будет поглощено в значительной степени, а не деградирует в аминокислоты».