Однослойная липосома - Unilamellar liposome
Однослойными липосомами представляет собой сферическую камеру / пузырек, ограничены одной бислой с амфифильного липида или смеси таких липидов, содержащих водный раствор внутри камеры. Однослойные липосомы используются для изучения биологических систем и имитации клеточных мембран, и их классифицируют на три группы в зависимости от их размера: небольшие однослойные липосомы / везикулы (SUV) с размером диапазона 20–100 нм, большие однослойные липосомы / везикулы ( LUVs) размером 100–1000 нм и гигантские однослойные липосомы / везикулы (GUV) размером 1–200 мкм. GUV в основном используются в качестве моделей биологических мембран в исследовательских работах. Клетки животных имеют размер 10–30 мкм, а клетки растений - обычно 10–100 мкм. Органеллы даже меньшего размера, такие как митохондрии, обычно имеют размер 1-2 мкм. Следовательно, правильная модель должна учитывать размер исследуемого образца. Кроме того, размер везикул определяет кривизну их мембран, что является важным фактором при изучении гибридных белков. SUV имеют более высокую кривизну мембраны, и везикулы с высокой кривизной мембраны могут способствовать слиянию мембран быстрее, чем везикулы с более низкой кривизной мембраны, такие как GUV.
Состав и характеристики клеточной мембраны различаются в разных клетках (растительные клетки, клетки млекопитающих, бактериальные клетки и т. Д.). В двухслойной мембране часто состав фосфолипидов во внутренних и внешних листках различается. Фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и сфингомиелин являются одними из наиболее распространенных липидов мембран большинства животных клеток. Эти липиды сильно различаются по заряду, длине и состоянию насыщения. Присутствие ненасыщенных связей (двойных связей) в липидах, например, создает перегиб в ацильных цепях, который дополнительно изменяет упаковку липидов и приводит к более рыхлой упаковке. Следовательно, состав и размеры однослойных липосом необходимо тщательно выбирать в зависимости от предмета исследования.
Каждая структура липидного бислоя в целом сопоставима с организацией липидов ламеллярной фазы в биологических мембранах . Напротив, мультиламеллярные липосомы (MLV) состоят из множества концентрических амфифильных липидных бислоев, аналогичных слоям лука, и MLV могут иметь переменные размеры до нескольких микрометров.
Подготовка
Маленькие однослойные пузырьки и большие однослойные пузырьки
Существует несколько методов приготовления однослойных липосом, и протоколы различаются в зависимости от типа желаемых однослойных везикул. Можно купить различные липиды, растворенные в хлороформе или лиофилизированные липиды. В случае лиофилизированных липидов они могут растворяться в хлороформе. Затем липиды смешивают в желаемом молярном соотношении. Затем хлороформ выпаривают в слабом потоке азота (чтобы избежать контакта с кислородом и окисления липидов) при комнатной температуре. Роторный испаритель может быть использован , чтобы сформировать однородный слой липосом. На этом этапе удаляется основная часть хлороформа. Чтобы удалить остатки захваченного хлороформа, липиды помещают под вакуум от нескольких часов до ночи. Следующим этапом является регидратация, при которой высушенные липиды повторно суспендируют в желаемом буфере. Липиды можно встряхивать в течение нескольких минут, чтобы убедиться, что все липидные остатки ресуспендированы. Внедорожники можно получить двумя способами. Либо обработкой ультразвуком (например, импульсами в 1 секунду с циклами 3 Гц при мощности 150 Вт), либо экструзией. В методе экструзии липидную смесь пропускают через мембрану 10 или более раз. В зависимости от размера мембраны могут быть получены как SUV, так и LUV. Хранение пузырьков в атмосфере аргона, вдали от кислорода и света может продлить их жизнь.
Гигантские однослойные пузырьки
Естественное набухание: в этом методе растворимые липиды в хлороформе наносятся пипеткой на тефлоновое кольцо. Хлороформу дают испариться, а затем кольцо помещают под вакуум на несколько часов. Затем водный буфер осторожно добавляют через тефлоновое кольцо и липидам дают естественным образом набухнуть с образованием GUV в течение ночи. Недостатком этого метода является образование большого количества многослойных везикул и липидных остатков.
Гальванопластика: в этом методе липиды помещаются на токопроводящее покровное стекло (оксид индия и олова или стекло с покрытием из ITO) или на Pt-проволоку вместо тефлонового кольца, и после вакуумирования на высушенные липиды помещается буфер, который сжимается с помощью второго токопроводящего покровное стекло. Затем прикладывается электрическое поле определенной частоты и напряжения, которое способствует образованию ГУВ. Для полиненасыщенных липидов этот метод может вызвать значительный окислительный эффект на везикулы. Тем не менее, это очень распространенный и надежный метод создания GUV. Существуют модифицированные подходы, в которых используется набухание с помощью геля (набухание с помощью агарозы или набухание с помощью PVA) для образования GUV в более биологически релевантных условиях.
Существует множество методов инкапсуляции биологических реагентов в GUV с использованием границ раздела вода-масло в качестве каркаса для сборки липидных слоев. Это позволяет использовать GUV в качестве мембранных контейнеров, подобных клеткам, для воссоздания (и исследования) биологических функций in vitro. Эти методы инкапсуляции включают микрофлюидные методы, которые позволяют получать везикулы с постоянным размером с высоким выходом.
Приложения
Фосфолипидов липосомы используются в качестве целевых доставки лекарств систем. Гидрофильные лекарственные средства можно переносить в виде раствора внутри SUV или MLV, а гидрофобные лекарственные средства могут быть включены в липидный бислой этих липосом. При введении в кровоток тела человека / животного МЖВ преимущественно поглощаются фагоцитарными клетками , и, таким образом, лекарства могут быть нацелены на эти клетки. Для общей или полной доставки могут использоваться внедорожники. Для местного нанесения на кожу можно использовать специальные липиды, такие как фосфолипиды и сфинголипиды , для изготовления липосом, не содержащих лекарств, в качестве увлажняющих средств, а также с лекарствами, например, для защиты от ультрафиолетового излучения.
В биомедицинских исследованиях однослойные липосомы чрезвычайно полезны для изучения биологических систем и имитации функций клеток. Поскольку живую клетку очень сложно изучать, однослойные липосомы представляют собой простой инструмент для изучения событий взаимодействия мембран, таких как слияние мембран , локализация белка в плазматической мембране, изучение ионных каналов и т. Д.