Одномолекулярный эксперимент - Single-molecule experiment

Одиночные молекулы полимера (цепи толщиной 0,4 нм) зарегистрированы в водной среде при различном pH с помощью АСМ . Резкое изменение конформации полимерной цепи наблюдается при небольшом изменении pH.

Одной молекулой эксперимент эксперимент , который исследует свойства отдельных молекул . Исследования одиночных молекул можно противопоставить измерениям на ансамбле или совокупности молекул, где невозможно различить индивидуальное поведение молекул и можно измерить только средние характеристики. Поскольку многие методы измерения в биологии, химии и физике недостаточно чувствительны для наблюдения отдельных молекул, методы флуоресценции отдельных молекул (которые появились с 1990-х годов для исследования различных процессов на уровне отдельных молекул) вызвали большой интерес, поскольку они предоставил много новых деталей об измеряемых процессах, которые были недоступны в прошлом. Действительно, с 1990-х годов было разработано множество методов исследования отдельных молекул.

Первые эксперименты с одной молекулой были экспериментами с фиксацией заплат, проведенными в 1970-х, но они были ограничены изучением ионных каналов . Сегодня системы, исследуемые с использованием методов одиночных молекул, включают движение миозина по актиновым филаментам в мышечной ткани и спектроскопические детали отдельных локальных сред в твердых телах. Конформации биологических полимеров были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью силовой спектроскопии отдельные молекулы (или пары взаимодействующих молекул), обычно полимеры , можно механически растянуть, а их упругий отклик записать в реальном времени.

История

В газовой фазе при сверхнизких давлениях, одной молекулы эксперименты были вокруг в течение многих десятилетий, но в конденсированной фазе только с 1989 года , с работами WE Moerner и Лотар Kador. Годом позже Мишель Оррит и Джеки Бернар смогли продемонстрировать обнаружение поглощения одиночных молекул по их флуоресценции.

Многие методы позволяют наблюдать одну молекулу за раз, в первую очередь масс-спектрометрия , при которой обнаруживаются отдельные ионы. Для этого один из самых ранних средств обнаружения одиночных молекул, возникла в области ионных каналов с развитием патч зажима техники по Эрвин Неер и Берт Сакман (который позже пошел на Нобелевскую премию за их плодотворный вклад). Однако идея измерения проводимости для наблюдения за отдельными молекулами наложила серьезное ограничение на вид систем, которые можно было наблюдать.

Флуоресценция - это удобный способ наблюдения за одной молекулой за раз, в основном из-за чувствительности коммерческих оптических детекторов, способных подсчитывать одиночные фотоны. Однако спектроскопически наблюдение одной молекулы требует, чтобы молекула находилась в изолированном окружении и чтобы она испускала фотоны при возбуждении, что благодаря технологии обнаружения одиночных фотонов с помощью фотоумножителей (ФЭУ) или лавинных фотодиодов (ЛФД), позволяет регистрировать события эмиссии фотонов с большой чувствительностью и временным разрешением.

В последнее время флуоресценция одиночных молекул является предметом повышенного интереса для биологической визуализации благодаря маркировке биомолекул, таких как белки и нуклеотиды, для изучения ферментативной функции, которую нелегко изучить в массовом масштабе из-за тонких зависящих от времени движений в катализе и структурная реорганизация. Наиболее изученным белком был класс ферментов миозин / актин, обнаруженных в мышечных тканях. С помощью методов с одной молекулой ступенчатый механизм был обнаружен и охарактеризован во многих из этих белков.

Наноманипуляторы, такие как атомно-силовой микроскоп , также подходят для экспериментов с одной молекулой, имеющих биологическое значение, поскольку они работают в той же шкале длины, что и большинство биологических полимеров. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) подходит для исследования молекул синтетических полимеров. АСМ предоставляет уникальную возможность трехмерной визуализации полимерных цепей. Например, режим постукивания АСМ достаточно щадящий для регистрации адсорбированных молекул полиэлектролита (например, цепей поли (2-винилпиридина) толщиной 0,4 нм) в жидкой среде. Расположение двухцепочечной суперпозиции соответствует в этих экспериментах двойной толщине одиночной цепи (0,8 нм в случае упомянутого примера). При применении подходящих параметров сканирования конформация таких молекул остается неизменной в течение нескольких часов, что позволяет проводить эксперименты в жидких средах, обладающих различными свойствами. Кроме того, контролируя силу между зондом и образцом, можно получить изображения высокого разрешения. Оптический пинцет также использовался для изучения и количественной оценки ДНК-белковых взаимодействий.

Об экспериментах

Концепция

Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул использует флуоресценцию молекулы для получения информации о ее окружении, структуре и положении. Этот метод дает возможность получать информацию, которая иначе была бы недоступна из-за усреднения по ансамблю (то есть сигнал, полученный при одновременной записи множества молекул, представляет собой усредненное свойство динамики молекул). Результатом многих экспериментов с отдельными молекулами являются траектории с двумя состояниями .

Одноканальная запись

Два примера данных (~ 10 с каждый) из эксперимента с одноканальной записью с использованием метода фиксации патча. Верхний график имеет более низкую концентрацию, а нижний график записан при концентрации агониста, близкой к ЕС ₅₀ этого ионного канала . Отверстия каналов представлены отклонениями вниз, в данном случае отклонениями приблизительно 5 пА.

Как и в случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул, метод, известный как одноканальная запись, может использоваться для получения конкретной кинетической информации - в данном случае о функции ионного канала, - которая недоступна, когда выполняется ансамблевой записи, такой как запись всей клетки. выполнено. В частности, ионные каналы чередуются между проводящими и непроводящими классами, которые различаются по конформации. Следовательно, функциональное состояние ионных каналов может быть непосредственно измерено с помощью достаточно чувствительной электроники при условии принятия надлежащих мер предосторожности для минимизации шума. В свою очередь, каждый из этих классов можно разделить на одно или несколько кинетических состояний, имеющих прямое отношение к основной функции ионного канала. Выполнение этих типов исследований отдельных молекул в систематически меняющихся условиях (например, концентрация и структура агониста, проникающий ион и / или блокатор каналов, мутации в аминокислотах ионного канала) может предоставить информацию относительно взаимного преобразования различных кинетических состояний ионного канала. В минимальной модели ионного канала есть два состояния : открытое и закрытое. Однако для точного представления данных часто требуются другие состояния, включая несколько закрытых состояний, а также неактивные и / или десенсибилизированные состояния, которые являются непроводящими состояниями, которые могут возникать даже при наличии стимула.

Маркировка биомолекул

Отдельные флуорофоры могут быть химически присоединены к биомолекулам, таким как белки или ДНК, а динамику отдельных молекул можно отслеживать, отслеживая флуоресцентный зонд. Можно отслеживать пространственные движения в пределах предела Рэлея , а также изменения интенсивности излучения и / или радиационного времени жизни, которые часто указывают на изменения в местной окружающей среде. Например, мечение одиночных молекул дало огромное количество информации о том, как моторные белки кинезина перемещаются по нитям микротрубочек в мышечных клетках.

Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул (FRET)

Основная статья smFRET .

При резонансном переносе энергии флуоресценции одной молекулы молекула помечена (как минимум) в двух местах. Луч лазера фокусируется на молекуле, возбуждающей первый зонд. Когда этот зонд расслабляется и излучает фотон, у него есть шанс возбудить другой зонд. Эффективность поглощения фотона, испускаемого первым датчиком, во втором датчике зависит от расстояния между этими датчиками. Поскольку расстояние меняется со временем, этот эксперимент исследует внутреннюю динамику молекулы.

Одномолекулярные эксперименты против ансамблевых экспериментов

При просмотре данных, относящихся к отдельным молекулам, обычно можно построить пропагаторы и функции плотности вероятности времени скачка первого порядка, второго порядка и т. Д., Тогда как из массовых экспериментов обычно получают затухание корреляционной функции. Из информации, содержащейся в этих уникальных функциях (полученных от отдельных молекул), можно получить относительно ясную картину поведения системы; например, его кинетическая схема , или его потенциал активности, или его уменьшенные размеры . В частности, можно построить (многие свойства) путь реакции фермента при мониторинге активности отдельного фермента. Кроме того, некоторые авторы описали важные аспекты, касающиеся анализа данных по отдельным молекулам, такие как методы подбора и тесты для гомогенных популяций. С другой стороны, есть несколько проблем, связанных с анализом данных по отдельным молекулам, включая создание среды с низким уровнем шума и изолированные наконечники пипеток, фильтрацию некоторых оставшихся нежелательных компонентов (шум), обнаруженных в записях, и продолжительность времени, необходимого для сбора данных. анализ (предварительная обработка, однозначное обнаружение событий, построение данных, подгонка кинетических схем и т. д.).

Влияние

Одномолекулярные методы повлияли на оптику, электронику, биологию и химию. В биологических науках изучение белков и других сложных биологических механизмов ограничивалось ансамблевыми экспериментами, что делало почти невозможным прямое наблюдение их кинетики. Например, только после того, как для изучения пар кинезин-миозин в мышечной ткани была использована флуоресцентная микроскопия одиночных молекул, стало возможным прямое наблюдение за механизмами ходьбы. Эти эксперименты, однако, по большей части ограничивались исследованиями in vitro, поскольку полезные методы визуализации живых клеток еще не были полностью реализованы. Однако перспективность визуализации одиночных молекул in vivo дает огромный потенциал для непосредственного наблюдения за биомолекулами в естественных процессах. Эти методы часто используются для исследований с участием белков с низким содержанием копий, многие из которых все еще открываются. Эти методы также были расширены для изучения областей химии, включая отображение неоднородных поверхностей.

Languages

In other projects