Субкультура (биология) - Subculture (biology)
В биологии , субкультура новая клетка или микробиологические культуры производится путем передачи некоторых или всех клеток из предыдущей культуры в свежую среду роста . Это действие называется субкультивированием или пассированием клеток. Субкультура используется для продления жизни и / или увеличения количества клеток или микроорганизмов в культуре.
Роль
Клеточные линии и микроорганизмы не могут оставаться в культуре бесконечно из-за постепенного увеличения токсичных метаболитов , использования питательных веществ и увеличения количества клеток из-за роста. Как только питательные вещества истощаются и уровни токсичных побочных продуктов увеличиваются, бактерии в ночной культуре переходят в стационарную фазу , где пролиферация значительно снижается или прекращается (плато значений плотности клеток). Когда микроорганизмы из этой ночной культуры переносятся в свежую среду, питательные вещества запускают рост микроорганизма, и он проходит через лаг-фазу , период медленного роста и адаптации к новой среде, а затем лог-фазу , период, когда клетки растут в геометрической прогрессии.
Таким образом, субкультура используется для получения новой культуры с более низкой плотностью клеток, чем исходная культура, свежими питательными веществами и отсутствием токсичных метаболитов, что позволяет продолжать рост клеток без риска гибели клеток. Субкультура важна как для пролиферирующих (например, таких микроорганизмов, как E. coli ), так и для непролиферирующих (например, окончательно дифференцированных лейкоцитов ) клеток. Субкультивирование также можно использовать для расчета кривой роста (например, времени генерации) и получения микроорганизмов в лог-фазе для экспериментов (например, бактериальной трансформации).
Как правило, субкультура происходит из культуры определенного объема в свежую питательную среду равного объема, что обеспечивает долгосрочное поддержание линии клеток. Субкультуру в больший объем питательной среды используют, когда нужно увеличить количество клеток, например, для использования в промышленном процессе или научном эксперименте.
Номер прохода
Часто важно записывать приблизительное количество делений клеток в культуре, записывая количество пассажей или субкультур. В случае клеток ткани растений сомаклональные вариации могут возникать в течение длительного периода в культуре. Точно так же в клеточных линиях млекопитающих хромосомные аберрации имеют тенденцию увеличиваться с течением времени. У микроорганизмов есть тенденция адаптироваться к условиям культивирования, что редко бывает точно таким же, как естественная среда микроорганизма, что может изменить их биологию.
Протоколы прохождения
Протокол субкультивирования клеток во многом зависит от свойств клеток.
Неприлипающие клетки
Многие типы клеток, в частности, многие микроорганизмы, растут в растворе и не прикрепляются к поверхности. Эти типы клеток можно субкультивировать, просто взяв небольшой объем родительской культуры и разбавив его свежей питательной средой. Плотность клеток в этих культурах обычно измеряется в клетках на миллилитр для крупных эукариотических клеток или как оптическая плотность для 600 нм света для более мелких клеток, таких как бактерии. Клетки часто будут иметь предпочтительный диапазон плотностей для оптимального роста, и субкультивирование обычно будет пытаться удерживать клетки в этом диапазоне.
Адгезивные клетки
Прилипшие клетки, например многие линии клеток млекопитающих, растут прикрепленными к поверхности, такой как дно культуральной колбы . Эти типы клеток необходимо отделить от поверхности, прежде чем их можно будет субкультивировать. Для прикрепленных клеток плотность клеток обычно измеряется в терминах конфлюэнтности , процента ростовой поверхности, покрытой клетками. Клетки часто будут иметь предпочтительный диапазон конфлюэнтностей для оптимального роста, например, линии клеток млекопитающих, такие как HeLa или Raw 264.7, обычно предпочитают конфлюэнтности более 10%, но менее 100%, и субкультура обычно пытается удерживать клетки в этом диапазоне. Для субкультуры клетки могут быть отделены одним из нескольких методов, включая обработку трипсином для разрушения белков, ответственных за поверхностное прилипание, хелатирование ионов кальция с помощью ЭДТА, которое нарушает некоторые механизмы прилипания белка, или механические методы, такие как повторная промывка или использование скребка для клеток. Затем отделенные клетки ресуспендируют в свежей среде для выращивания и дают им возможность снова осесть на их поверхность для роста.