Искусственная хромосома человека - Human artificial chromosome
Человеческие искусственная хромосома ( HAC ) является микрохромосомами , которые могут выступать в качестве новой хромосомы в популяции человека клеток. То есть вместо 46 хромосом в клетке может быть 47, при этом 47-я очень мала, размером примерно 6–10 мегабаз (МБ) вместо 50–250 МБ для естественных хромосом и способна нести новые гены, введенные исследователями на людях. . В идеале исследователи могли бы интегрировать разные гены, которые выполняют множество функций, включая защиту от болезней .
Альтернативные методы создания трансгенов , например, с использованием дрожжевых искусственных хромосом и бактериальных искусственных хромосом , приводят к непредсказуемым проблемам. Генетический материал, введенный этими векторами, не только приводит к различным уровням экспрессии, но и вставки также нарушают исходный геном. В этом отношении HAC различаются, поскольку они представляют собой полностью отдельные хромосомы. Такое отделение от существующего генетического материала предполагает, что никаких инсерционных мутантов не возникнет. Эта стабильность и точность делают HAC предпочтительнее других методов, таких как вирусные векторы , YAC и BAC. HAC позволяют доставлять больше ДНК (включая промоторы и вариации числа копий ), чем это возможно с вирусными векторами.
Искусственные хромосомы дрожжей и бактериальные искусственные хромосомы были созданы раньше, чем искусственные хромосомы человека, которые были впервые разработаны в 1997 году . HAC полезны в исследованиях экспрессии в качестве векторов для переноса генов , в качестве инструмента для выяснения функции хромосом человека и в качестве метода активного аннотирования генома человека .
История
HAC были впервые сконструированы de novo в 1997 году путем добавления альфа-сателлитной ДНК к теломерной и геномной ДНК в человеческих клетках HT1080 . Это привело к созданию совершенно новой микрохромосомы , содержащей интересующую ДНК, а также элементы, позволяющие ей быть структурно и митотически стабильной, такие как теломерные и центромерные последовательности. Из-за сложности образования HAC de novo от этого метода в основном отказались.
Методы строительства
В настоящее время существуют две общепринятые модели создания векторов искусственных хромосом человека. Первый - создать небольшую минихромосому путем изменения естественной хромосомы человека. Это достигается путем усечения естественной хромосомы с последующим введением уникального генетического материала через систему рекомбинации Cre-Lox . Второй метод предполагает буквальное создание новой хромосомы de novo . Прогресс в отношении образования de novo HAC был ограничен, так как многие большие геномные фрагменты не могут успешно интегрироваться в векторы de novo . Другим фактором, ограничивающим образование вектора de novo, является ограниченное знание того, какие элементы необходимы для конструирования, особенно центромерных последовательностей. Однако проблемы, связанные с центромерными последовательностями, начали преодолеваться.
Приложения
Исследование 2009 года показало дополнительные преимущества HAC, а именно их способность стабильно содержать чрезвычайно большие геномные фрагменты. Исследователи включили ген дистрофина размером 2,4 Mb, мутация которого является ключевым причинным элементом мышечной дистрофии Дюшенна . Полученный HAC был митотически стабильным и правильно экспрессировал дистрофин у химерных мышей. Предыдущие попытки правильно выразить дистрофин потерпели неудачу. Из-за своего большого размера он никогда ранее не был успешно интегрирован в вектор.
В 2010 году было сообщено об усовершенствованной искусственной хромосоме человека под названием 21HAC. 21HAC основан на разрезанной копии хромосомы 21 человека, производящей хромосому длиной 5 Mb. Усечение хромосомы 21 привело к созданию искусственной хромосомы человека, которая была митотически стабильной. 21HAC также мог переноситься в клетки различных видов (мышей, кур, людей). Используя 21HAC, исследователи смогли вставить ген, кодирующий тимидинкиназу вируса простого герпеса, в опухолевые клетки. Этот «суицидный ген» необходим для активации многих противовирусных препаратов. Эти опухолевые клетки-мишени были успешно и избирательно уничтожены противовирусным препаратом ганцикловиром в популяции, включающей здоровые клетки. Это исследование открывает множество возможностей для использования HAC в генной терапии.
В 2011 году исследователи сформировали искусственную хромосому человека путем усечения хромосомы 14. Затем с помощью системы рекомбинации Cre-Lox был введен генетический материал . В этом конкретном исследовании основное внимание уделялось изменениям уровней экспрессии, оставляя части существующей геномной ДНК. Оставив существующие теломерные и субтеломерные последовательности, исследователи смогли увеличить уровни экспрессии генов, кодирующих продукцию эритропоэтина, более чем в 1000 раз. Эта работа также имеет большое значение для генной терапии, поскольку эритропоэтин контролирует образование красных кровяных телец.
HAC были использованы для создания трансгенных животных для использования в качестве животных моделей болезней человека и для производства терапевтических продуктов.