Flow-FISH - Flow-FISH

Flow-FISH (флуоресцентная гибридизация in-situ) - это цитогенетический метод для количественного определения количества копий РНК или конкретных повторяющихся элементов в геномной ДНК целых популяций клеток с помощью комбинации проточной цитометрии с протоколами цитогенетической флуоресцентной гибридизации in situ .

Flow-FISH чаще всего используется для количественной оценки длины теломер , которые представляют собой участки повторяющейся ДНК (гексамерные повторы TTAGGG) на дистальных концах хромосом в лейкоцитах человека , и полуавтоматический метод для этого был опубликован в журнале Nature. Протоколы . Теломер длина в белых кровяных клеток была предметом интереса , так как длину теломер в этих типах клеток (а также других соматических тканей) постепенно уменьшается по продолжительности жизни человека, в результате чего клетки увядания , апоптоз , или трансформации . Было показано, что это снижение является суррогатным маркером сопутствующего уменьшения длины теломер пула гемопоэтических стволовых клеток , причем линия гранулоцитов дает лучший признак, предположительно из-за отсутствия подтипа долгоживущей памяти и сравнительно быстрого обмена эти клетки.

Flow-FISH также подходит для одновременного обнаружения РНК и белка . Это позволяет идентифицировать клетки, которые не только экспрессируют ген , но и переводят его в белок . Этот тип поток-FISH был использован для изучения латентной инфекции от вирусов , таких как ВИЧ-1 и EBV , но и для отслеживания одной клетки на экспрессию генов и перевода в белка.

Q-FISH в Flow-FISH

Flow-FISH был впервые опубликован в 1998 году Rufer et al. в качестве модификации другого метода анализа длины теломер, Q-FISH , который использует пробы пептидных нуклеиновых кислот последовательности 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5 ', меченных флуорофором флуоресцина, для окрашивания теломерных повторов на подготовленных метафазных участках клеток, которые были обработаны с колцемидом , гипотоническим шоком и фиксацией на предметных стеклах с помощью обработки метанолом / уксусной кислотой. Изображения образовавшихся флуоресцентных пятен можно затем проанализировать с помощью специальной компьютерной программы для получения количественных значений флуоресценции, которые затем можно использовать для оценки фактической длины теломер. Флуоресценция, полученная при окрашивании зонда, считается количественной, поскольку ПНК связывается преимущественно с ДНК при низких концентрациях ионной соли и в присутствии формамида , поэтому дуплекс ДНК может не преобразоваться после того, как он был расплавлен и отожжен с зондом ПНК , что позволяет зонду для насыщения своей целевой повторяющейся последовательности (поскольку она не вытесняется из целевой ДНК конкурирующей антисмысловой ДНК на комплементарной цепи), таким образом обеспечивая надежное и количественное считывание частоты зонда-мишени ПНК на данном хромосомном участке после смывания несвязанный зонд.

ДНК денатурируется нагреванием и обработкой формамидом, зонду PNA дают возможность гибридизоваться, избыток зонда смывают, считывание проводят в проточном цитометре.

Инновации

В отличие от Q-FISH, Flow-FISH использует количественные свойства теломер-специфичного удерживания зонда PNA для количественной оценки медианной флуоресценции в популяции клеток с использованием проточного цитометра вместо флуоресцентного микроскопа. Основным преимуществом этого метода является то, что он устраняет время, необходимое в Q-FISH для подготовки метафазных распределений представляющих интерес клеток, и что проточно-цитометрический анализ также значительно быстрее, чем методы, необходимые для получения и анализа слайдов, подготовленных Q-FISH. Таким образом, Flow-FISH позволяет проводить более производительный анализ длины теломер в лейкоцитах крови, которые являются легкодоступной формой образца ткани человека. Самые последние версии метода flow-FISH включают в себя внутреннюю контрольную популяцию тимоцитов коровы с известной длиной теломер, определяемой TRF или анализом рестрикционных фрагментов теломер, с которым можно сравнивать флуоресценцию данного неизвестного образца. Поскольку тимоциты коровы поглощают краситель LDS751 в меньшей степени, чем их аналоги человека, их можно надежно дифференцировать с помощью построения графиков и стробирования желаемых популяций. Другие типы клеток, которые в прошлом не были признаны хорошими кандидатами для проточной FISH, могут быть проанализированы путем извлечения ядер и применения метода непосредственно на них.

Многопараметрический анализ позволяет дифференцировать типы клеток в одном образце, обеспечивая внутренний контроль и анализ подтипов лейкоцитов.

использованная литература

  1. ^ a b Баерлохер GM, Vulto I, de Jong G, Lansdorp PM. Проточная цитометрия и FISH для измерения средней длины теломер (flow FISH). Nat Protoc 2006; 1: 2365–2376.
  2. ^ a b c Поричис, Филиппос; Харт, Меган Дж .; Грисбек, Морган; Эверетт, Холли Л .; Хасан, Муска; Бакстер, Эми Э .; Линдквист, Мадлен; Миллер, Сара М .; Soghoian, Damien Z .; Kavanagh, Daniel G .; Рейнольдс, Сьюзен (декабрь 2014 г.). «Высокопроизводительное обнаружение miRNA и ген-специфической мРНК на уровне отдельной клетки с помощью проточной цитометрии» . Nature Communications . 5 (1): 5641. DOI : 10.1038 / ncomms6641 . ISSN  2041-1723 . PMC  4256720 . PMID  25472703 .
  3. ^ Бакстер, Эми Э .; Ниссл, Юлия; Фроментин, Реми; Ричард, Джонатан; Поричис, Филиппос; Массанелла, Марта; Брассар, Натали; Альсахафи, Нирмин; Рути, Жан-Пьер; Финци, Андрес; Хомонт, Николас (октябрь 2017 г.). «Многопараметрическая характеристика редких ВИЧ-инфицированных клеток с использованием метода FISH с потоком РНК» . Протоколы природы . 12 (10): 2029–2049. DOI : 10.1038 / nprot.2017.079 . ISSN  1750-2799 . PMC  5697908 . PMID  28880280 .
  4. ^ Moyzis, RK et al. Высококонсервативная повторяющаяся последовательность ДНК (TTAGGG) n, присутствующая на теломерах хромосом человека. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 85, 6622–6626 (1988).
  5. ^ Harley, CB, Futcher, AB и Greider, CW Теломеры укорачиваются при старении фибробластов человека. Nature 345, 458–460 (1990).
  6. ^ Chang, S., Khoo, CM, Naylor, ML, Maser, RS и DePinho, RA, теломерный кризис: функциональные различия между активацией теломеразы и АЛТ при прогрессировании опухоли. Genes Dev. 17, 88–100 (2003).
  7. ^ Rufer N, Brummendorf TH, Kolvraa S и др. Измерения флуоресценции теломер в субпопуляциях гранулоцитов и Т-лимфоцитов указывают на высокий оборот гемопоэтических стволовых клеток и Т-клеток памяти в раннем детстве. J Exp Med 1999; 190: 157–167.
  8. ^ Грау-Экспосито, Юдифь; Луке-Бальестерос, Лаура; Наварро, Хорди; Курран, Адриан; Бургос, Хоакин; Рибера, Эстебан; Торрелла, Ариадна; Планас, Вивиана; Бадиа, Роза; Мартин-Кастильо, Марио; Фернандес-Сохо, Хесус (19.08.2019). Swanstrom, Рональд (ред.). «Агенты, обращающие латентный период, по-разному влияют на латентный резервуар, присутствующий в различных субпопуляциях CD4 + T» . PLOS Патогены . 15 (8): e1007991. DOI : 10.1371 / journal.ppat.1007991 . ISSN  1553-7374 . PMC  6715238 . PMID  31425551 .
  9. ^ Фурнье, Бенджамин; Бутбоул, Дэвид; Бруно, Жюли; Миот, Чарлин; Буланже, Сесиль; Мальфеттс, Марион; Пелье, Изабель; Даноге, Бертран; Терьер, Бенджамин; Суарес, Фелипе; Бланш, Стефан (2020-11-02). «Быстрая идентификация и характеристика инфицированных клеток в крови во время хронической активной инфекции вируса Эпштейна-Барра» . Журнал экспериментальной медицины . 217 (11): e20192262. DOI : 10,1084 / jem.20192262 . ISSN  0022-1007 . PMC  7596820 . PMID  32812031 .
  10. ^ Николет, Бенуа П .; Гислен, Орели; Уолкерс, Моника К. (15 января 2017 г.). «Комбинированное одноклеточное измерение мРНК цитокинов и белка выявляет Т-клетки с постоянной эффекторной функцией» . Журнал иммунологии . 198 (2): 962–970. DOI : 10.4049 / jimmunol.1601531 . ISSN  0022-1767 .
  11. ^ Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM Динамика длины теломер в субпопуляциях лимфоцитов человека, измеренная с помощью проточной цитометрии. Nature Biotechnol. 16. С. 743–747 (1998).
  12. ^ Egholm, M. et al. ПНК гибридизуется с комплементарными олигонуклеотидами, подчиняясь правилам образования водородных связей Уотсона-Крика. Nature 365, 566–568 (1993).
  13. ^ a b Lansdorp, PM et al. Неоднородность длины теломер хромосом человека. Гм. Мол. Genet. 5, 685–691 (1996).
  14. ^ Baerlocher, GM & Lansdorp, PM Измерения длины теломер в субпопуляциях лейкоцитов с помощью автоматизированной многоцветной проточной FISH. Cytometry A 55, 1–6 (2003).
  15. ^ Wieser, M. et al. Ядерный поток FISH: изоляция ядер клеток улучшает определение длины теломер. Exp. Геронтол. 41, 230–235 (2006).