Аллель-специфический олигонуклеотид - Allele-specific oligonucleotide
Аллель-специфический олигонуклеотид ( АСО ) представляет собой короткий кусок синтетической ДНК , комплементарные к последовательности переменной целевой ДНК. Он действует как зонд на наличие мишени в анализе саузерн-блоттингом или, чаще, в более простом анализе дот-блоттинга . Это распространенный инструмент, используемый в генетическом тестировании , судебной медицине и исследованиях молекулярной биологии .
ASO обычно представляет собой олигонуклеотид длиной 15–21 нуклеотидное основание . Он разработан (и используется) таким образом, что делает его специфичным только для одной версии или аллеля тестируемой ДНК. Длина ASO, из какой цепи она выбрана, и условия, при которых она связана (и отмывается) от целевой ДНК, - все это играет роль в ее специфичности. Эти зонды обычно могут быть разработаны для обнаружения различий всего в 1 основание в генетической последовательности мишени, что является основной способностью анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), важной для анализа генотипов и проекта «Геном человека» . Чтобы быть обнаруженным после того, как он привязался к своей цели, ASO должен быть помечен радиоактивной, ферментативной или флуоресцентной меткой. Технология анализа метилирования Illumina использует преимущества ASO для обнаружения разницы в одной паре оснований (цитозин по сравнению с тимином) для измерения метилирования в конкретном сайте CpG.
Пример
.jpg)
Болезнь человека серповидно - клеточной анемии вызвана генетической мутацией в кодоне для шестой аминокислоты из белка крови бета-гемоглобина . Нормальная последовательность ДНК GAG кодирует глутамат аминокислоты , в то время как мутация изменяет средний аденин на тимин , что приводит к последовательности GTG (GUG в мРНК ). Эта измененная последовательность заменяет валин в конечном белке, искажая его структуру.
Чтобы проверить наличие мутации в образце ДНК, зонд ASO должен быть синтезирован так, чтобы он был комплементарным измененной последовательности, здесь обозначенной как «S». В качестве контроля будет синтезирован другой ASO для нормальной последовательности «A». Каждый ASO полностью комплементарен своей целевой последовательности (и будет сильно связываться), но имеет одно несоответствие со своим нецелевым аллелем (что приводит к более слабому взаимодействию). На первой диаграмме показано, как зонд «S» полностью дополняет цель «S» (вверху), но частично не соответствует цели «A» (внизу).
Сегмент генов бета-гемоглобина в образцах ДНК будет амплифицирован с помощью ПЦР, а полученные продукты будут применяться для дублирования поддерживающих мембран в виде дот-блотов . Нити ДНК образца разделяются щелочью, и каждый зонд ASO наносится на отдельный блот. После гибридизации используется протокол промывки, который позволяет различать полностью комплементарные и несовпадающие гибриды. Несоответствующие ASO смываются с блотов, в то время как совпадающие ASO (и их метки) остаются.
На второй диаграмме шесть образцов амплифицированной ДНК были нанесены на каждый из двух блотов. Обнаружение метки ASO, которая остается после промывки, позволяет напрямую считывать генотип образцов, каждый из которых содержит две копии гена бета-гемоглобина. Образцы 1 и 4 имеют только нормальный аллель «A», тогда как образцы 3 и 5 имеют аллели «A» и «S» (и поэтому являются гетерозиготными носителями этой рецессивной мутации ). Образцы 2 и 6 имеют только аллель «S» и могут быть затронуты этим заболеванием. Показанная небольшая степень «перекрестной гибридизации» является типичной и учитывается в процессе интерпретации окончательных результатов.
Альтернативы
ASO-анализ - лишь один из методов, используемых для выявления генетических полиморфизмов. Прямое секвенирование ДНК используется для первоначальной характеристики мутации, но оно слишком трудоемко для рутинного скрининга. Более ранний метод, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP), не требовал заранее знать изменение последовательности, но требовал, чтобы мутация влияла на сайт расщепления рестрикционного фермента . Анализ RFLP был кратко адаптирован для использования олигонуклеотидных зондов , но этот метод был быстро вытеснен анализом ASO амплифицированной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сама методика ПЦР была адаптирована для выявления полиморфизмов как аллель-специфическая ПЦР . Однако простота и универсальность комбинированного метода ПЦР / ASO привела к его постоянному использованию, в том числе с нерадиоактивными метками, и в формате «обратного дот-блоттинга», где зонды ASO связаны с мембраной и амплифицированным образцом ДНК. используется для гибридизации .
История
Использование синтетических олигонуклеотидов в качестве специфических зондов для вариаций генетической последовательности было впервые предложено Р. Брюсом Уоллесом, работающим в Национальном медицинском центре City of Hope в Дуарте, Калифорния . В 1979 году Уоллес и его коллеги сообщили об использовании зондов ASO для обнаружения вариаций в одноцепочечном бактериальном вирусе, а затем применили этот метод к клонированным генам человека. В 1983 и 1985 годах лаборатория Уоллеса сообщила об обнаружении мутации серповидно-клеточной анемии в образцах цельной геномной ДНК, хотя этому применению препятствовало небольшое количество меток, которые могли переносить ASO.
К счастью, ПЦР, метод значительной амплификации определенного сегмента ДНК, также был описан в 1985 году. Менее чем через год ПЦР была соединена с анализом ASO. Эта комбинация решила проблему маркировки ASO, поскольку количество целевой ДНК можно было амплифицировать более чем в миллион раз. Кроме того, специфичность самого процесса ПЦР может быть добавлена к специфичности зондов ASO, что значительно снижает проблему ложного связывания ASO с нецелевыми последовательностями. Комбинация была достаточно специфичной, чтобы ее можно было использовать в простом дот-блоте , избегая трудоемкого и неэффективного метода саузерн-блоттинга .
Другое использование
ASO-PCR также может использоваться для обнаружения минимального остаточного заболевания при раке крови, таком как множественная миелома .