Циклическая амплификация с неправильным сворачиванием белка - Protein misfolding cyclic amplification
Циклическая амплификация с неправильной упаковкой белков ( PMCA ) - это метод амплификации (концептуально похожий на ПЦР, но не включающий нуклеотиды ) для умножения неправильно свернутых прионов, первоначально разработанный Сото и его коллегами. Это тест на губчатую энцефалопатию, такую как CWD или BSE .
Техника
Первоначально метод инкубирует небольшое количество аномального приона с избытком нормального белка, так что имеет место некоторая конверсия. Затем растущую цепь неправильно свернутого белка обрабатывают ультразвуком , разбивая ее на более мелкие цепи и таким образом быстро увеличивая количество аномального белка, доступного для превращения. При повторении цикла масса нормального белка быстро превращается в тестируемый прион.
Разработка
Первоначально PMCA был разработан для имитации репликации прионов in vitro с эффективностью, аналогичной процессу in vivo , но с ускоренной кинетикой. PMCA концептуально аналогичен полимеразной цепной реакции - в обеих системах матрица растет за счет субстрата в циклической реакции, сочетающей рост и умножение единиц матрицы.
Репликация
PMCA применяли для репликации неправильно свернутого белка у разных видов. Вновь созданный белок проявляет те же биохимические, биологические и структурные свойства, что и PrP Sc, полученный из головного мозга, и поразительно заразен для животных дикого типа , вызывая заболевание, характеристики которого сходны с характеристиками болезни, вызываемой выделенными из головного мозга прионами.
Автоматизация
Технология была автоматизирована, что привело к резкому увеличению эффективности усиления. Теперь один цикл приводит к 2500-кратному увеличению чувствительности обнаружения по сравнению с вестерн-блоттингом, тогда как 2 и 7 последовательных циклов приводят к 6-миллионному и 3-миллиардному увеличению чувствительности обнаружения по сравнению с вестерн-блоттингом , методом, широко используемым при BSE. наблюдение в нескольких странах.
Чувствительность
Было показано, что PMCA способен обнаруживать всего лишь одну молекулу олигомерного инфекционного PrP Sc . PMCA обладает способностью генерировать миллионы инфекционных единиц, начиная с эквивалента одного олигомера PrP Sc ; значительно ниже порога заразности . Эти данные демонстрируют, что PMCA обладает такой же способностью к амплификации, что и методы ПЦР, используемые для амплификации ДНК. Это открывает большие перспективы для разработки высокочувствительного обнаружения PrP Sc и для понимания молекулярных основ репликации прионов. Действительно, PMCA использовался различными группами для PrP Sc в крови животных, экспериментально инфицированных прионами во время как симптоматической, так и предсимптоматической фаз, а также в моче.
Использует
Технология PMCA использовалась несколькими группами для понимания молекулярного механизма репликации прионов, природы инфекционного агента, феномена прионных штаммов и видового барьера, влияния клеточных компонентов, для обнаружения PrP Sc в тканях и биологических жидкостях и для скрининга ингибиторов репликации прионов. Недавние исследования, проведенные группами Supattapone и Ma, позволили вызвать репликацию прионов in vitro с помощью PMCA с использованием очищенного PrP C и рекомбинантного PrP C с единственным добавлением синтетических полианионов и липидов . Эти исследования показали, что инфекционные прионы могут образовываться в отсутствие каких-либо других клеточных компонентов, и представляют собой одно из самых убедительных доказательств в пользу гипотезы прионов.
Исследования 2020 года пришли к выводу, что циклическая амплификация неправильного сворачивания белков может использоваться для различения двух прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний, болезни Паркинсона и множественной системной атрофии , что является первым процессом, позволяющим поставить объективный диагноз множественной системной атрофии, а не просто дифференциальный диагноз.