ПЦР с горячим стартом - Hot start PCR
ПЦР с горячим стартом - это модифицированная форма обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая снижает присутствие нежелательных продуктов и димеров праймеров из-за неспецифической амплификации ДНК при комнатной (или более низкой) температуре. Поскольку результаты ПЦР настолько полезны, было разработано множество вариантов и модификаций процедуры для достижения более высоких выходов, ПЦР с горячим стартом является одной из них. ПЦР с горячим стартом следует тем же принципам, что и обычная ПЦР - в ней используется ДНК-полимераза для синтеза ДНК из одноцепочечной матрицы, однако используются дополнительные методы нагрева и разделения, такие как инактивация или ингибирование связывания полимеразы Taq и позднее добавление. полимеразы Taq, чтобы увеличить выход продукта, а также обеспечить более высокую специфичность и чувствительность. Неспецифическое связывание и праймирование или образование димеров праймеров сводятся к минимуму путем завершения реакционной смеси после денатурации . Некоторые способы завершения реакционных смесей при высоких температурах включают модификации, которые блокируют активность ДНК-полимеразы при низких температурах, использование модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) и физическое добавление одного из основных реагентов после денатурации. Результаты этой процедуры имеют множество применений как в медицине, так и в промышленности. Например, применение ПЦР, включая судебную экспертизу, тестирование отцовства, биологическую защиту, клонирование, обнаружение мутаций, генетическое тестирование и секвенирование ДНК.
Благодаря этим дополнительным методам ПЦР с горячим стартом может уменьшить количество неспецифических амплификаций, которые естественным образом возникают при более низких температурах, что остается проблемой для традиционной ПЦР. Эти модификации работают в целом, чтобы гарантировать, что определенные ферменты в растворе останутся неактивными или будут подавлены до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная температура отжига. Подавление образования неспецифических продуктов ПЦР, особенно на ранних циклах, приводит к значительному увеличению чувствительности обнаружения с помощью ПЦР. Это чрезвычайно важно для диагностических приложений ПЦР или ОТ-ПЦР.
Фон
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод молекулярной биологии , используемый для амплификации определенных сегментов ДНК на несколько порядков. Конкретные сегменты ДНК амплифицируются в ходе трех процессов: денатурации, отжига и удлинения - при этом цепи ДНК разделяются путем повышения температуры до оптимальной от комнатной до того, как праймеры свяжутся и полимераза выровняет нуклеотиды с цепью матрицы. В нем используется ДНК-полимераза , которая малоактивна при низких температурах. В обычной ПЦР реакционная смесь завершается при комнатной температуре, и из-за активности ДНК-полимеразы праймеры могут образовывать димеры праймеров или неспецифически отжигаться с ДНК. Во время процедуры ПЦР ДНК-полимераза будет расширять любой фрагмент ДНК связанными праймерами, генерируя целевые продукты, но также и неспецифические продукты, которые снижают выход. В ПЦР с горячим стартом некоторые реагенты хранятся отдельно до тех пор, пока смесь не нагреется до определенной температуры отжига. Это сокращает время отжига, что, в свою очередь, снижает вероятность неспецифического удлинения ДНК и влияние неспецифического связывания праймера до денатурации.
В традиционной ПЦР более низкие температуры ниже оптимальной температуры отжига (50-65 ° C) приводят к нецелевым модификациям, таким как неспецифические амплификации, при которых праймеры неспецифично связываются с нуклеиновой кислотой. Эти неспецифические комплексы праймеров, которые присутствуют в смеси в избытке, являются причиной синтеза побочных продуктов, таких как димер праймера и неправильное праймирование. Неправильное праймирование сильно затрудняет и снижает эффективность ПЦР-амплификации из-за активной конкуренции с целевыми последовательностями за амплификацию. Точно так же димеры праймеров образуют комплексы, которые уменьшают количество получаемых амплификаций числа копий. Это можно контролировать с помощью ПЦР с горячим стартом, которая позволяет блокировать удлинения праймера до достижения оптимальных температур.
В ПЦР с горячим стартом предотвращается взаимодействие важных реагентов (таких как ДНК-полимераза и кофакторы магния ) в смеси для ПЦР до достижения оптимальных температур посредством физического разделения или химических модификаций. ПЦР с горячим стартом может также происходить, когда полимераза Taq ингибируется / инактивирована или ее добавление откладывается до достижения оптимальных температур отжига, посредством модификаций дезоксирибонуклеотидтрифосфата или путем модификации праймеров посредством манипуляции с клетками и вторичной структурой .
ПЦР с горячим стартом часто является лучшим подходом по сравнению с традиционной ПЦР в обстоятельствах, когда в реакционной смеси отсутствует ДНК (> 10 4 копий), матрица ДНК очень сложна или если в ПЦР присутствует несколько пар олигонуклеотидных праймеров. .
Методы
ПЦР с горячим стартом - это метод, который предотвращает удлинение ДНК-полимеразы при более низкой температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и минимизировать потерю урожая. ПЦР с горячим стартом снижает количество неспецифического связывания за счет ограничивающих реагентов до стадий нагрева ПЦР - ограничивает реакцию на ранней стадии, ограничивая ДНК-полимеразу Taq в реакции. Неспецифическое связывание часто приводит к димерам праймеров и ошибочно примированным / ложно примированным мишеням. Их можно исправить с помощью модифицированных методов, таких как:
Инактивация / ингибирование ДНК-полимеразы Taq
Ферментно-связанные антитела / ДНК-полимераза Taq в комплексе с антителами к ДНК-полимеразе Taq:
Антитела, связанные с ферментом, инактивируют ДНК-полимеразу Taq. Антитела связываются и связываются с полимеразой, предотвращая раннюю амплификацию ДНК, которая может происходить при более низких температурах. Как только будет достигнута оптимальная температура отжига, антитела начнут разлагаться и диссоциировать, высвобождая ДНК-полимеразу Taq в реакцию и позволяя начать процесс амплификации. ДНК-полимераза Platinum Taq и ДНК-полимераза AccuStart Taq (обе разработаны Ayoub Rashtchian из Life technologies и Quanta BioSciences, соответственно) являются примерами коммерчески доступных ДНК-полимераз Taq на основе антител с горячим запуском. Эти ДНК-полимеразы Taq предварительно соединены со смесью моноклональных антител, специфичных к ДНК-полимеразе Taq.
Восковые бусины:
Физический барьер создается между ДНК-полимеразой Taq и остальными компонентами ПЦР с помощью шариков воска, которые зависят от температуры. Как только температура поднимается выше 70 ° C, во время стадии денатурации в первом цикле восковая гранула плавится, позволяя ДНК-полимеразе Taq выйти за барьер и высвободиться в реакцию - запуск процесса амплификации. Затем восковой слой перемещается к верхней части реакционной смеси во время стадии амплификации, чтобы позже действовать как пароизоляция.
Высокоспецифичные олигонуклеотиды:
Олигонуклеотиды - это короткие полимеры нуклеиновой кислоты, которые легко связываются. Высокоспецифичные олигонуклеотиды, такие как аптамеры, связываются с ДНК-полимеразой Taq при более низких температурах, что делает ее неактивной в смеси. Только при более высоких температурах олигонуклеотиды отделяются от Taq, позволяя ему реагировать.
Это наиболее эффективные методы для ПЦР с горячим стартом, методы с использованием ферментно-связанных антител и высокоспецифичных олигонуклеотидов, в частности, наиболее подходят во время процедур, требующих более короткого времени инактивации. Однако известны и другие методы, такие как:
Позднее добавление ДНК-полимеразы Taq
Предварительный нагрев:
Аппарат для ПЦР нагревается заранее, в то время как компоненты смешиваются на льду, а затем сразу же помещается в аппарат для ПЦР, когда он достигает оптимальной температуры. Это устранит необходимый процесс разогрева, уменьшит неспецифический отжиг праймеров и обеспечит разделение любых пропущенных пар праймеров в смеси.
Замораживание:
Замораживание действует как форма физического разделения, как и восковые шарики. Реакционную смесь, содержащую праймеры, матричную цепь, воду и дезоксирибонуклеотидтрифосфат (dNTP), замораживают перед полимеразой Taq, а остальные компоненты ПЦР добавляют поверх замороженной смеси. Это предотвращает неспецифическое связывание.
Позднее добавление Taq:
Компоненты ПЦР в реакционной смеси готовят и нагревают без добавления Taq. Taq вводится в смесь только после достижения оптимальной температуры. Однако этот метод наименее надежен и может привести к загрязнению компонентов.
Другой метод - это опосредованная дезоксирибонуклеотидтрифосфатом ПЦР с горячим стартом, которая модифицирует нуклеотидные основания через защитную группу.
Модификации дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP)
Горячий старт dNTP может быть химически модифицирован для включения термочувствительной защитной группы на 3 основных концах. Эта модификация предотвратит взаимодействие нуклеотидов с полимеразой Taq для связывания с цепью-матрицей до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры, поэтому защитная группа будет удалена во время стадии тепловой активации. Горячие dNTP, dA, dT, dC и dG заменяют природные нуклеотиды. Однако рекомендуется использовать все четыре модифицированных нуклеотида, предыдущие исследования показывают, что замены одного или двух природных нуклеотидов на модифицированные dNTP было бы достаточно для предотвращения неспецифической амплификации. Другая химическая модификация нуклеиновой кислоты - это термообратимая ковалентная модификация, которая препятствует гибридизации праймеров с интересующей матрицей. Аминогруппа гуанозина взаимодействует с глиоксалем с образованием dG.
Модифицированные праймеры
Вторичный состав:
Определенная вторичная структура может препятствовать работе праймеров. Например, олигонуклеотиды со структурой шпильки не могут эффективно действовать как праймер. Однако после нагревания реакционной смеси до температуры отжига праймер претерпит изменение конформации, позволяя праймеру вместо этого образовывать линейную структуру, что позволяет праймеру прикрепиться к целевому сегменту и начать ПЦР.
Фотохимически снимаемые клетки:
Клеточная группа, которая является фотохимически удаляемой защитной группой, такая как заключенные в каркас тимидинфосфорамидиты, включается в олигонуклеотидный праймер. Это позволяет активировать и деактивировать функцию праймера с помощью УФ-излучения (365 нм). Следовательно, праймеры можно активировать после достижения температуры отжига.
Контролируемое добавление магния
Магний необходим в ПЦР и действует как кофактор, поскольку полимераза Taq зависит от магния. Повышение концентрации магния и фосфата до стандартных буферных реагентов приводит к образованию осадка магния , обеспечивая горячий старт реакции, поскольку в ДНК-полимеразе нет магния до стадии термоциклирования. Во время термоциклирования магний снова растворяется в растворе и становится доступным для использования полимеразой, позволяя ей нормально функционировать.
Преимущества
Преимущество ПЦР с горячим стартом состоит в том, что она требует меньшего количества манипуляций и снижает риск контаминации. ПЦР с горячим стартом может быть химически модифицирована или основана на антителах, что обеспечивает различные преимущества данной процедуры. В химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процедура может проводиться при комнатной температуре и значительно снижает образование димеров праймеров, предотвращая связывание праймеров друг с другом до начала процесса ПЦР, а также ограничивая неспецифическое праймирование. Точно так же ПЦР с горячим стартом ингибирует связывание праймеров с матричными последовательностями, которые имеют низкую гомологию, что приводит к ошибочному запуску. Он также может улучшить специфичность и чувствительность из-за жестких условий, а также увеличить выход продукта целевого фрагмента. В ПЦР с горячим стартом на основе антител полимераза активируется после начальной стадии денатурации во время цикла, что сокращает необходимое время. Это также приводит к высокой специфичности .
Ограничения
Наряду со своими преимуществами, ПЦР с горячим стартом также имеет ограничения, которые необходимо учитывать перед реализацией метода. ПЦР с горячим стартом требует добавления тепла в течение более длительных периодов времени, чем обычная ПЦР, поэтому матричная ДНК более подвержена повреждению. Увеличенное время нагревания также означает, что процедура несовместима с некоторыми процедурами, такими как метод обратной транскрипции-ПЦР с одной пробиркой и одним буфером, который требует более низкой температуры для прохождения стадии обратной транскрипции. В химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процесс амплификации ДНК может отрицательно сказаться, во-первых, из-за значительного увеличения времени реактивации, необходимого для активации полимеразы, а во-вторых, если длина целевой ДНК-матрицы слишком велика. В процедурах на основе антител для каждого фермента требуются разные антитела, и поэтому стоимость выполнения процедуры выше.