Тонкослойная хроматография - Thin-layer chromatography

Тонкослойная хроматография
TLC черные чернила.jpg
Разделение черных чернил на пластине для ТСХ
Акроним TLC
Классификация Хроматография
Другие техники
Связанный
ТСХ трех стандартов (орто-, мета- и пара-изомеры) и образца
Флуоресцентная пластина для ТСХ в ультрафиолетовом (УФ) свете

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - это метод хроматографии , используемый для разделения нелетучих смесей. Тонкослойная хроматография выполняется на листе инертной подложки, такой как стекло, пластик или алюминиевая фольга, которая покрыта тонким слоем адсорбирующего материала, обычно силикагеля , оксида алюминия (оксида алюминия) или целлюлозы . Этот слой адсорбента известен как неподвижная фаза .

После того, как образец был нанесен на пластину, растворитель или смесь растворителей (известная как подвижная фаза ) втягивается в пластину за счет капиллярного действия . Поскольку разные аналиты поднимаются по пластине для ТСХ с разной скоростью, достигается разделение. Подвижная фаза имеет свойства, отличные от стационарной. Например, с силикагелем, очень полярным веществом, используются неполярные подвижные фазы, такие как гептан . Подвижная фаза может быть смесью, что позволяет химикам точно настраивать объемные свойства подвижной фазы.

После эксперимента пятна визуализируются. Часто это можно сделать, просто направив на лист ультрафиолетовый свет; листы часто обрабатываются люминофором , и на листе появляются темные пятна, где соединения поглощают свет, падающий на определенную область. Химические процессы также можно использовать для визуализации пятен; анизальдегид , например, образует цветные аддукты со многими соединениями, а серная кислота обугливает большинство органических соединений, оставляя темное пятно на листе.

Для количественной оценки результатов расстояние, пройденное рассматриваемым веществом, делится на общее расстояние, пройденное подвижной фазой, это соотношение называется коэффициентом замедления ( R f ) или, иногда, в просторечии - коэффициентом удерживания . Чтобы результат был количественным, абсорбция растворителя должна быть остановлена ​​до того, как подвижная фаза достигнет конца стационарной фазы. В общем, вещество, структура которого напоминает неподвижную фазу, будет иметь низкий R f , в то время как вещество, которое имеет структуру, аналогичную структуре подвижной фазы, будет иметь высокий коэффициент замедления. Факторы замедления являются характерными, но будут меняться в зависимости от точного состояния подвижной и стационарной фазы. По этой причине химики обычно наносят на лист образец известного соединения вместе с неизвестными образцами.

Тонкослойная хроматография может использоваться для отслеживания хода реакции, идентификации соединений, присутствующих в данной смеси, и определения чистоты вещества. Конкретные примеры этих приложений включают в себя: анализ керамиды и жирные кислоты , обнаружение пестицидов или инсектицидов в пище и воде, анализируя состав красителя волокон в судебно - медицинской экспертизы , опробование в радиохимической чистоты из радиофармпрепаратов , или идентификация лекарственных растений и их составных частей

В исходный метод можно внести ряд улучшений для автоматизации различных этапов, увеличения разрешения, достигаемого с помощью ТСХ, и обеспечения более точного количественного анализа. Этот метод называется ВЭТСХ или «высокопроизводительная ТСХ». В ВЭТСХ обычно используются более тонкие слои неподвижной фазы и меньшие объемы образцов, что снижает потерю разрешения из-за диффузии .

Подготовка тарелки

Пластины для ТСХ обычно коммерчески доступны со стандартными диапазонами размеров частиц для улучшения воспроизводимости . Их получают путем смешивания адсорбента, такого как силикагель , с небольшим количеством инертного связующего, такого как сульфат кальция (гипс) и воды. Эта смесь распределяется в виде густой суспензии на нереагирующем несущем листе, обычно стекле , толстой алюминиевой фольге или пластике. Полученную пластину сушат и активируют нагреванием в печи в течение тридцати минут при 110 ° C. Толщина абсорбирующего слоя обычно составляет около 0,1–0,25 мм для аналитических целей и около 0,5–2,0 мм для препаративной ТСХ.

Техника

Этот процесс аналогичен бумажной хроматографии с преимуществом более быстрых прогонов, лучшего разделения и выбора между различными стационарными фазами. Из-за своей простоты и скорости ТСХ часто используется для мониторинга химических реакций и для качественного анализа продуктов реакции. Планшеты могут быть помечены до или после процесса хроматографии с помощью карандаша или другого инструмента, который не будет мешать процессу и не реагировать на него.

Чтобы запустить пластину для тонкослойной хроматографии, проводят следующую процедуру:

  • С помощью капиллярной трубки небольшое пятно раствора, содержащего образец, наносится на пластину примерно в 1,5 см от нижнего края. Растворителя допускается , чтобы полностью испариться , чтобы предотвратить его от вмешательства взаимодействий образцов при подвижной фазы на следующей стадии. Если для нанесения образца использовался нелетучий растворитель, пластину необходимо высушить в вакуумной камере . Этот шаг часто повторяется, чтобы обеспечить достаточное количество аналита в начальной точке на планшете для получения видимого результата. Различные образцы могут быть помещены в ряд точек на одинаковом расстоянии от нижнего края, каждый из которых будет перемещаться по своей собственной смежной полосе от своей собственной начальной точки.
  • Небольшое количество подходящего растворителя (элюента) наливают в стеклянный стакан или любой другой подходящий прозрачный контейнер (разделительную камеру) на глубину менее 1 сантиметра. Полоска фильтровальной бумаги (она же «фитиль») помещается в камеру так, чтобы ее дно касалось растворителя, а бумага лежала на стенке камеры и доходила почти до верха контейнера. Емкость закрывают покровным стеклом или любой другой крышкой и оставляют на несколько минут, чтобы пары растворителя поднялись по фильтровальной бумаге и пропитали воздух в камере. (Отсутствие насыщения камеры приведет к плохому разделению и невоспроизводимым результатам.)
  • Затем пластину для ТСХ помещают в камеру так, чтобы пятно (я) образца не касалось поверхности элюента в камере, и крышка закрывается. В растворителе двигается вверх пластины по капиллярному действию , встречает смесь образца и переносит ее на пластине (элюируется образец). Планшет должен быть удален из камеры до того, как фронт растворителя достигнет верха неподвижной фазы (продолжение элюирования даст неверный результат) и высушен.
  • Незамедлительно отмечается фронт растворителя , самая дальняя часть растворителя вверх по пластине.
  • Табличка визуализирована. Поскольку некоторые пластины предварительно покрыты люминофором, таким как сульфид цинка , что позволяет визуализировать многие соединения с помощью ультрафиолетового света ; Темные пятна появляются там, где составы блокируют попадание ультрафиолетового света на пластину. В качестве альтернативы планшеты можно распылять или погружать в химикаты после элюирования. Различные визуализирующие агенты реагируют с пятнами, давая видимые результаты.

Процесс и принцип разделения

Различные соединения в смеси образцов перемещаются с разной скоростью из-за различий в их притяжении к неподвижной фазе и из-за различий в растворимости в растворителе. Изменяя растворитель или, возможно, используя смесь, можно регулировать разделение компонентов (измеряемое значением R f ). Кроме того, разделение, достигаемое с помощью пластинки для ТСХ, можно использовать для оценки разделения на колонке для флэш-хроматографии . (Соединение элюируется из колонки, когда количество собранного растворителя равно 1 / R f .) Химики часто используют ТСХ для разработки протокола разделения с помощью хроматографии и используют ТСХ для определения, какие фракции содержат желаемые соединения.

Разработка пластинки для ТСХ. Пурпурное пятно разделяется на красное и синее пятно.

Разделение соединений основано на конкуренции растворенного вещества и подвижной фазы за сайты связывания на неподвижной фазе. Например, если в качестве стационарной фазы используется силикагель с нормальной фазой, его можно считать полярным. Учитывая два соединения, которые различаются по полярности, более полярное соединение имеет более сильное взаимодействие с диоксидом кремния и, следовательно, лучше способно вытеснять подвижную фазу из доступных сайтов связывания. Как следствие, менее полярное соединение перемещается вверх по пластине (что приводит к более высокому значению R f ). Если подвижная фаза заменяется более полярным растворителем или смесью растворителей, она лучше связывается с полярной пластиной и, следовательно, вытесняет из нее растворенные вещества, поэтому все соединения на пластине для ТСХ будут перемещаться выше по пластине. Обычно говорят, что «сильные» растворители (элюенты) подталкивают анализируемые соединения вверх по пластине, тогда как «слабые» элюенты их почти не перемещают. Порядок прочности / слабости зависит от покрытия (неподвижная фаза) пластины ТСХ. Для пластин для ТСХ, покрытых силикагелем, сила элюента увеличивается в следующем порядке: перфторалкан (самый слабый), гексан , пентан , четыреххлористый углерод , бензол / толуол , дихлорметан , диэтиловый эфир , этилацетат , ацетонитрил , ацетон , 2-пропанол / н. -бутанол , вода , метанол , триэтиламин , уксусная кислота , муравьиная кислота (сильнейшая). Для пластин с покрытием C18 порядок обратный. Другими словами, когда стационарная фаза полярна, а подвижная фаза неполярна, метод является нормально-фазовым, а не обращенно-фазовым . Это означает, что если в качестве подвижной фазы используется смесь этилацетата и гексана, добавление большего количества этилацетата приводит к более высоким значениям R f для всех соединений на пластине для ТСХ. Изменение полярности подвижной фазы обычно не приводит к обратному порядку прохождения соединений на пластине для ТСХ. Элюотропные серии могут быть использованы в качестве руководства при выборе подвижной фазы. Если желателен обратный порядок прохождения соединений, следует использовать неполярную неподвижную фазу, такую ​​как диоксид кремния, функционализированный C18.

Анализ

Поскольку разделяемые химические вещества могут быть бесцветными, существует несколько методов визуализации пятен:

  • Флуоресцентные аналиты, такие как хинин , могут быть обнаружены при черном свете (366 нм).
  • Часто к адсорбенту добавляют небольшое количество флуоресцентного соединения, обычно активированного марганцем силиката цинка , что позволяет визуализировать пятна в свете УФ-С (254 нм). Таким образом, слой адсорбента сам по себе будет флуоресцировать светло-зеленым, но пятна анализируемого вещества гасят эту флуоресценцию.
  • Пары йода - это универсальный неспецифический цветной реагент.
  • Существуют специальные цветные реагенты, в которые погружают пластину для ТСХ или которые распыляются на нее.

После того, как он стал видимым, значение R f или коэффициент замедления каждого пятна можно определить путем деления расстояния, пройденного продуктом, на расстояние, пройденное фронтом растворителя, используя исходное место пятна в качестве эталона. Эти значения зависят от используемого растворителя и типа пластинки для ТСХ и не являются физическими константами.

Приложения

Характеристика

В органической химии за реакциями качественно следят с помощью ТСХ. На пластину помещают пятна, отобранные с помощью капиллярной трубки: пятно исходного материала, пятно из реакционной смеси и перекрестное пятно с обоими. Для работы небольшой (3 на 7 см) пластинки для ТСХ требуется пара минут. Анализ является качественным, и он покажет, исчез ли исходный материал, то есть реакция завершена, появился ли какой-либо продукт и сколько продуктов образуется (хотя это может быть недооценено из-за совместного элюирования). К сожалению, ТСХ низкотемпературных реакций может дать вводящие в заблуждение результаты, потому что образец нагревается до комнатной температуры в капилляре, что может изменить реакцию - нагретый образец, проанализированный с помощью ТСХ, отличается от того, что находится в низкотемпературной колбе. . Одной из таких реакций является восстановление сложного эфира DIBALH до альдегида.

В одном исследовании ТСХ применялась для скрининга органических реакций , например, для точной настройки синтеза BINAP из 2-нафтола . В этом методе спирт и раствор катализатора (например, хлорид железа (III) ) помещаются отдельно на базовый уровень, затем вступают в реакцию и затем немедленно анализируются.

Специальное применение ТСХ - характеристика радиоактивно меченных соединений, где она используется для определения радиохимической чистоты . Лист ТСХ визуализируется с помощью листа фотопленки или прибора, способного измерять радиоактивность . Это можно визуализировать и другими способами. Этот метод намного более чувствителен, чем другие, и может использоваться для обнаружения очень небольшого количества соединения при условии, что оно несет радиоактивный атом.

Изоляция

Поскольку разные соединения проходят различное расстояние в стационарной фазе, хроматографию можно использовать для выделения компонентов смеси для дальнейшего анализа. Отделенные соединения, каждое из которых занимает определенную область на пластине, их можно соскребать (вместе с частицами неподвижной фазы) и растворять в подходящем растворителе. Например, в хроматографии экстракта зеленого растительного материала (например, шпината ), показанной на 7 стадиях развития, каротин элюируется быстро и виден только до стадии 2. Хлорофиллы A и B находятся на полпути к завершающей стадии, а лютеин - на стадии. первое соединение окрашивает в желтый цвет. По окончании хроматографии каротин можно удалить с планшета, экстрагировать в растворитель и поместить в спектрофотометр для определения его спектра. Экстрагируемые количества небольшие, и для разделения больших количеств предпочтительна такая методика, как колоночная хроматография. Однако большие препаративные пластинки для ТСХ с толстым покрытием из силикагеля можно использовать для разделения более 100 мг материала.

Изучение реакций и стабильности соединения

ТСХ также используется для идентификации завершения любой химической реакции. Чтобы определить это, наблюдают, что в начале реакции все пятно занято исходными химическими веществами или материалами на пластине. Когда начинается реакция, пятно, образованное исходными химическими веществами, начинает уменьшаться и в конечном итоге заменяет все пятно исходных химикатов новым продуктом, присутствующим на пластине. Образование совершенно нового пятна определяет завершение реакции.

Кроме того, двумерная ТСХ часто используется как метод проверки стабильности соединения в неподвижной фазе (такой как силикагель, который обычно является слабокислым). Для этого смесь тестируемых соединений дважды элюируют на пластине для ТСХ квадратной формы, сначала в одном направлении, а затем повернутой на 90 °. Если целевое соединение появляется на диагонали квадрата, оно стабильно в силикагеле и безопасно для очистки. Если он появляется ниже диагонали, значит, он разлагается на силикагеле. В этом случае очистку можно попытаться провести с использованием нейтрализованного силикагеля (например, с триэтиламином ) или альтернативной стационарной фазы, такой как нейтральный оксид алюминия .

Смотрите также

Рекомендации

Библиография

  • F. Geiss (1987): Основы тонкослойной хроматографии планарной хроматографии, Heidelberg, Hüthig, ISBN  3-7785-0854-7
  • Юстус Г. Кирхнер (1978): Тонкослойная хроматография, 2-е издание, Wiley
  • Джозеф Шерма, Бернард Фрид (1991): Справочник по тонкослойной хроматографии (= Chromatographic Science. Bd. 55). Марсель Деккер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, ISBN  0-8247-8335-2 .
  • Эльке Хан-Дейнсторп: Прикладная тонкослойная хроматография. Лучшие практики и избежание ошибок. Wiley-VCH, Weinheim ua 2000, ISBN  3-527-29839-8