Копирование катящегося круга - Rolling circle replication

Репликация по вращающемуся кругу создает несколько копий одного круглого шаблона.

Подвижной круг репликации ( RCR ) представляет собой процесс однонаправленного нуклеиновой кислоты репликации , которые могут быстро синтезировать несколько копий кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , в геномы из бактериофагов , и круговой РНК генома вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК по механизму катящегося круга.

В качестве упрощенной версии естественной репликации по катящемуся кругу был разработан метод изотермической амплификации ДНК, амплификация по катящемуся кругу. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинской нанотехнологии , особенно в области биосенсинга (как метод усиления сигнала).

Циркулярная репликация ДНК

Иллюстрация репликации катящегося круга.

Репликация ДНК по катящемуся кругу инициируется белком-инициатором, кодируемым плазмидной или ДНК бактериофага, который разрывает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом двухцепочечным ориджином, или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается, чтобы служить праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III . Используя неотмеченную цепь в качестве матрицы, репликация происходит вокруг кольцевой молекулы ДНК, вытесняя разорванную цепь как одноцепочечную ДНК. Смещение разорванной цепи осуществляется кодируемой хозяином геликазой, называемой PcrA (аббревиатура, обозначающая уменьшенную копию плазмиды) в присутствии белка инициации репликации плазмиды.

Непрерывный синтез ДНК может производить несколько одноцепочечных линейных копий исходной ДНК в непрерывной последовательности, называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы с помощью следующего процесса:

Во-первых, белок-инициатор делает еще один разрыв в ДНК, чтобы остановить синтез первой (ведущей) цепи. Затем РНК-полимераза и ДНК-полимераза III реплицируют одноцепочечную исходную ДНК (SSO), чтобы образовать еще один двухцепочечный круг. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, образуя еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.

Таким образом, типичная репликация катящегося круга ДНК состоит из пяти этапов:

  1. Круговая дцДНК будет «разорвана».
  2. 3' - конец удлиняется с помощью „unnicked“ ДНК в качестве ведущей цепи (шаблон); 5 'конец смещен.
  3. Вытесненная ДНК представляет собой отстающую цепь и становится двухцепочечной через ряд фрагментов Окадзаки .
  4. Репликация как «незарегистрированной», так и смещенной оцДНК.
  5. Смещенная ДНК циркулирует.

Вирусология

Репликация вирусной ДНК

Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по катящемуся кругу. Например, человеческий герпесвирус-6 (HHV-6) (hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как считается, вовлечены в этот процесс. Образующиеся длинные конкатемеры впоследствии расщепляются между участками pac-1 и pac-2 генома HHV-6 рибозимами, когда они упаковываются в отдельные вирионы.

Модель для репликации катящегося круга HPV16.

Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) - еще один вирус, который использует скользящую репликацию для получения потомства с высокой скоростью. ВПЧ-16 инфицирует эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации в ориджине гексамер E1 оборачивается вокруг однонитевой ДНК и перемещается в направлении от 3 'до 5'. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка диссоциируют во время столкновения, но в HPV-16 считается, что гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной катящейся репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологические последствия для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного развития рака шейки матки.

Кроме того, геминивирус также использует репликацию по скользящему кругу в качестве механизма репликации. Это вирус, ответственный за уничтожение многих основных сельскохозяйственных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и окра. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется геминивирусным белком-инициатором репликации, Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, чтобы действовать как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков инициатора репликации эубактерий, с присутствием мотивов I, II и III на N-конце. Во время репликации по методу катящегося круга оцДНК геминивируса преобразуется в дцДНК, и Rep затем присоединяется к дцДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После того, как Rep, вместе с другими белками репликации, связывается с дцДНК, он образует петлю ствола, где ДНК затем расщепляется по наномерной последовательности, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке продвигаться в направлении от 3 'до 5', что в конечном итоге дает новую цепь оцДНК и конкатамерную цепь ДНК.

Промежуточные продукты репликации ДНК бактериофага Т4 включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации катящегося круга.

Репликация вирусной РНК

Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по «катящемуся кругу». Для вироидов существует два альтернативных пути репликации РНК, за которыми, соответственно, следуют члены семейства Pospivirodae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация).

Репликация по катящемуся кругу вирусной РНК

В семействе Pospiviroidae (PSTVd-like) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется РНК-полимеразой хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются хозяйской РНКазой и лигируются хозяйской РНК-лигазой для преобразования мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по катящемуся кругу. Вироиды семейства Avsunviroidae (ASBVd-подобные) реплицируют свой геном посредством симметричного пути репликации по катящемуся кругу. В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются с образованием мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи затем отщепляются и лигируются для преобразования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации был назван потому, что как положительные, так и отрицательные цепи образуются одинаково.

Расщепление олигомерных плюс и минус цепей опосредуется саморасщепляющейся структурой рибозима в виде головки молотка, присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae.

Усиление катящегося круга

Молекулярный механизм усиления катящегося круга (RCA)

Производная форма репликации по катящемуся кругу успешно использовалась для амплификации ДНК из очень небольших количеств исходного материала. Этот метод усиления называется усилением по скользящему кругу (RCA). В отличие от традиционных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA - это метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному к кольцевой матрице, что приводит к длинной конкатемерной оцДНК, содержащей от десятков до сотен тандемных повторов (дополняющих круговой шаблон).

Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:

  1. ДНК-полимераза
  2. Подходящий буфер, совместимый с полимеразой.
  3. Короткий праймер ДНК или РНК
  4. Круглый шаблон ДНК
  5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ)
Методы обнаружения продукта RCA

Полимеразы, используемые в RCA, представляют собой экзо- ДНК-полимеразу Phi29 , Bst и Vent для амплификации ДНК и РНК-полимеразу T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 имеет лучшую процессивность и способность замещения цепей среди всех вышеупомянутых полимераз, она наиболее часто использовалась в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65 ° C) как в свободном растворе, так и на иммобилизованных мишенях (твердофазная амплификация).

Обычно реакция RCA ДНК включает три этапа:

  1. Циркулярное лигирование матрицы, которое может проводиться посредством ферментативного лигирования, опосредованного матрицей (например, ДНК-лигаза Т4), или лигирования без матрицы с использованием специальных ДНК-лигаз (например, CircLigase).
  2. Праймер- индуцированное удлинение одноцепочечной ДНК. Для гибридизации с одним и тем же кругом можно использовать несколько праймеров. В результате может быть инициировано несколько событий амплификации, в результате чего будет получено несколько продуктов RCA («Multiprimed RCA»).
  3. Обнаружение и визуализация продуктов амплификации, которые чаще всего проводят с помощью флуоресцентного обнаружения, с помощью флуорофор-конъюгированных dNTP, связанных с флуорофором комплементарных или флуоресцентно меченных молекулярных маяков . Помимо флуоресцентных подходов, гель-электрофорез также широко используется для обнаружения продукта RCA.

RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая кольцевая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного времени. Для увеличения выхода и достижения экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является амплификация с гиперразветвленным катящимся кругом, или HRCA, когда добавляются и удлиняются праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA. Таким образом, исходный RCA создает больше шаблонов, которые можно усилить. Другой - круговая амплификация или C2CA, где продукты RCA перевариваются рестрикционным ферментом и лигируются в новые кольцевые матрицы с использованием рестрикционного олигонуклеотида, за которым следует новый цикл RCA с большим количеством кольцевых матриц для амплификации.

Приложения RCA

иллюстрация иммуно-RCA

RCA может усилить единичное событие молекулярного связывания более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения мишеней со сверхнизким содержанием. Реакции RCA могут проводиться не только в среде свободного раствора, но и на твердой поверхности, такой как стекло, микрошарики или наночастицы, микропланшеты, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится универсальным инструментом для усиления сигнала с широким спектром приложений в геномике, протеомике, диагностике и биодатчиках.

Иммуно-RCA

Иммуно-RCA - это метод изотермического усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод объединяет два поля: RCA, который позволяет амплификацию нуклеотидов, и иммуноанализ, в котором используются антитела, специфичные к внутриклеточным или свободным биомаркерам. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое отношение сигнал / шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественной оценки и визуализации белковых маркеров с низким содержанием в жидкофазных иммуноанализах и иммуногистохимии .

Иммуно-RCA следует типичной реакции иммуно-адсорбента в ELISA или иммуногистохимическом окрашивании тканей. Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида оцДНК к концу тяжелых цепей. Таким образом, участок Fab (фрагмент, связывание антигена) на детектирующем антителе все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером для реакции RCA.

Типичная процедура иммуно-RCA, опосредованная антителами, выглядит следующим образом:

Иллюстрация иммуно-rca на основе аптамера

1. Детектирующее антитело распознает конкретную белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.

2. Когда присутствует кольцевая ДНК, она отжигается, и праймер совпадает с комплементарной последовательностью кольцевой ДНК.

3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.

4. Выход RCA (удлиненная оцДНК) обнаруживается флуоресцентными зондами с использованием флуоресцентного микроскопа или считывающего устройства для микропланшетов.

Иммуно-RCA на основе аптамеров

В дополнение к опосредованной антителами иммуно-RCA праймер оцДНК RCA также может быть конъюгирован с 3'-концом ДНК-аптамера. Хвост праймера можно амплифицировать с помощью амплификации по катящемуся кругу. Продукт можно визуализировать посредством маркировки флуоресцентного репортера. Процесс показан на рисунке справа.

Другие приложения RCA

Различные производные RCA широко использовались в области биосенсинга. Например, RCA успешно использовался для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК из клинических образцов, что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа микрочипов нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) .

В дополнение к функции амплификации в приложениях биочувствительности, метод RCA может быть применен также для создания наноструктур ДНК и гидрогелей ДНК . Продукты RCA также можно использовать в качестве темплатов для периодической сборки наноразмеров или белков, синтеза металлических нанопроволок и образования наноостровков .

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки