Респирометрия - Respirometry

Респирометрии представляют собой общий термин , который включает в себя ряд методов для получения оценок скоростей метаболизма из позвоночных , беспозвоночных животных , растений , тканей, клеток или микроорганизмов с помощью косвенного измерения производства тепла ( калориметрия ).

Скорость метаболизма всего животного

Метаболизм животного оценивается путем определения скорости производства углекислого газа (VCO ₂ ) и потребления кислорода (VO ₂ ) отдельными животными в закрытой или открытой системе респирометрии. Обычно получают два показателя: стандартную (SMR) или базальную скорость метаболизма (BMR) и максимальную скорость ( VO2max ). SMR измеряется, когда животное находится в состоянии покоя (но не во сне) в конкретной лаборатории (температура, гидратация) и условиях, зависящих от субъекта (например, размер или аллометрия ), возраста, репродуктивного статуса, постабсорбции, чтобы избежать термического эффекта пищи ) . VO ₂ max обычно определяется во время аэробных упражнений на физиологических пределах или около них. Напротив, полевой уровень метаболизма (FMR) относится к скорости метаболизма необузданного, активного животного в природе. К этим показателям относятся показатели метаболизма всего животного без поправки на массу тела. Если значения SMR или BMR делятся на значение массы тела животного, то показатель называется массовым. Именно это массовое значение обычно можно услышать при сравнении видов.

Закрытая респирометрия

Респирометрия зависит от принципа «что входит, должно выходить». Сначала рассмотрим закрытую систему. Представьте, что мы помещаем мышь в герметичный контейнер. Воздух, запечатанный в контейнере, изначально содержит тот же состав и пропорции газов, которые присутствовали в комнате: 20,95% O ₂ , 0,04% CO ₂ , водяной пар (точное количество зависит от температуры воздуха, см. Точку росы ), 78%. (приблизительно) N ₂ , 0,93% аргона и различные газовые примеси, составляющие остальную часть (см . атмосферу Земли ). Со временем мышь в камере производит CO ₂ и водяной пар, но извлекает O ₂ из воздуха пропорционально своим метаболическим потребностям. Следовательно, пока мы знаем объем системы, разница между концентрациями O ₂ и CO ₂ в начале, когда мы запечатали мышь в камере (базовые или эталонные условия), по сравнению с количествами, присутствующими после мыши вдохнул воздух в более позднее время, должно быть количество CO ₂ / O _2, произведенное / потребленное мышью . Азот и аргон - инертные газы, поэтому их фракционные количества не меняются при дыхании мыши. В закрытой системе окружающая среда со временем станет гипоксичной .

Открытая респирометрия

Для открытой системы конструктивные ограничения включают характеристики вымывания камеры для животных и чувствительность газоанализаторов. Однако основной принцип остается прежним: то, что входит, должно выходить наружу. Основное различие между открытой и закрытой системами заключается в том, что открытая система пропускает воздух через камеру (т. Е. Воздух выталкивается или вытягивается насосом) со скоростью, которая постоянно пополняет O _2, истощенный животным, одновременно удаляя CO ₂ и воду. пар, производимый животным. Объемная скорость потока должна быть достаточно высоким , чтобы гарантировать , что животное никогда не потребляет весь кислород , присутствующий в камере , в ту же время, скорость должна быть достаточно низкой , так что животное потребляет достаточно O ₂ для обнаружения. Для мышей весом 20 г скорость потока около 200 мл / мин через контейнеры емкостью 500 мл обеспечит хороший баланс. При такой скорости потока в камеру подается около 40 мл O _2, и весь объем воздуха в камере заменяется в течение 5 минут. Для других более мелких животных объем камеры может быть намного меньше, а скорость потока также должна быть уменьшена. Обратите внимание, что для теплокровных или эндотермических животных ( птиц и млекопитающих ) размеры камеры и / или скорости потока должны выбираться с учетом их более высокой скорости метаболизма.

Расчеты

Для расчета скорости VO ₂ и / или VCO ₂ необходимо знать скорость потока в камеру и из нее, а также фракционные концентрации газовых смесей в камере для животных и из нее. Как правило, скорость метаболизма рассчитывается из стационарных условий (т. Е. Скорость метаболизма животного считается постоянной). Чтобы узнать скорость потребляемого кислорода , необходимо знать расположение расходомера относительно камеры для животных (если он расположен перед камерой, расходомер находится «вверх по потоку», если он расположен после камеры, расходомер находится «ниже по потоку». "), и присутствуют ли химически активные газы (например, CO ₂ , вода , метан , см. инертный газ ).

Для открытой системы с вышестоящим расходомером вода (например, безводный сульфат кальция ) и CO ₂ (например, адсорбент диоксида углерода, такой как Ascarite II, зарегистрированная торговая марка Arthur H. Thomas Co.) удаляются перед анализатором кислорода , a подходящее уравнение

{\ Displaystyle {\ ce {VO2 = {\ frac {{\ mathit {FR}} \ cdot ({\ mathit {F}} _ {in} O2 - {\ mathit {F}} _ {ex} O2)} {1 - {\ mathit {F}} _ {ex} O2}}}}}

Для открытой системы с нижним расходомером, водой и CO _2, удаленными перед анализатором кислорода , подходящее уравнение выглядит следующим образом:

{\ Displaystyle {\ ce {VO2 = {\ frac {{\ mathit {FR}} \ cdot ({\ mathit {F}} _ {in} O2 - {\ mathit {F}} _ {ex} O2)} {1 - {\ mathit {F}} _ {in} O2}}}}}

где

FR - это объемный расход, приведенный к STP (см. Стандартные условия для температуры и давления )
F _в O ₂ - это фракционное количество кислорода, присутствующего в текущем воздушном потоке (базовом или эталонном), и
Р _ех O ₂ является дробное количество кислорода , присутствующего в экс текущего потока воздуха (то , что животное потребляемую по отношению к базовой линии в единицу времени).

Например, значения BMR для мыши весом 20 г ( Mus musculus ) могут быть FR = 200 мл / мин, а показания фракционной концентрации O ₂ с анализатора кислорода равны F _in O ₂ = 0,2095, F _ex O ₂ = 0,2072. . Расчетная скорость потребления кислорода составляет 0,58 мл / мин или 35 мл / час. Предполагая, что энтальпия сгорания для O ₂ составляет 20,1 джоулей на миллилитр, мы затем рассчитали бы производство тепла (и, следовательно, метаболизм) для мыши как 703,5 Дж / ч.

Оборудование для респирометрии

Для системы с открытым потоком список оборудования и частей длинен по сравнению с компонентами закрытой системы, но главное преимущество открытой системы состоит в том, что она позволяет непрерывно регистрировать скорость метаболизма. Риск гипоксии также намного меньше в открытой системе.

Насосы для воздушного потока

Вакуумный насос : насос необходим для проталкивания (то есть выше по потоку) или втягивания (то есть ниже по потоку) воздуха в камеру для животных и проточную систему респирометрии и через нее.
Насос для подвыборки: для прокачки воздуха через анализаторы используется небольшой, стабильный и надежный насос.

Расходомер и контроллеры расхода

Пузырьковые расходомеры: простой, но очень точный способ измерения расхода включает синхронизацию движения пузырьков мыльной пленки вверх по стеклянным трубкам между отметками известного объема. Стеклянная трубка подсоединяется снизу (для выталкивающих систем) или вверху (для вытяжных систем) к воздушному потоку. Маленькая резиновая груша для пипетки, прикрепленная к основанию пробирки, действует как резервуар и как система доставки мыльных пузырей. Операция проста. Во-первых, намочите поверхность стекла по пути, по которому движутся пузырьки (например, нажмите на колбу так, чтобы обильное количество мыла вытолкнуло вверх по стеклу потоком воздуха), чтобы получить поверхность практически без трения. Во-вторых, зажать лампочку так, чтобы образовался один чистый пузырек. С секундомером в руке запишите время, необходимое пузырю, чтобы пройти между отметками на стекле. Обратите внимание на объем, записанный на верхней отметке (например, 125 = 125 мл), разделите объем на время, необходимое для прохождения между отметками, и результатом будет скорость потока (мл / с). Эти инструменты можно приобрести в различных магазинах, но они также могут быть изготовлены из стеклянных мерных пипеток подходящего размера .
Акриловые расходомеры: в некоторых случаях при высоких расходах мы можем использовать простые акриловые расходомеры (0–2,5 л / мин) для контроля расхода через метаболические камеры. Счетчики расположены выше по потоку от камер обмена веществ. Расходомеры просты в использовании, но их следует калибровать дважды в день для использования в системе респирометрии: один раз перед началом записи (но после того, как животное было запечатано внутри камеры !!) и еще раз в конце записи (перед животным снимается из камеры). Калибровка должна выполняться с помощью пузырькового расходомера, поскольку калибровочные отметки на акриловых расходомерах являются приблизительными. Для правильной калибровки расхода помните, что необходимо регистрировать как барометрическое давление, так и температуру воздуха, проходящего через расходомер (который мы считаем равным комнатной температуре).
Массовые расходомеры : уравнения, необходимые для расчета скорости потребления кислорода или производства углекислого газа, предполагают, что скорости потока в камеры и из них точно известны. Мы используем массовые расходомеры, преимущество которых заключается в том, что значения расхода не зависят от температуры и давления воздуха. Следовательно, эти скорости потока можно считать приведенными к стандартным условиям (стандартная температура и давление). Мы измеряем и контролируем поток только в одном месте - ниже по потоку от камеры. Следовательно, мы должны предположить, что скорости притока и оттока идентичны. Однако во время создания системы респирометрии необходимо измерять скорость потока на всех этапах, через все соединения, чтобы проверить целостность потока.
Игольчатые клапаны : массовые расходомеры можно приобрести с контроллерами массового расхода, которые позволяют устанавливать расход. Однако это дорого. При проведении респирометрических исследований часто предпринимаются попытки измерить одновременно более одного животного, что потребует одной камеры на животное и, таким образом, контролируемого потока через каждую камеру. Альтернативным и более экономичным методом управления потоком может быть использование игольчатых клапанов из нержавеющей или углеродистой стали. Игольчатые клапаны и массовые расходомеры обеспечивают рентабельное средство для достижения желаемого расхода. Клапаны стоят около 20 долларов.

Трубки и камеры

Трубки и соединения: Для подключения компонентов респирометрической системы к камере для животных и от нее могут использоваться различные типы трубок. В зависимости от характеристик системы могут использоваться различные типы гибких трубок. Ацетил, Bev-A-Line, Kynar, нейлон, трубки и соединители Tygon могут использоваться в областях системы, где окислительная атмосфера низка (например, только фоновые уровни озона); Если ожидается присутствие значительного количества озона, рекомендуется использовать тефлоновые трубки, поскольку он инертен по отношению к озону. Тефлоновые трубки более дорогие и недостаточно гибкие.
Камеры обмена веществ: Камеры могут быть стеклянными банками с резиновыми пробками для крышек; цилиндры для шприцев для мелких животных и насекомых; или построены из оргстекла . В идеале камеры должны быть построены из инертных материалов; например, акриловые пластмассы могут поглощать O ₂ и могут быть плохим выбором для респирометрии с очень маленькими насекомыми. Камеры должны быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечивать быстрое перемешивание газов внутри камеры. Простейшей метаболической камерой для маленького позвоночного может быть стеклянная банка с пробкой. Заглушки оснащены двумя портами: короткие удлинители тефлоновой трубки предназначены для линейных соединений. Удлинители тефлоновой трубки проталкиваются через перегородку, и соединение линии завершается прикреплением небольшого шлангового зажима к основанию удлинителя тефлоновой трубки. Кроме того, необходимо предусмотреть удлинение впускного отверстия внутри емкости - это гарантирует, что газы выдыхаемого животного не вымываются входящим потоком. Животное запечатано внутри, а резиновая пробка удерживается на месте ремнями на липучке . Если используется система, расположенная выше по потоку, любая утечка в метаболической камере приведет к потере воздуха животным и, следовательно, к заниженной оценке скорости метаболизма животного. Когда вы закрываете животное внутри метаболической камеры, следует обращать внимание на уплотнение. Чтобы обеспечить плотное прилегание, прежде чем закрывать крышку, плотно вставьте пробку в банку и убедитесь, что она ровная. Используйте 1-2 ремня (лучше 2) и плотно затяните. Камеры из акрила (оргстекла) будут построены для некоторых целей, но для обеспечения надлежащей посадки потребуются точные инженерные решения; прокладки помогут, а разумное использование плотно прилегающих хомутов сведет к минимуму утечки.
Трубки для чистки: воду до и после камеры для животных необходимо удалить. В одной из схем может использоваться большая акриловая колонка дриерита (8 меш (шкала) , т. Е. Относительно крупная) перед насосом (перед толкающим насосом, перед камерой для животных) для сушки набегающего воздушного потока и несколько трубок с меньшим размером ячеек (10–20, т. Е. , относительно мелкий) Дриерит для удаления воды после камеры для животных. Чтобы подготовить чистящую трубку, убедитесь, что на каждом конце трубки есть небольшое количество хлопка, чтобы частицы пыли не попадали в анализаторы. Используйте небольшое количество хлопка, скажем, около 0,005 г, ровно столько, чтобы пыль не попала в трубку. Большое количество хлопка блокирует поток воздуха, когда / если он намокнет. Вылейте дриерит в пробирку с помощью воронки, постучите по пробирке о стол, чтобы плотно упаковать зерна (для увеличения площади поверхности - воздух + вода проходит через рыхлый дриерит, что требует частой смены скрубберов) и закройте крышкой небольшим количеством воды. хлопок. Для удаления углекислого газа] до и после камеры для животных используется Ascarite II (Ascarite II является зарегистрированным товарным знаком Arthur H. Thomas Co.). Аскарит II содержит NaOH, который является едким веществом (поэтому не допускайте попадания его на кожу и держите подальше от воды). Трубку для чистки готовят, помещая небольшое количество ваты в конец трубки, заполняя одну треть пути дриеритом 10–20 меш, добавляя небольшое количество ваты, а затем дополнительную треть трубки Аскаритом II, еще один слой хлопка, затем еще дриерита и закрытие трубки еще одним небольшим количеством хлопка. Постучите по трубке на скамейке по мере добавления каждого слоя, чтобы упаковать зерна. Примечание: дриерит можно использовать снова и снова (после нагревания в духовке), хотя это указывает на то, что дриерит потеряет цвет при повторной сушке; Аскарит II используется один раз и считается опасным отходом .

Анализаторы

Анализатор углекислого газа : в анализаторах CO ₂ обычно используются методы обнаружения на основе инфракрасного излучения, чтобы воспользоваться преимуществом того факта, что CO ₂ поглощает инфракрасный свет и повторно излучает свет на несколько более длинных волнах. Панельный измеритель на анализаторе отображает весь диапазон 0,01–10% CO _2, и для регистрации данных также генерируется выходное напряжение, пропорциональное концентрации CO ₂ .
Анализатор кислорода. В анализаторах кислорода, подходящих для респирометрии, используются различные датчики кислорода , включая гальванические («температура окружающей среды»), парамагнитные , полярографические ( электроды типа Кларка ) и циркониевые («высокотемпературные») датчики. В гальванических анализаторах O ₂ используется топливный элемент, содержащий кислотный электролит , анод из тяжелого металла и тонкую газопроницаемую мембрану. Поскольку парциальное давление O ₂ около анода равно нулю, O ₂ направляется диффузией к аноду через мембрану со скоростью, пропорциональной парциальному давлению O ₂ окружающей среды . Топливный элемент вырабатывает напряжение, линейно пропорциональное парциальному давлению O ₂ на мембране. Пока температура шкафа стабильна и поток воздуха через топливный элемент стабилен и находится в пределах допустимого диапазона, отклик будет 0,01% или лучше, в зависимости от вспомогательной электроники, программного обеспечения и других соображений.

Наконец, типичным дополнением к системе будет компьютерная система сбора данных и управления. Вместо самописца ведутся непрерывные записи потребления кислорода и / или образования углекислого газа с помощью аналого-цифрового преобразователя, подключенного к компьютеру. Программное обеспечение улавливает, фильтрует, преобразует и отображает сигнал в соответствии с потребностями экспериментатора. Множество компаний и частных лиц обслуживают сообщество респирометров (например, Sable Systems , Qubit Systems, см. Также Warthog Systems).

Скорость митохондриального метаболизма

Внутри тела кислород доставляется к клеткам, а в клетках - к митохондриям , где он расходуется в процессе, генерируя большую часть энергии, необходимой организму. Митохондриальная респирометрия измеряет потребление кислорода митохондриями без участия всего живого животного и является основным инструментом для изучения функции митохондрий. Таким респирометрическим исследованиям могут быть подвергнуты три различных типа образцов: изолированные митохондрии (из культур клеток, животных или растений); проницаемые клетки (из клеточных культур); и проницаемые волокна или ткани (от животных). В последних двух случаях клеточная мембрана становится проницаемой за счет добавления химикатов, избирательно оставляя митохондриальную мембрану нетронутой. Следовательно, химические вещества, которые обычно не могут проникнуть через клеточную мембрану, могут напрямую влиять на митохондрии. Благодаря проницаемости клеточной мембраны клетка перестает существовать как живой, определенный организм, оставляя только митохондрии в качестве все еще функциональных структур. В отличие от респирометрии всего животного, митохондриальная респирометрия проводится в растворе, то есть образец суспендируют в среде. Сегодня митохондриальная респирометрия в основном выполняется с закрытой камерой.

Закрытая камера

Образец, суспендированный в подходящей среде, помещается в герметично закрытую метаболическую камеру. Митохондрии приводятся в определенные «состояния» путем последовательного добавления субстратов или ингибиторов. Поскольку митохондрии потребляют кислород, концентрация кислорода падает. Это изменение концентрации кислорода регистрируется кислородным датчиком в камере. По скорости снижения содержания кислорода (с учетом поправки на диффузию кислорода) можно рассчитать частоту дыхания митохондрий.

Приложения

Фундаментальные исследования

Функционирование митохондрий изучается в области биоэнергетики . Функциональные различия митохондрий разных видов изучаются респирометрией как аспектом сравнительной физиологии .

Прикладное исследование

Митохондриальная респирометрия используется для изучения функции митохондрий при митохондриальных заболеваниях или заболеваниях, которые (предположительно) имеют сильную связь с митохондриями, например сахарный диабет 2 типа , ожирение и рак . Другие области применения - это, например, спортивная наука и связь между функцией митохондрий и старением .

Оборудование

Обычное оборудование включает в себя герметичную метаболическую камеру, датчик кислорода и устройства для записи данных, перемешивания, термостатирования и способа введения химикатов в камеру. Как описано выше для респирометрии всего животного, выбор материалов очень важен. Пластиковые материалы не подходят для камеры из-за их способности удерживать кислород. Когда пластмассовые материалы неизбежны (например, для уплотнительных колец, покрытий мешалок или пробок), можно использовать полимеры с очень низкой проницаемостью для кислорода (такие как ПВДФ, а не, например, ПТФЭ ). Остаточная диффузия кислорода в материалы камеры или из них может быть обработана путем корректировки измеренных потоков кислорода для инструментального фонового потока кислорода. Весь прибор, состоящий из упомянутых компонентов, часто называют оксиграфом. Компании, предоставляющие оборудование для спирометрии всего животного, упомянутые выше, обычно не участвуют в митохондриальной респрометии. Сообщество обслуживается на самых разных уровнях цен и сложности такими компаниями, как Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences или Strathkelvin Instruments.

Languages

In other projects