RPE65 - RPE65
Пигментный эпителий сетчатки специфического 65 кД - белок, также известный как ретиноиды isomerohydrolase, представляет собой фермент из позвоночного визуального цикла , который кодируется в организме человека с помощью RPE65 гена . RPE65 экспрессируется в пигментном эпителии сетчатки (RPE, слой эпителиальных клеток, которые питают фоторецепторные клетки ) и отвечает за превращение всех трансретиниловых эфиров в 11-цис- ретинол во время фототрансдукции . Затем 11-цис-ретинол используется для регенерации зрительного пигмента в фоторецепторных клетках . RPE65 принадлежит к семейству ферментов каротиноидоксигеназ .
Функция
RPE65 - критический фермент в зрительном цикле позвоночных, обнаруженный в пигментированном эпителии сетчатки. Он также содержится в стержнях и шишках. Фотоизомеризация 11-цис-ретиналя в полностью транс-ретиналь инициирует путь фототрансдукции, через который мозг обнаруживает свет. Полностью транс-ретинол не является фотоактивным и, следовательно, должен быть преобразован в 11-цис-ретиналь, прежде чем он сможет рекомбинировать с опсином с образованием активного зрительного пигмента. RPE65 обращает фотоизомеризацию, превращая полностью транс-ретиниловый эфир в 11-цис-ретинол. Чаще всего эфирным субстратом является ретинилпальмитат . Другие ферменты зрительного цикла завершают реакции, необходимые для окисления и этерификации всего транс-ретинола до ретинилового эфира (субстрат RPE65) и для окисления 11-цис-ретинола до 11-цис-ретиналя (необходимого фотоактивного компонента зрительного пигмента). .
RPE65 также называют ретинолизомеразой или ретиноидизомеразой из-за прошлых дебатов о субстрате фермента и о том, участвует ли он в гидролизе сложного эфира .
Состав
RPE65 представляет собой димер двух симметричных ферментативно независимых субъединиц. Активный центр каждой субъединицы имеет структуру бета-пропеллера с семью лопастями с четырьмя гистидинами, которые содержат кофактор железа (II) . Этот структурный мотив является общим для всех изученных членов семейства ферментов каротиноидоксигеназ . RPE65 прочно связан с мембраной гладкой эндоплазматической сети в клетках RPE.
Активная структура сайта
Активный сайт каждого активного сайта RPE65 содержит кофактор Fe (II), связанный с четырьмя гистидинами (His 180 , His 241 , His 313 и His 527 ), каждый из которых вносится отдельной лопастью в структуре бета-пропеллера. Три из четырех гистидинов координированы с соседними остатками глутаминовой кислоты (Glu 148 , Glu 417 и Glu 469 ), которые, как считается, помогают расположить гистидины для связывания кофактора железа в октаэдрической геометрии . Phe 103 , Thr 147 и Glu 148 окружают активный сайт, где они помогают стабилизировать промежуточный карбокатион и увеличивают стереоселективность RPE65 для 11-цис-ретинола по сравнению с 13-цис-ретинолом.
Реагенты и продукты, вероятно, проникают в активный центр и покидают его через гидрофобный туннель, который, как считается, открывается в липидную мембрану для прямого всасывания липидного субстрата. Второй туннель меньшего размера также достигает активного центра и может служить каналом для воды, но он слишком узкий для транспортировки ретиноидных реагентов и продуктов.
Мембранные взаимодействия
RPE65 прочно связан с мембраной sER. sER аномально много в клетках RPE из-за их роли в процессинге липидных ретиноидов . Структурные исследования показывают, что RPE65 частично внедряется в мембрану sER посредством взаимодействий между его гидрофобной поверхностью и внутренней частью липидной мембраны . Это подтверждается необходимостью использования детергента для растворения RPE65. Основная часть гидрофобной поверхности RPE65, остатки 109–126, образует амфипатическую альфа-спираль, которая, вероятно, вносит вклад в сродство белка к мембране. Кроме того, Cys 112 является palmitoylated в родном RPE65, также подтверждает теорию о том , что гидрофобная поверхность RPE65 вложена в мембране.
Гидрофобная поверхность содержит вход в большой туннель, который ведет к активному центру фермента . Присутствие этого канала на гидрофобной поверхности в сочетании с продемонстрированной способностью RPE65 поглощать направление субстрата из липидного бислоя согласуется с тем, что RPE65 частично внедряется в мембрану.
Сохранение
RPE65 был выделен из широкого круга позвоночных, включая рыб-зебру, кур, мышей, лягушек и людей. Его структура высоко консервативна у разных видов, особенно в бета-пропеллерах и, вероятно, мембраносвязанных областях. Аминокислотные последовательности RPE65 человека и крупного рогатого скота отличаются менее чем на 1%. Остатки гистидина в структуре бета-пропеллера и связанный кофактор железа (II) на 100% консервативны среди исследованных ортологов RPE65 и других членов семейства каротиноидоксигеназ .
Растворимый RPE65 (sRPE65)
Ранее было высказано предположение, что RPE65 существует в двух взаимопревращенных формах: мембраносвязанный mRPE65 и растворимый sRPE65. Эта теория предполагает, что обратимое превращение sRPE65 в mRPE65 путем пальмитоилирования по Cys 231 , Cys 329 и Cys 330 играет роль в регуляции ретиноидного цикла и наделении mRPE65 его сродством к мембране. Однако кристаллографические исследования RPE65 показали, что эти остатки не являются пальмитоилированными и не обращены к поверхности. Новые исследования также не подтвердили наличие большого количества растворимого RPE65. Таким образом, от этой теории в значительной степени отказались.
Механизм
RPE65 катализирует превращение полностью транс-ретинилового эфира в 11-цис-ретинол посредством предполагаемого расщепления S N 1 O-алкильной связи. Комбинация RPE65, включающая расщепление O-алкилового эфира, геометрическую изомеризацию и добавление воды, в настоящее время считается уникальной в биологии. Однако реакции расщепления сложного O-алкилового эфира с такими же стабилизированными интермедиатами карбокатиона используются химиками-органиками.
О-алкильное расщепление
О-алкильное расщепление сложноэфирной связи при содействии кофактора Fe (II) создает промежуточный карбокатион, который стабилизируется сопряженной полиеновой цепью. Делокализация карбокатиона снижает порядок связи в полиеновой цепи, тем самым снижая энергию активации транс-цис-изомеризации. Phe 103 и Thr 178 дополнительно стабилизируют изомеризованный карбокатион и, как полагают, ответственны за стереоселективность фермента. После изомеризации нуклеофильная атака водой по C15 восстанавливает конъюгацию полиеновой цепи и завершает разрыв сложноэфирной связи.
Альтернативный механизм S N 2
Почти все другие биохимические реакции гидролиза сложного эфира протекают через реакцию S N 2 на ацильном углероде . Однако исследования изотопного мечения показали, что кислород в конечном 11-цис-ретинольном продукте RPE65 происходит из растворителя, а не из реагирующего сложного эфира, что подтверждает механизм расщепления O-алкила. Кроме того, механизм реакции гидролиза сложного эфира S N 2 будет основываться на отдельной, неблагоприятной атаке S N 2 на богатый электронами C11 каким-либо нуклеофилом - наиболее вероятно, остатком цистина - для завершения изомеризационной части реакции. Мало того, что нуклеофильная атака алкена энергетически невыгодна, но и в области активного центра отсутствуют цистиновые остатки, которые могли бы действовать как нуклеофил.
Клиническое значение
Мутации в этом гене были связаны с врожденным амаврозом Лебера 2 типа (LCA2) и пигментным ретинитом (RP). Мутации RPE65 являются наиболее часто обнаруживаемыми мутациями у пациентов с LCA в Дании. Подавляющее большинство мутаций RPE65 у пациентов с LCA2 и RP происходит в режиме бета-пропеллера и, как полагают, ингибирует правильную укладку белка и связывание кофактора железа. Наиболее частыми сайтами мутации пропеллеров являются Tyr 368 и His 182 . Замена в Arg 91 также обычна и, как было показано, влияет на мембранные взаимодействия RPE65 и поглощение субстрата.
Хотя полная потеря функции связана с такими заболеваниями, как LCA и RP, частичное ингибирование RPE65 было предложено в качестве лечения возрастной дегенерации желтого пятна (AMD). Было показано, что полностью транс-ретиниламин (Ret-NH2) и эмиксустат конкурентно ингибируют RPE65. Эмиксустат в настоящее время проходит 3-ю фазу клинических испытаний FDA в качестве средства для лечения AMD.
Работа Джин Беннет и Кэтрин А. Хай с мутацией RPE65 обратила вспять унаследованную форму слепоты. Они получили первое одобрение FDA на генную терапию генетического заболевания, которое называется Voretigene neparvovec . За свои научные достижения Джин Беннет и Кэтрин А. Хай были названы одним из трех финалистов в 2018 году присужденной Sanford Health премии Лотарингии Кросс за инновации в науке и медицине стоимостью 1 миллион долларов.
Смотрите также
использованная литература
дальнейшее чтение
- Структура и функция белка
- Båvik CO, Busch C, Eriksson U (ноябрь 1992 г.). «Характеристика мембранного рецептора ретинол-связывающего белка плазмы, экспрессируемого в пигментном эпителии сетчатки» . Журнал биологической химии . 267 (32): 23035–42. DOI : 10.1016 / S0021-9258 (18) 50052-1 . PMID 1331074 .
- Hamel CP, Tsilou E, Harris E, Pfeffer BA, Hooks JJ, Detrick B, Redmond TM (март 1993 г.). «Регулируемый в процессе развития микросомальный белок, специфичный для пигментного эпителия сетчатки позвоночных». Журнал неврологических исследований . 34 (4): 414–25. DOI : 10.1002 / jnr.490340406 . PMID 8474143 . S2CID 1590344 .
- Tsilou E, Hamel CP, Yu S, Redmond TM (октябрь 1997 г.). «RPE65, основной белок микросомальной мембраны пигментного эпителия сетчатки, ассоциируется с фосфолипидными липосомами» . Архивы биохимии и биофизики . 346 (1): 21–7. DOI : 10.1006 / abbi.1997.0276 . PMID 9328280 .
- Клинические и генетические исследования
- Коенекоп Р.К., Лопес И., ден Холландер А.И., Алликметс Р., Кремерс Ф.П. (июль 2007 г.). «Генетическое тестирование дистрофий и дисфункций сетчатки: преимущества, дилеммы и решения». Клиническая и экспериментальная офтальмология . 35 (5): 473–85. DOI : 10.1111 / j.1442-9071.2007.01534.x . PMID 17651254 . S2CID 37487873 .
- Николетти А., Вонг Д. Д., Кавасе К., Гибсон Л. Х., Ян-Фенг Т. Л., Ричардс Д. Э., Томпсон Д. А. (апрель 1995 г.). «Молекулярная характеристика гена человека, кодирующего обильный белок 61 кДа, специфичный для пигментного эпителия сетчатки». Молекулярная генетика человека . 4 (4): 641–9. DOI : 10.1093 / HMG / 4.4.641 . PMID 7633413 .
- Hamel CP, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG, Redmond TM (апрель 1994). «Ген специфического белка пигментного эпителия сетчатки RPE65 локализован в 1p31 человека и 3 мыши». Геномика . 20 (3): 509–12. DOI : 10.1006 / geno.1994.1212 . PMID 8034329 .
- Marlhens F, Bareil C, Griffoin JM, Zrenner E, Amalric P, Eliaou C, Liu SY, Harris E, Redmond TM, Arnaud B, Claustres M, Hamel CP (октябрь 1997 г.). «Мутации в RPE65 вызывают врожденный амавроз Лебера». Генетика природы . 17 (2): 139–41. DOI : 10,1038 / NG1097-139 . PMID 9326927 . S2CID 19648351 .
- Гу С.М., Томпсон Д.А., Срикумари С.Р., Лоренц Б., Финк У., Николетти А., Мурти К.Р., Ратманн М., Кумараманикавел Г., Дентон М.Дж., Гал А. (октябрь 1997 г.). «Мутации в RPE65 вызывают тяжелую дистрофию сетчатки с аутосомно-рецессивным началом в детском возрасте» . Генетика природы . 17 (2): 194–7. DOI : 10,1038 / NG1097-194 . PMID 9326941 . S2CID 3122835 .
- Моримура Х., Фишман Г.А., Гровер С.А., Фултон А.Б., Берсон Э.Л., Дриджа Т.П. (март 1998 г.). «Мутации в гене RPE65 у пациентов с аутосомно-рецессивным пигментным ретинитом или врожденным амаврозом Лебера» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (6): 3088–93. Bibcode : 1998PNAS ... 95.3088M . DOI : 10.1073 / pnas.95.6.3088 . PMC 19699 . PMID 9501220 .
- Николетти А., Кавасе К., Томпсон Д.А. (март 1998 г.). «Анализ промотора RPE65, гена, кодирующего белок, специфичный для пигментного эпителия сетчатки размером 61 кДа». Исследовательская офтальмология и визуализация . 39 (3): 637–44. PMID 9501877 .
- Marlhens F, Griffoin JM, Bareil C, Arnaud B, Claustres M, Hamel CP (1999). «Аутосомно-рецессивная дистрофия сетчатки, связанная с двумя новыми мутациями в гене RPE65» . Европейский журнал генетики человека . 6 (5): 527–31. DOI : 10.1038 / sj.ejhg.5200205 . PMID 9801879 .
- Ма Дж. Х, Чжан Д., Лазер М., Браунли Н. А., Ре Г. Г., Хазен-Мартин Д. Д., Редмонд TM, Крауч Р. К. (июнь 1999 г.). «Идентификация RPE65 в трансформированных клетках почек». Письма FEBS . 452 (3): 199–204. DOI : 10.1016 / S0014-5793 (99) 00606-7 . PMID 10386590 . S2CID 24731751 .
- Lotery AJ, Namperumalsamy P , Jacobson SG, Weleber RG, Fishman GA, Musarella MA, Hoyt CS, Héon E, Levin A, Jan J, Lam B, Carr RE, Franklin A, Radha S, Andorf JL, Sheffield VC, Stone EM (Апрель 2000 г.). «Мутационный анализ 3 генов у пациентов с врожденным амаврозом Лебера» . Архив офтальмологии . 118 (4): 538–43. DOI : 10.1001 / archopht.118.4.538 . PMID 10766140 .
- Симович М.Дж., Миллер Б., Эззельдин Х., Киркланд Б.Т., МакЛеод Дж., Фулмер С., Натанс Дж., Якобсон С.Г., Питтлер С.Дж. (август 2001 г.). «Четыре новые мутации в гене RPE65 у пациентов с врожденным амаврозом Лебера» . Мутация человека . 18 (2): 164. DOI : 10.1002 / humu.1168 . PMID 11462243 .
- Томпсон Д.А., МакГенри С.Л., Ли Й., Ричардс Дж. Э., Отман М. И., Швингер Е., Фоллрат Д., Якобсон С. Г., Гал А. (январь 2002 г.). «Дистрофия сетчатки из-за отцовской изодизомии хромосомы 1 или хромосомы 2 с гомоаллелизмом мутаций в RPE65 или MERTK, соответственно» . Американский журнал генетики человека . 70 (1): 224–9. DOI : 10,1086 / 338455 . PMC 384890 . PMID 11727200 .
- Фелиус Дж., Томпсон Д.А., Хан Н.В., Бингхэм Э.Л., Джеймисон Дж. А., Кемп Дж. А., Сивинг, Пенсильвания (январь 2002 г.). «Клиническое течение и зрительная функция в семье с мутациями в гене RPE65» . Архив офтальмологии . 120 (1): 55–61. DOI : 10.1001 / archopht.120.1.55 . PMID 11786058 .
- Джозеф Б., Сринивасан А., Сумиттра Н., Видхья А., Шетти Н.С., Утра С., Кумараманикавел Г. (апрель 2002 г.). «Ген RPE65: мультиплексная ПЦР и скрининг мутаций у пациентов из Индии с дегенеративными заболеваниями сетчатки». Журнал генетики . 81 (1): 19–23. DOI : 10.1007 / BF02715866 . PMID 12357075 . S2CID 36083188 .
- Изер С., ван ден Борн Л.И., Шуил Дж., Крус Х.Й., ван Гендерен М.М., Бунстра Ф.Н., ван ден Хельм Б., Бруннер Х.Г., Коенекоп Р.К., Кремерс Ф.П. (сентябрь 2003 г.). «Мутация-основатель Tyr368His RPE65 связана с вариабельной экспрессией и прогрессированием дистрофии сетчатки с ранним началом в 10 семьях генетически изолированной популяции» . Журнал медицинской генетики . 40 (9): 709–13. DOI : 10.1136 / jmg.40.9.709 . PMC 1735582 . PMID 12960219 .