Пыльцевая трубка - Pollen tube
Пыльцевой трубки представляет собой трубчатую структуру производства мужского гаметофита из семян растений , когда она прорастает. Удлинение пыльцевой трубки - неотъемлемый этап жизненного цикла растения. Пыльцевая трубка действует как канал для транспортировки мужских клеток гамет от пыльцевого зерна - либо от рыльца (у цветковых растений ) к семяпочкам у основания пестика, либо непосредственно через ткань семяпочек у некоторых голосеменных . У кукурузы эта отдельная клетка может вырасти более чем на 12 дюймов (30 см), чтобы пройти по длине пестика .
Пыльцевые трубки были впервые обнаружены Джованни Баттиста Амичи в 19 веке.
Они используются в качестве модели для понимания поведения растительных клеток. Продолжаются исследования, чтобы понять, как пыльцевая трубка реагирует на внеклеточные управляющие сигналы для достижения оплодотворения.
Описание
Пыльцевые трубки получают путем мужского гаметофита из семенных растений . Пыльцевые трубки действуют как каналы для транспортировки мужских клеток гамет от пыльцевых зерен - либо от рыльца (у цветковых растений ) к семяпочкам у основания пестика, либо непосредственно через ткань семяпочек у некоторых голосеменных . Пыльцевые трубки уникальны для семенных растений, и их структура развивалась на протяжении их истории, начиная с каменноугольного периода. Образование пыльцевых трубок является сложным процессом, и механизм не совсем понятен, но представляет большой интерес для ученых, поскольку пыльцевые трубки транспортируют мужские гаметы, продуцируемые пыльцевыми зернами, к женскому гаметофиту. Как только пыльцевое зерно имплантируется на совместимое рыльце, начинается его прорастание . Во время этого процесса пыльцевое зерно начинает выпирать наружу, образуя трубчатую структуру, известную как пыльцевая трубка. Структура пыльцевой трубки быстро опускается вниз по длине столбика за счет роста, направленного на кончик, со скоростью 1 см / ч, неся при этом две неподвижные сперматозоиды. Достигнув семяпочки, пыльцевая трубка разрывается, тем самым доставляя сперматозоиды к женскому гаметофиту . У цветковых растений происходит двойное оплодотворение . Первое событие оплодотворения дает диплоидную зиготу, а второе событие оплодотворения дает триплоидный эндосперм .
Покрытосеменные
Мужской репродуктивный орган цветка, тычинка , производит пыльцу. Открытие пыльников делает пыльцу доступной для последующего опыления (передачи пыльцевых зерен пестику , женскому репродуктивному органу). Каждое пыльцевое зерно содержит вегетативную клетку и генеративную клетку, которая делится с образованием двух сперматозоидов . Распространение пыльцы осуществляется абиотическими переносчиками, такими как ветер , вода , или биотическими переносчиками, такими как животные .
Как только пыльцевое зерно оседает на совместимом пестике, оно может прорасти в ответ на сладкую жидкость, выделяемую зрелым рыльцем. Липиды на поверхности рыльца также могут стимулировать рост пыльцевых трубок для совместимой пыльцы. Растения, которые самостоятельно стерильные часто тормозят пыльцевые зерна из их собственных цветов от растущих трубок пыльцы. Было обнаружено, что наличие нескольких зерен пыльцы стимулирует более быстрый рост пыльцевых трубок у некоторых растений. Затем вегетативная клетка производит пыльцевую трубку, трубчатый выступ из пыльцевого зерна, который несет сперматозоиды в своей цитоплазме . Сперматозоиды - это мужские гаметы , которые соединяются с яйцеклеткой и центральной клеткой при двойном оплодотворении . Первое событие оплодотворения дает диплоидную зиготу, а второе событие оплодотворения дает триплоидный эндосперм .
Проросшая пыльцевая трубка должна пробурить свой путь через богатые питательные вещества стиля и загнутый на дно яичника достичь яйцеклетки. Как только пыльцевая трубка достигает семяпочки, она лопается, чтобы доставить две сперматозоиды. Одна из сперматозоидов оплодотворяет яйцеклетку, которая превращается в зародыш, который станет будущим растением. Другой сливается с обоими полярными ядрами центральной клетки, образуя эндосперм , который служит источником пищи для эмбриона. Наконец, завязь разовьется в плод, а семяпочки - в семена .
Голосеменные
Пыльца голосеменных образуется в микроспорангиях, переносимых чешуей мужской шишки или микростробила . У большинства видов растения опыляются ветром, а пыльцевые зерна хвойных пород имеют воздушные пузыри, обеспечивающие плавучесть при воздушных потоках. Зерна откладываются в микропиле семяпочки женской шишки или мегастробилуса, где созревают до года. У хвойных деревьев и гнетофитов пыльца прорастает, образуя пыльцевую трубку, которая проникает в мегаспорангий или нуцеллус, несущий с собой ядра сперматозоидов, которые переносятся в яйцеклетку в развивающихся архегониях женского растения.
Механизм роста пыльцевой трубки
Признание
Самка спорофита должна распознать пыльцу, прилипшую к рыльцу. Часто может успешно расти только пыльца одного вида. Разросшаяся пыльца растет более успешно. При использовании самонесовместимых систем пыльца разрастается и вытесняет собственную пыльцу. Взаимодействие между стилем и пыльцой определяет совместимость и влияет на скорость роста пыльцевой трубки. Этот процесс отбора основывается на регуляции на уровне генов, в которых локусы генов гинеция позволяют либо собственной пыльце медленно расти, либо прекращать рост, либо взрываться, в то время как происходит более быстрый рост перешедшей пыльцы. Системы самонесовместимости поддерживают генетическое разнообразие. Что касается голосеменных, то они не содержат пестика с рыльцем. Следовательно, пыльца должна погрузиться в каплю опыления, перенося мужской гаметофит в яйцо обнаженной семяпочки. Однако пыльца разных видов не погрузится в каплю; пыльца остается плавающей сверху, а капля втягивается обратно в микропиле.
Посвящение
.jpg)
Как только пыльцевое зерно распознано и гидратировано, пыльцевое зерно прорастает и вырастает пыльцевая трубка. На этом этапе существует конкуренция, поскольку многие пыльцевые зерна могут конкурировать, чтобы добраться до яйца. Клеймо играет роль в направлении сперматозоидов к восприимчивой яйцеклетке в случае многих яйцеклеток. Только совместимые пыльцевые зерна могут расти, как это определено сигналом с помощью рыльца.
В пыльцевом зерне генеративная клетка дает начало сперматозоиду, тогда как вегетативные клетки имеют трубочную клетку, которая вырастает пыльцевую трубку. У некоторых растений есть механизмы для предотвращения самоопыления, например, стигма и пыльники созревают в разное время или имеют разную длину, что значительно способствует увеличению генетического разнообразия следующего поколения.
Скорость роста пыльцевых трубок сильно различается, и многие исследования сосредоточены на передаче сигналов. Экспрессия гена в пыльцевом зерне была идентифицирована как экспрессия гаметофита, а не родительского спорофита, поскольку он экспрессирует свою собственную уникальную мРНК и ферменты. У персикового дерева окружающая среда, через которую прорастает пыльцевая трубка, обеспечивает питание для роста трубки до семяпочки. Пыльцевые трубки толерантны, и даже на пыльце, поврежденной рентгеновскими и гамма-лучами, могут расти пыльцевые трубки.
Рост и сигнализация
На рост пыльцевой трубки влияет взаимодействие между стигмой и пыльцевым зерном. Удлинение трубки достигается за счет удлинения цитоскелета, и он отходит от кончика, что регулируется высоким уровнем кальция в цитозоле. Уровни кальция помогают синаптическим пузырькам в мембранах расти и расширяться на кончике. Полипептиды, обнаруженные в этом стиле, также регулируют рост пробирки, и были идентифицированы специфические пептиды, которые играют роль в передаче сигналов для роста.
Пептиды LURE, которые секретируются синергидами, занимающими пространство, прилегающее к яйцеклетке, могут использовать аттрактанты . У мутантных зародышей растений Arabidopsis , особенно у эмбрионов без синергидов, пыльцевые трубки не могли расти. Пыльцевая трубка растет в направлении яиц того же вида, что и пыльца. Внутривидовая передача сигналов помогает оплодотворять яйцеклетки и сперматозоиды одного вида. Передача сигналов в стиле важна, поскольку пыльцевые трубки могут расти без наличия зародышевого мешка, просто взаимодействуя со стилем. Другие части яичника включают цитоплазматические факторы, такие как миРНК, и химические градиенты, которые привлекают пыльцевую трубку для роста к синергидам.
Кальций и этилен у Arabidopsis thaliana участвуют в окончании пыльцевой трубки, когда она растет рядом с яичником. Увеличение кальция позволило высвободить две сперматозоиды из трубки, а также вызвать дегенерацию синергидной клетки. Химический градиент кальция также может способствовать прекращению роста пробирки на ранней стадии или в подходящее время.
Длина пыльцевой трубки зависит от вида. Он растет колебательно, пока не будет готов выпустить сперму рядом с яйцеклеткой для оплодотворения. Некоторые быстрорастущие пыльцевые трубки были обнаружены у лилий, табака и Impatiens sultanii. Скорость роста дает организму преимущество, но неясно, существует ли разница в скорости роста в популяции или она выбиралась на протяжении нескольких поколений из-за повышенной приспособленности.
Эволюция
Было идентифицировано много переходных особенностей, которые показывают корреляцию между эволюцией пыльцевой трубки и неподвижной спермы. Ранние семенные растения, такие как папоротники, имеют споры и подвижные сперматозоиды, плавающие в водной среде, что называется зооидогамией . Пыльцевая трубка покрытосеменных проста, неразветвлена и быстро растет, однако это не относится к предковым растениям.
У голосеменных, таких как Ginkgo biloba и cycadophyta, образуется гаусториальная пыльцевая трубка. Трубка просто всасывает питательные вещества из нуцеллуса самки и растет в два этапа. Пыльцевая трубка сильно разветвлена и растет на тканях женских спорофитов. Во-первых, у него растет основная трубка, за которой следует более сферический конец на конце, чтобы позволить сперматозоиду лопнуть рядом с архегониями. Двуядерная , multiflagellated сперма может затем плыть к яйцеклетке. Саговники имеют менее разветвленную структуру, а верхний конец набухает так же, как у гинкго . У саговников, однако, в пыльцевой трубке были обнаружены различные ферменты, которые направляют рост, и ткани нуцеллуса больше повреждаются при росте трубки.
В других типах голосеменных, хвойных и гнетофитных сперматозоиды неподвижны, что называется сифоногамией, и пыльцевая трубка прорастает через архегонии, помогая сперматозоидам более непосредственно достигать яйцеклетки. Хвойные деревья могут быть разветвленными или неразветвленными, и они вызывают дегенерацию женской ткани, поскольку она прорастает через большее количество тканей. Сосны, например, выделяют цитоплазму сперматозоидов, и слияние одной спермы происходит по мере того, как другая сперма дегенерирует. Тем не менее, у gnetophyta есть особенности, более похожие на пыльцевые трубки покрытосеменных, где трубка достигает яйца с ранней формой двойного оплодотворения. Однако эндосперм не образуется, и второе оплодотворение прерывается.
У покрытосеменных этот механизм изучен более широко, поскольку пыльцевые трубки у цветущих растений очень быстро растут за счет длинных стилей, чтобы достичь хорошо защищенного яйца. Существует большое разнообразие пыльцевых трубок у покрытосеменных растений, и многие модельные растения, такие как петуния, арабидопсис , лилия и табак, были изучены на предмет внутривидовой изменчивости и механизмов передачи сигналов. У цветущих растений может возникать явление, называемое полиаморией, когда оплодотворяется много семяпочек, а общая приспособленность организма к скорости роста пыльцевых трубок еще не изучена.
Поведение
Пыльцевые трубочки - отличная модель для понимания поведения растительных клеток. Их легко культивировать in vitro, они имеют очень динамичный цитоскелет, который полимеризуется с очень высокой скоростью, обеспечивая пыльцевую трубку интересными механическими свойствами. Пыльцевая трубка имеет необычный рост; он простирается исключительно на вершине. Расширение клеточной стенки только на кончике минимизирует трение между трубкой и пораженной тканью. Этот рост наконечника происходит скорее пульсирующе, чем постоянно. Путешествие пыльцевой трубки по стилю часто приводит к соотношению глубины к диаметру выше 100: 1 и до 1000: 1 у некоторых видов. У кукурузы эта отдельная клетка может вырасти более чем на 12 дюймов (30 см), чтобы пройти по длине пестика . Внутренний механизм и внешние взаимодействия, которые управляют динамикой роста пыльцевых трубок, до конца не изучены.
Роль актинового цитоскелета
Актина цитоскелета доказала свою решающую роль в оказании роста пыльцевой трубки. С точки зрения пространственного распределения актиновые филаменты расположены в трех различных структурах внутри пыльцевой трубки. Каждое уникальное расположение или узор способствует поддержанию поляризованных характеристик роста клеток пыльцевой трубки. В апикальной области - месте направленного на кончике роста - актиновые филаменты менее многочисленны, однако они очень динамичны. Более того, маленькие пузырьки накапливаются в верхушке, указывая тем самым, что эта область является местом критических событий нацеливания и слияния пузырьков. Такие события необходимы для регулирования скорости и направления роста пыльцевых трубок. В субапикальной области актиновые филаменты расположены в форме воротничка. Обратно-фонтанный поток цитоплазмы происходит на подвернутой вершине; направление потока цитоплазмы меняется на противоположное и продолжается вдоль актиновых актиновых тросов, образующих стержень. Стержневой участок представляет собой центральную часть пыльцевой трубки. В этой области актиновые филаменты расположены в осевые пучки с однородной полярностью, что позволяет транспортировать различные органеллы и везикулы от основания пыльцевой трубки к кончику, способствуя общему росту трубки.
Динамика актинового филамента
Как пространственное распределение, так и динамика актинового цитоскелета регулируются актин-связывающими белками (ABP). Чтобы экспериментально наблюдать изменения распределения, которые происходят в актиновом цитоскелете во время роста пыльцевой трубки, были использованы зеленые флуоресцентные белки (GFP). GFP были выбраны в основном для целей динамической визуализации из-за того, что они предоставили эффективные средства для неинвазивной визуализации актиновых филаментов у растений. Среди различных GFP, используемых во время экспериментов, были GFP-мТАлин, LIM-GFP и GFP-фимбрин / ABD2-GFP. Однако каждый из этих маркеров либо нарушает естественную структуру актиновых филаментов, либо неблагоприятно маркирует такие филаменты. Например, GFP-mTalin приводил к чрезмерному связыванию филаментов, а GFP-фимбрин / ABD2-GFP не метил актиновые филаменты, расположенные в апикальной или субапикальной областях пыльцевой трубки. В свете этих недостатков Lifeact-mEGFP был признан предпочтительным маркером актиновых филаментов в пыльцевой трубке; Lifeact-mEGFP способен обнаруживать все три расположения актиновых филаментов и оказывает минимальное влияние на естественную структуру актиновых филаментов. Lifeact-mEGFP был использован в качестве маркера для изучения динамики актиновых нитей в растущих пыльцевых трубках табака, лилий и Arabidopsis .
Исследования, проведенные с GFP, подтвердили, что динамическое состояние актиновых филаментов, расположенных в апикальной области, важно для роста пыльцевых трубок. Эксперименты с актиновыми филаментами, окрашенными GFP-mTalin, дали результаты, подтверждающие, что локализованные на кончике актиновые филаменты очень динамичны. Такие эксперименты установили связь между динамикой локализованных на кончике актиновых филаментов и их ролью в формировании актиновых структур в субапикальной области. Более того, эксперименты с актиновыми филаментами, расположенными в апикальном куполе Arabidopsis, показывают, что актиновые филаменты непрерывно производятся из апикальной мембраны пыльцевой трубки; производство этих актиновых филаментов опосредуется форминами . Эти находки предоставили доказательства, подтверждающие теорию о том, что актиновые филаменты, расположенные в апикальной области, очень динамичны и являются местом нацеливания и слияния пузырьков. Эксперименты с этиолированными клетками гипокотиля, а также с суспензионными клетками BY-2 показывают, что высокодинамичные актиновые филаменты, образующиеся из апикальной мембраны, могут быть либо перевернуты в результате событий отсечения филаментов и деполяризации, либо они могут перемещаться от вершины к апикальному флангу, что приводит к снижение накопления актиновых филаментов в апикальной области пыльцевой трубки.
Эксперименты по динамике актиновых филаментов в области голени также проводились с использованием GFP. Результаты показали, что максимальная длина филамента в этой области значительно увеличилась, а частота разрыва значительно снизилась. Такие находки указывают на то, что актиновые филаменты, расположенные в области голени, относительно стабильны по сравнению с актиновыми филаментами, расположенными в апикальной и субапикальной областях.
Регулирование
АД регулируют организацию и динамику актинового цитоскелета. Как указывалось ранее, актиновые филаменты непрерывно синтезируются из апикальной мембраны. Это указывает на присутствие заякоренных в мембране факторов нуклеации актина. Экспериментально было выдвинуто предположение, что формины представляют такие факторы нуклеации актина. Например, формин AtFH5 был идентифицирован как главный регулятор зародышеобразования актиновых филаментов, особенно для актиновых филаментов, синтезируемых из апикальной мембраны пыльцевой трубки. Генетические нокауты AtFH5 приводят к уменьшению количества актиновых филаментов как в апикальных, так и в субапикальных областях пыльцевой трубки, тем самым обеспечивая больше доказательств в поддержку теории, что AtFH5 нуклеирует сборку актиновых филаментов в апикальных и субапикальных областях пыльцевой трубки.
Формин класса I AtFH3 - еще один фактор нуклеации актина. AtFH3 зарождает сборку актиновых филаментов продольных актиновых кабелей, расположенных в области стержня пыльцевой трубки. Более конкретно, AtFH3 использует комплекс актин / профилин для взаимодействия с концом актиновых филаментов, тем самым инициируя зарождение актиновых филаментов.
Руководство
Большая работа была посвящена пониманию того, как пыльцевая трубка реагирует на внеклеточные управляющие сигналы для достижения оплодотворения. Пыльцевые трубки реагируют на комбинацию химических, электрических и механических сигналов во время своего прохождения через пестик. Однако неясно, как работают эти внешние сигналы или как они обрабатываются внутри. Более того, сенсорные рецепторы для каких-либо внешних сигналов еще не идентифицированы. Тем не менее, некоторые аспекты уже были определены как центральные в процессе роста пыльцевых трубок. Актиновые филаменты в цитоскелете, своеобразная клеточная стенка , динамика секреторных пузырьков и поток ионов , и это лишь некоторые из основных характеристик, которые легко идентифицировать как решающие, но роль которых еще полностью не выяснена.
Ремонт ДНК
Во время роста пыльцевой трубки возникающие повреждения ДНК необходимо восстанавливать, чтобы мужская геномная информация передавалась в неизменном виде следующему поколению. У растения Cyrtanthus mackenii двухклеточная зрелая пыльца содержит генеративную и вегетативную клетки. Сперматозоиды образуются путем митоза генеративной клетки во время удлинения пыльцевой трубки. Вегетативная клетка отвечает за развитие пыльцевых трубок. Возникающие двухцепочечные разрывы ДНК, по-видимому, эффективно восстанавливаются в генеративной клетке, но не в вегетативной, во время процесса переноса к женскому гаметофиту .
Организация RMD Actin Filament вносит свой вклад в рост пыльцевых трубок
Обзор
Для успешного оплодотворения происходит быстрый рост кончиков пыльцевых трубок, которые доставляют мужские гаметы в семяпочки. Пыльцевая трубка состоит из трех различных областей: вершины, которая является областью роста, суб вершины, которая является переходной областью, и стержня, который действует как нормальные растительные клетки со специфическими органеллами. В области верхушки происходит рост кончика, требующий слияния секреторных пузырьков. Внутри этих пузырьков в основном находятся пектин и гомогалактуронаны (часть клеточной стенки на кончике пыльцевой трубки). Гомогалактуронаны накапливаются в области верхушки посредством экзоцитоза, чтобы ослабить клеточную стенку. Будет формироваться более толстая и мягкая стенка наконечника с более низким пределом текучести при напряжении, что позволяет происходить расширению клеток, что приводит к увеличению роста наконечника. Обратный фонтан цитоплазматического потока происходит во время роста кончика, который необходим для расширения клеток, поскольку он транспортирует органеллы и везикулы между областью голени и субапексной областью.
Актиновый цитоскелет является важным фактором роста пыльцевой трубки, потому что существуют разные паттерны актинового цитоскелета в разных областях пыльцевой трубки для поддержания роста поляризованных клеток. Например, есть продольные актиновые кабели в области голени, чтобы регулировать обратный фонтан цитоплазматического потока. F-актин контролирует накопление полных везикул homogalacturonans, по существу, опосредующих рост кончиков в субапексной области. Актиновые филаменты контролируют взаимодействия апикальной мембраны и цитоплазмы, в то время как пыльцевая трубка растет в области верхушки. F-актин из апикальной мембраны вырабатывает связывающий актин белок, называемый формин, который необходим для роста кончика пыльцевой трубки. Формины экспрессируются в ростовых клетках кончика и делятся на две подгруппы: тип I и тип II. Формины типа I образуют структуры актина и участвуют в цитокинезе. Формины типа II, с другой стороны, способствуют росту поляризованных клеток, что необходимо для роста кончиков. Рост кончика является формой чрезвычайно поляризованного роста, и этот поляризованный процесс требует организации актинового цитоскелета, опосредованной актин-связывающим белком. Существенным белком, необходимым для роста кончиков, является белок, организующий актин, и белок-формин типа II, называемый детерминантом морфологии риса (RMD). RMD локализован на кончике пыльцевой трубки и контролирует рост пыльцевой трубки, регулируя полярность и организацию массива F-актина.
RMD способствует росту пыльцевых трубок
RMD способствует прорастанию пыльцы и росту пыльцевых трубок, и это доказано многочисленными экспериментами. В первом эксперименте сравниваются характеристики пестика и стигмы мутанта rmd-1 (растение риса без функциональной RMD) и растения риса дикого типа (с функциональной RMD). Пыльник и пестик были короче у мутантов rmd-1, чем у дикого типа. Этот эксперимент показал, что RMD имеет решающее значение для развития пыльцы. У растений риса дикого типа скорость прорастания увеличилась, в то время как у мутантов rmd-1 скорость прорастания снизилась. Это было замечено, когда оба были проращены в жидкой среде для проращивания. После проверки всхожести было проведено сравнение длины и ширины пыльцевых трубок двух растений. Пыльцевые трубки растений дикого типа имели большую длину пыльцевых трубок, чем мутанты, но мутанты имели большую ширину трубки. Эта большая ширина пыльцевой трубки у мутантов указывает на уменьшение роста поляризованных клеток и, следовательно, на уменьшение роста кончиков. Затем собирали пыльцевые зерна дикого типа и мутантов для сравнения активности опыления между дикими типами и мутантами. У мутантов наблюдалась пониженная активность и минимальное проникновение, тогда как у диких типов повышалась активность и проникновение через стиль и до дна пестиков. Эти наблюдения указывают на задержку роста пыльцевых трубок у мутантов rmd-1. Кроме того, не было никакого влияния на скорость оплодотворения между диким типом и мутантом, и это было проверено путем измерения скорости завязывания семян между диким типом и мутантом. Было обнаружено, что оба растения имели одинаковую норму закладки семян. Следовательно, RMD не влияет на оплодотворение и влияет только на рост кончиков.
Экспрессия RMD в пыльцевой трубке
Экстракции тотальной РНК из цельного цветка, чешуи, палеи, лодикулы, пестика, пыльника и зрелых пыльцевых зерен растений дикого типа проводились для того, чтобы обнаружить, где RMD специфически экспрессируется в растении в целом. Используя RT-qPCR (количественная ПЦР с обратной транскрипцией), было очевидно, что в каждой части растения присутствовали разные количества транскриптов RMD. И затем стало очевидно, где RMD присутствует в каждой части растения, с использованием RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией) и использования UBIQUITIN в качестве контроля. Эти два метода продемонстрировали обильное присутствие транскриптов RMD в лемме, пестике, пыльнике и зрелых пыльцевых зернах. Для подтверждения этих результатов был использован другой метод. В этом методе использовались трансгенные растения, в которых промоторная область RMD слита с репортерным геном, кодирующим GUS. Гистохимическое окрашивание тканей этих трансгенных растений затем показало высокую активность GUS в пестике, стенке пыльника и зрелых пыльцевых зернах. Таким образом, эти комбинированные результаты продемонстрировали, что RMD экспрессируется в этих конкретных органах растения.
Обнаружение сигналов GUS было использовано еще раз, чтобы изучить, где RMD специфически экспрессируется в пыльцевой трубке. Во-первых, пыльцевые зерна были собраны с трансгенных растений proRMD :: GUS, и было отмечено, что в этих зрелых пыльцевых зернах был сильный сигнал GUS. Эти пыльцевые зерна затем проращивали in vitro, и сигналы GUS наблюдались внутри кончика пыльцевых трубок. Однако сила этих сигналов GUS варьировалась на разных стадиях прорастания. Сигналы GUS были слабыми на кончике пыльцевой трубки на ранней стадии прорастания, но сильнее на более поздних стадиях прорастания. Таким образом, эти результаты подтверждают, что RMD участвует в прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок.
Локализация RMD в пыльцевой трубке
RMD, которые представляют собой формины типа II, состоят из фосфатазного (PTEN) -подобного домена (ответственного за локализацию белка) и доменов FH1 и FH2 (способствует полимеризации актина). Чтобы обнаружить локализацию RMD в пыльцевой трубке, были выполнены временные анализы растущих пыльцевых трубок табака и использован флуоресцентный белок-GFP. Наблюдалось множество конфокальных изображений различных пыльцевых трубок при определенных условиях: pLat52 :: eGFP (одиночный eGFP, управляемый специфическим для пыльцы промотором Lat52, который действует как контроль); pLat52 :: RMD-eGFP (белок RMD, слитый с eGFP); pLat52 :: PTEN-eGFP (домен PTEN, слитый с eGFP); и pLat52 :: FH1FH2-eGFP (домены FH1 и FH2, слитые с eGFP). Сравнивая изображения контроля с pLat52 :: RMD-eGFP, было замечено, что один GFP был распределен по всей пробирке, тогда как RMD-eGFP накапливался в области кончика пробирки. Следовательно, это показывает, что RMD локализован внутри кончика пыльцевой трубки.
Чтобы выяснить, отвечает ли PTEN-подобный домен за локализацию RMD, было проведено сравнение конфокальных изображений GFP, слитого с доменом PTEN, и укороченного RMD без домена PTEN (pLat52 :: FH1FH2-eGFP). Сигналы PTEN-eGFP были локализованы на кончике пыльцевых трубок, как сигналы RMD-eGFP, тогда как сигналы FH1FH2-eGFP присутствовали по всей пыльцевой трубке и не были локализованы полярным образом. Следовательно, эти объединенные результаты демонстрируют, что PTEN-подобный домен отвечает за локализацию кончика RMD в пыльцевых трубках.
RMD контролирует распределение и полярность F-актина в пыльцевой трубке
Чтобы определить, контролирует ли RMD организацию F-актина в пыльцевой трубке, наблюдали массивы F-актина в зрелых пыльцевых зернах дикого типа и rmd-1 с помощью окрашивания Alexa Fluor 488-фаллоидином. Сильно связанные актиновые филаменты присутствовали вокруг отверстий пыльцевых зерен дикого типа, хотя не было накопления актиновых волокон вокруг отверстий в пыльцевых зернах rmd-1. Кроме того, наблюдались слабые сигналы и случайная организация актиновых филаментов внутри пыльцевого зерна rmd-1. Таким образом, эти результаты подтверждают, что RMD важен для контроля прорастания пыльцы.
Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью статистического анализа, чтобы наблюдать за плотностью актиновых волокон внутри пыльцевых трубок. Была более высокая интенсивность флуоресценции в области стержня пробирок с rmd-мутантом, что означает, что в этой области была более высокая плотность F-актина. Но наблюдалась более низкая плотность F-актина в области кончика пробирок с rmd-мутантом по сравнению с пробирками дикого типа. Это демонстрирует, что картина распределения F-актина в пыльцевых трубках изменяется без функционального RMD.
Чтобы определить полярность актиновых кабелей, измеряли углы между актиновыми кабелями и осью удлинения пыльцевой трубки. Углы в области стержня пыльцевых трубок дикого типа были преимущественно менее 20 °, тогда как углы для пыльцевых трубок rmd-мутанта были больше 60 °. Эти результаты подтверждают тот факт, что RMD важен для роста поляризованных кончиков, потому что rmd-мутантные пыльцевые трубки (без функционального RMD) демонстрируют увеличенную ширину и, следовательно, уменьшение роста кончиков. Максимальная длина отдельных кабелей нитей F-актина от апикальной области до стержня удлиненных пыльцевых трубок также была измерена для проверки полярности внутри пыльцевой трубки. Максимальная длина кабелей F-актина была короче в пыльцевых трубках rmd-мутантов по сравнению с таковыми в трубках дикого типа. Следовательно, эти комбинированные результаты подтверждают, что правильная организация актиновых кабелей, а также нормальная плотность F-актина внутри кончика трубки может быть достигнута только при наличии RMD.
Смотрите также
использованная литература
внешние ссылки
- Праймер для пыльцевых трубок
- Изображения: Пыльцевая тетрада и Пыльцевая трубка Calanthe disolor Lindl. - Секретный цветочный сад Флавона