Полимеразной цепной реакции - Polymerase chain reaction

Полоска из восьми пробирок для ПЦР, каждая из которых содержит 100 мкл реакционной смеси.

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) - это метод, широко используемый для быстрого создания от миллионов до миллиардов копий (полных или частичных копий) определенного образца ДНК , что позволяет ученым брать очень небольшой образец ДНК и амплифицировать его (или его часть). это) на достаточно большую сумму для детального изучения. ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллис из Cetus Corporation . Это фундаментально для многих процедур, используемых в генетическом тестировании и исследованиях, включая анализ древних образцов ДНК и идентификацию инфекционных агентов. Используя ПЦР, копирование очень небольшого количества последовательностей ДНКэкспоненциально усиливаются в серии циклов изменения температуры. ПЦР в настоящее время является обычным и часто незаменимым методом, используемым в медицинских лабораторных исследованиях для самых разных приложений, включая биомедицинские исследования и криминалистику .

Большинство методов ПЦР основаны на термоциклировании . При термоциклировании реагенты подвергаются повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, что позволяет проводить различные температурно-зависимые реакции - в частности, плавление ДНК и репликацию ДНК, управляемую ферментами . ПЦР использует два основных реагента - праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью целевой области ДНК) и ДНК-полимеразу . На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией нуклеиновой кислоты . На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Две цепи ДНК затем становятся матрицами для ДНК-полимеразы, которая ферментативно собирает новую цепь ДНК из свободных нуклеотидов , строительных блоков ДНК. По мере продвижения ПЦР сгенерированная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируется.

Почти во всех приложениях ПЦР используется термостойкая ДНК-полимераза, такая как полимераза Taq , фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus . Если используемая полимераза была чувствительной к нагреванию, она денатурировала бы при высоких температурах стадии денатурации. До использования Taq- полимеразы ДНК-полимеразу приходилось добавлять вручную каждый цикл, что было утомительным и дорогостоящим процессом.

Применения метода включают клонирование ДНК для секвенирования , клонирование генов и манипуляции с ними, мутагенез генов; построение филогении на основе ДНК или функциональный анализ генов ; Диагностика и мониторинг из генетических нарушений ; амплификация древней ДНК; анализ генетических отпечатков пальцев для профилирования ДНК (например, в судебной медицине и проверке отцовства ); и обнаружение патогенов в тестах на нуклеиновую кислоту для диагностики инфекционных заболеваний .

Помещение полоски из восьми пробирок для ПЦР в термоциклер

Принципы

Термоциклер для ПЦР

ПЦР амплифицирует определенный участок цепи ДНК (мишень ДНК). Большинство методов ПЦР амплифицируют фрагменты ДНК длиной от 0,1 до 10 килопар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты до 40 кб. Количество амплифицированного продукта определяется доступными в реакции субстратами, которые становятся ограничивающими по мере развития реакции.

Для базовой настройки ПЦР требуется несколько компонентов и реагентов, в том числе:

  • матричной ДНК , который содержит ДНК - мишени для амплификации область
  • ДНК - полимеразы ; фермент, который полимеризует новые цепи ДНК; особенно распространена термостойкая полимераза Taq , поскольку она с большей вероятностью останется нетронутой в процессе высокотемпературной денатурации ДНК
  • две ДНК - праймеры , которые являются комплементарными к 3' (три простых) концам каждому из смысловых и антисмысловых нитей ДНК - мишени (ДНК - полимераза может только связываться и удлиненной из двухцепочечной области ДНК, без праймеров, отсутствует двухцепочечный сайт инициации, с которым полимераза может связываться); специфические праймеры, которые комплементарны целевой области ДНК, выбираются заранее и часто изготавливаются на заказ в лаборатории или приобретаются у коммерческих поставщиков биохимических продуктов.
  • дезоксинуклеозидтрифосфаты или dNTP (иногда называемые «дезоксинуклеотидтрифосфаты»; нуклеотиды, содержащие трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК.
  • буферный раствор обеспечивает подходящую химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК - полимеразы
  • двухвалентные катионы , обычноионы магния (Mg) или марганца (Mn); Mg 2+ является наиболее распространенным, но Mn 2+ можно использовать для PCR-опосредованного мутагенеза ДНК , поскольку более высокаяконцентрацияMn 2+ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК; и одновалентные катионы , обычноионы калия (K)

Реакцию обычно проводят в объеме 10–200  мкл в небольших реакционных пробирках (объем 0,2–0,5 мл) в термоциклере . Термоциклер нагревает и охлаждает реакционные трубки для достижения температур, необходимых на каждой стадии реакции (см. Ниже). Многие современные термоциклеры используют эффект Пельтье , который позволяет как нагревать, так и охлаждать блок, удерживающий трубки ПЦР, просто путем изменения направления электрического тока. Тонкостенные реакционные трубки обеспечивают благоприятную теплопроводность для быстрого теплового равновесия. Большинство термоциклеров имеют подогреваемые крышки для предотвращения конденсации в верхней части реакционной трубы. Более старые термоциклеры без подогреваемой крышки требуют слоя масла поверх реакционной смеси или шарика воска внутри пробирки.

Процедура

Обычно ПЦР состоит из серии из 20–40 повторяющихся изменений температуры, называемых термическими циклами, причем каждый цикл обычно состоит из двух или трех дискретных температурных шагов (см. Рисунок ниже). Циклу часто предшествует один температурный этап при очень высокой температуре (> 90 ° C (194 ° F)), за которым следует одно удержание в конце для увеличения объема конечного продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и продолжительность их применения в каждом цикле зависят от множества параметров, включая фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и дНТФ в реакции и температуру плавления ( T m ) грунтовки. Отдельные шаги, общие для большинства методов ПЦР, следующие:

  • Инициализация : этот шаг требуется только для ДНК-полимераз, требующих тепловой активации с помощью ПЦР с горячим стартом . Он заключается в нагревании реакционной камеры до температуры 94–96 ° C (201–205 ° F) или 98 ° C (208 ° F), если используются чрезвычайно термостабильные полимеразы, который затем выдерживается в течение 1–10 минут.
  • Денатурация : этот шаг является первым регулярным циклом и состоит из нагревания реакционной камеры до 94–98 ° C (201–208 ° F) в течение 20–30 секунд. Это вызывает плавление ДНК или денатурацию двухцепочечной матрицы ДНК за счет разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, в результате чего образуются две одноцепочечные молекулы ДНК.
  • Отжиг : на следующем этапе температура реакции снижается до 50–65 ° C (122–149 ° F) на 20–40 секунд, что позволяет отжиг праймеров для каждой из одноцепочечных матриц ДНК. В реакционную смесь обычно включают два разных праймера: по одному для каждого из двух одноцепочечных комплементов, содержащих целевой участок. Праймеры сами по себе представляют собой одноцепочечные последовательности, но они намного короче, чем длина целевой области, и дополняют только очень короткие последовательности на 3'-конце каждой цепи.
Очень важно определить правильную температуру для этапа отжига, потому что на эффективность и специфичность сильно влияет температура отжига. Эта температура должна быть достаточно низкой, чтобы позволить гибридизацию праймера с цепью, но достаточно высокой, чтобы гибридизация была специфичной, то есть праймер должен связываться только с полностью комплементарной частью цепи и ни с чем другим. Если температура будет слишком низкой, грунтовка может плохо закрепиться. Если он будет слишком высоким, праймер может вообще не схватиться. Типичная температура отжига примерно на 3–5 ° C ниже T m используемых праймеров. Стабильные водородные связи между комплементарными основаниями образуются только тогда, когда последовательность праймера очень близко совпадает с последовательностью матрицы. На этом этапе полимераза связывается с гибридом праймер-матрица и начинает образование ДНК.
  • Удлинение / удлинение : температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; Оптимальная температура активности термостабильной ДНК-полимеразы Taq- полимеразы составляет примерно 75–80 ° C (167–176 ° F), хотя для этого фермента обычно используется температура 72 ° C (162 ° F). На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, путем добавления свободных дНТФ из реакционной смеси, которые комплементарны матрице в направлении от 5'-к-3 ' , конденсируя 5'- фосфатную группу. дНТФ с 3'- гидроксильной группой на конце растущей (удлиняющейся) цепи ДНК. Точное время, необходимое для удлинения, зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины целевой области ДНК для амплификации. Как показывает опыт, при оптимальной температуре большинство ДНК-полимераз полимеризуют тысячу оснований в минуту. В оптимальных условиях (то есть, если нет ограничений из-за ограничивающих субстратов или реагентов), на каждой стадии удлинения / элонгации количество целевых последовательностей ДНК удваивается. В каждом последующем цикле исходные цепочки-матрицы плюс все вновь сгенерированные цепочки становятся цепями-матрицами для следующего раунда элонгации, что приводит к экспоненциальной (геометрической) амплификации конкретной целевой области ДНК.
Процессы денатурации, отжига и удлинения составляют единый цикл. Чтобы амплифицировать ДНК-мишень до миллионов копий, требуется несколько циклов. Формула, используемая для расчета количества копий ДНК, образованных после заданного количества циклов, - 2 n , где n - количество циклов. Таким образом, набор реакций для 30 циклов дает 2 30 , или 1 073 741 824 копий исходной целевой области двухцепочечной ДНК.
  • Окончательная элонгация : этот единственный этап не является обязательным, но выполняется при температуре 70–74 ° C (158–165 ° F) (температурный диапазон, необходимый для оптимальной активности большинства полимераз, используемых в ПЦР) в течение 5–15 минут после последний цикл ПЦР, чтобы убедиться, что оставшаяся одноцепочечная ДНК полностью удлинена.
  • Окончательная выдержка : на заключительном этапе реакционная камера охлаждается до 4–15 ° C (39–59 ° F) на неопределенное время и может использоваться для кратковременного хранения продуктов ПЦР.
Схематическое изображение полного цикла ПЦР
Окрашенные бромидом этидия продукты ПЦР после гель-электрофореза . Два набора праймеров использовали для амплификации целевой последовательности из трех различных образцов ткани. В образце № 1 амплификации нет; Полосы ДНК в образцах №2 и №3 указывают на успешную амплификацию целевой последовательности. Гель также показывает положительный контроль и лестницу ДНК, содержащую фрагменты ДНК определенной длины для определения размера полос в экспериментальных ПЦР.

Чтобы проверить, успешно ли сгенерирована ПЦР ожидаемая область-мишень ДНК (также иногда называемая амплимером или ампликоном ), можно использовать электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер продуктов ПЦР определяется путем сравнения с лестницей ДНК , маркером молекулярной массы, который содержит фрагменты ДНК известных размеров, который проходит на геле вместе с продуктами ПЦР.

Такер ПЦР

Этапы

Как и в случае с другими химическими реакциями, на скорость реакции и эффективность ПЦР влияют ограничивающие факторы. Таким образом, весь процесс ПЦР можно разделить на три стадии в зависимости от хода реакции:

  • Экспоненциальное усиление : в каждом цикле количество продукта удваивается (при условии 100% эффективности реакции). После 30 циклов единичная копия ДНК может быть увеличена до 1 000 000 000 (одного миллиарда) копий. Таким образом, в некотором смысле репликацией дискретной цепи ДНК манипулируют в пробирке в контролируемых условиях. Реакция очень чувствительная: должны присутствовать только незначительные количества ДНК.
  • Стадия выравнивания : реакция замедляется, поскольку ДНК-полимераза теряет активность и потребление реагентов, таких как дНТФ и праймеры, становится более ограниченным.
  • Плато : продукт больше не накапливается из-за исчерпания реагентов и ферментов.
Exponential Amplification.svg

Оптимизация

На практике ПЦР может потерпеть неудачу по разным причинам, отчасти из-за ее чувствительности к контаминации, вызывающей амплификацию ложных продуктов ДНК. По этой причине был разработан ряд методов и процедур для оптимизации условий ПЦР. Загрязнение посторонней ДНК решается с помощью лабораторных протоколов и процедур, которые отделяют пре-ПЦР-смеси от потенциальных загрязнителей ДНК. Обычно это включает пространственное разделение областей установки ПЦР от областей анализа или очистки продуктов ПЦР, использование одноразовой пластиковой посуды и тщательную очистку рабочей поверхности между установками реакции. Методы конструирования праймеров важны для повышения выхода продуктов ПЦР и предотвращения образования ложных продуктов, а использование альтернативных компонентов буфера или ферментов полимеразы может помочь при амплификации длинных или других проблемных участков ДНК. Добавление реагентов, таких как формамид , в буферные системы может повысить специфичность и выход ПЦР. Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера.

Приложения

Селективное выделение ДНК

ПЦР позволяет изолировать фрагменты ДНК из геномной ДНК путем селективной амплификации определенной области ДНК. Такое использование ПЦР дополняет многие способы, такие как создание зондов для гибридизации для Саузерн- или Нозерн- гибридизации и клонирования ДНК , которые требуют больших количеств ДНК, представляющих конкретную область ДНК. ПЦР обеспечивает эти методы с большим количеством чистой ДНК, что позволяет анализировать образцы ДНК даже из очень небольших количеств исходного материала.

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК для определения неизвестных ПЦР-амплифицированных последовательностей, в которых один из праймеров для амплификации может быть использован при секвенировании по Сэнгеру , выделение последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду , фаг , или космида (в зависимости от размера), или генетический материал другого организма. Бактериальные колонии (например, E. coli ) можно быстро проверить с помощью ПЦР на предмет правильных векторных конструкций ДНК . ПЦР также может использоваться для генетического снятия отпечатков пальцев ; судебно-медицинский метод, используемый для идентификации человека или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных методов, основанных на ПЦР.

Электрофорез фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР:
  1. Отец
  2. Ребенок
  3. Мать

Ребенок унаследовал некоторые, но не все отпечатки пальцев каждого из своих родителей, что дает ему новый уникальный отпечаток.

Некоторые методы отпечатков пальцев ПЦР обладают высокой различающей способностью и могут использоваться для выявления генетических родств между людьми, такими как родитель-ребенок или между братьями и сестрами, а также при тестировании на отцовство (рис. 4). Этот метод также можно использовать для определения эволюционных взаимоотношений между организмами, когда используются определенные молекулярные часы (например, гены 16S рРНК и recA микроорганизмов).

Амплификация и количественная оценка ДНК

Поскольку ПЦР амплифицирует участки ДНК, на которые она нацелена, ПЦР можно использовать для анализа очень малых количеств образца. Это часто имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы , когда в качестве доказательства доступно только следовое количество ДНК. ПЦР также может использоваться для анализа древней ДНК , возраст которой насчитывает десятки тысяч лет. Эти основанные на ПЦР методы были успешно использованы на животных, таких как мамонт возраст сорок тысяч лет , а также на ДНК человека, в самых разных областях - от анализа египетских мумий до идентификации русского царя и тела Английский король Ричард III .

Методы количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени (qPCR, не путать с RT-PCR ) позволяют оценить количество данной последовательности, присутствующей в образце - метод, часто применяемый для количественного определения уровней экспрессии генов . Количественная ПЦР - это признанный инструмент для количественной оценки ДНК, который измеряет накопление продукта ДНК после каждого раунда амплификации ПЦР.

КПЦР позволяет количественно определять и обнаруживать конкретную последовательность ДНК в режиме реального времени, поскольку она измеряет концентрацию во время процесса синтеза. Есть два метода одновременного обнаружения и количественной оценки. Первый метод заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые неспецифически удерживаются между двойными нитями. Второй метод включает зонды, которые кодируют определенные последовательности и помечаются флуоресцентной меткой. Обнаружение ДНК с использованием этих методов можно увидеть только после гибридизации зондов с их комплементарной ДНК. Интересной комбинацией методов является ПЦР в реальном времени и обратная транскрипция. Этот сложный метод, называемый RT-qPCR, позволяет количественно определять небольшое количество РНК. С помощью этого комбинированного метода мРНК преобразуется в кДНК, которая в дальнейшем количественно определяется с помощью кПЦР. Этот метод снижает вероятность ошибки в конечной точке ПЦР, увеличивая шансы обнаружения генов, связанных с генетическими заболеваниями, такими как рак. Лаборатории используют ОТ-КПЦР для точного измерения регуляции генов. Математические основы для надежной количественной оценки ПЦР и RT-qPCR облегчают реализацию точных процедур подбора экспериментальных данных в исследованиях, медицине, диагностике и инфекционных заболеваниях.

Медицинские и диагностические приложения

Потенциальные родители могут быть проверены на генетические носители , или их дети могут быть проверены на предмет наличия какого-либо заболевания . Образцы ДНК для пренатального тестирования можно получить с помощью амниоцентеза , взятия проб ворсинок хориона или даже путем анализа редких фетальных клеток, циркулирующих в кровотоке матери. ПЦР-анализ также важен для преимплантационной генетической диагностики , когда отдельные клетки развивающегося эмбриона проверяются на наличие мутаций.

  • ПЦР также может использоваться как часть чувствительного теста на типирование тканей , жизненно важного для трансплантации органов . С 2008 года даже есть предложение заменить традиционные тесты на антитела для определения группы крови тестами на основе ПЦР.
  • Многие формы рака связаны с изменениями онкогенов . Используя тесты на основе ПЦР для изучения этих мутаций, иногда можно индивидуально адаптировать режимы терапии к пациенту. ПЦР позволяет раннюю диагностику злокачественных заболеваний, таких как лейкемия и лимфомы , которые в настоящее время являются наиболее развитыми в исследованиях рака и уже используются в повседневной практике. ПЦР-анализы можно проводить непосредственно на образцах геномной ДНК для обнаружения злокачественных клеток, специфичных для транслокаций, с чувствительностью, которая по крайней мере в 10 000 раз выше, чем у других методов. ПЦР очень полезна в области медицины, поскольку она позволяет изолировать и усилить опухолевые супрессоры. Например, количественная ПЦР может использоваться для количественного определения и анализа отдельных клеток, а также для распознавания подтверждений и комбинаций ДНК, мРНК и белков.

Приложения для инфекционных заболеваний

ПЦР позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные заболевания, в том числе вызванные бактериями или вирусами. ПЦР также позволяет идентифицировать без cultivatable или медленно растущих микроорганизмов , таких как микобактерии , анаэробные бактерии или вирусы из тканевых культур анализов и моделей животных . Основой для диагностических приложений ПЦР в микробиологии является обнаружение инфекционных агентов и различение непатогенных штаммов от патогенных на основании специфических генов.

ПЦР произвела революцию в характеристике и обнаружении возбудителей инфекционных заболеваний в следующих направлениях:

  • Вирус иммунодефицита человека (или ВИЧ ), является трудной целью найти и искоренить. Самые ранние тесты на инфекцию основывались на наличии антител к вирусу, циркулирующих в кровотоке. Однако антитела появляются только через несколько недель после заражения, материнские антитела маскируют инфекцию новорожденного, а терапевтические средства для борьбы с инфекцией не влияют на антитела. Были разработаны тесты ПЦР , которые могут обнаружить всего один вирусный геном среди ДНК более чем 50 000 клеток-хозяев. Инфекции могут быть обнаружены раньше, донорская кровь может быть проверена непосредственно на вирус, новорожденные могут быть немедленно проверены на инфекцию, а эффекты противовирусного лечения могут быть количественно оценены .
  • Некоторые болезнетворные микроорганизмы, например туберкулезные , трудно получить от пациентов, и их медленно выращивать в лаборатории. Тесты на основе ПЦР позволили обнаружить небольшое количество болезнетворных организмов (как живых, так и мертвых) в удобных образцах . Подробный генетический анализ также может использоваться для выявления устойчивости к антибиотикам, что позволяет незамедлительно и эффективно лечить. Эффекты терапии также можно оценить немедленно.
  • Распространение болезнетворного организма через популяции домашних или диких животных можно контролировать с помощью ПЦР-тестирования. Во многих случаях появление новых вирулентных подтипов можно обнаружить и контролировать. Подтипы организма, которые были ответственны за более ранние эпидемии, также можно определить с помощью ПЦР-анализа.
  • Вирусную ДНК можно обнаружить с помощью ПЦР. Используемые праймеры должны быть специфичными для целевых последовательностей в ДНК вируса, и ПЦР может использоваться для диагностических анализов или секвенирования ДНК вирусного генома. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаруживать вирус вскоре после заражения и даже до начала заболевания. Такое раннее обнаружение может дать врачам значительное время для начала лечения. Количество вируса (« вирусная нагрузка ») у пациента также может быть определено количественно с помощью методов количественного определения ДНК на основе ПЦР (см. Ниже). Вариант ПЦР ( ОТ-ПЦР ) используется для обнаружения вирусной РНК, а не ДНК: в этом тесте фермент обратная транскриптаза используется для создания последовательности ДНК, которая соответствует вирусной РНК; затем эту ДНК амплифицируют обычным методом ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется для обнаружения вирусного генома SARS-CoV-2.
  • Такие заболевания, как коклюш (или коклюш ) вызываются бактериями Bordetella pertussis . Эта бактерия отличается серьезной острой респираторной инфекцией, которая поражает различных животных и людей и привела к гибели многих маленьких детей. Токсин коклюша представляет собой экзотоксин белка, который связывается с клеточными рецепторами двумя димерами и вступает в реакцию с различными типами клеток, такими как Т-лимфоциты, которые играют роль в клеточном иммунитете. ПЦР - важный инструмент тестирования, который может обнаружить последовательности в гене токсина коклюша. Поскольку ПЦР имеет высокую чувствительность к токсину и быстрое время обработки, она очень эффективна для диагностики коклюша по сравнению с посевом.

Криминалистические приложения

Разработка протоколов генетической (или ДНК ) дактилоскопии на основе ПЦР нашла широкое применение в судебной медицине :

  • В своей наиболее разборчивой форме генетический дактилоскопический отпечаток может однозначно отличить любого человека от всего населения мира . Небольшие образцы ДНК можно выделить с места преступления и сравнить с образцами ДНК подозреваемых или из базы данных ДНК более ранних свидетельств или осужденных. Более простые версии этих тестов часто используются для быстрого исключения подозреваемых в ходе уголовного расследования. Доказательства преступлений давней давности могут быть проверены, подтвердив или оправдав первоначально осужденных.
  • Криминалистическое типирование ДНК стало эффективным способом выявления или реабилитации подозреваемых в совершении преступлений благодаря анализу улик, обнаруженных на месте преступления. Геном человека имеет множество повторяющихся областей, которые можно найти в последовательностях генов или в некодирующих областях генома. В частности, до 40% ДНК человека повторяется. Эти повторяющиеся некодирующие области генома делятся на две разные категории. Первая категория называется тандемными повторами с переменным числом (VNTR), длина которых составляет 10–100 пар оснований, а вторая категория называется короткими тандемными повторами (STR), и они состоят из повторяющихся участков из 2–10 пар оснований. ПЦР используется для амплификации нескольких хорошо известных VNTR и STR с использованием праймеров, фланкирующих каждую из повторяющихся областей. Размеры фрагментов, полученных от любого человека для каждой из STR, будут указывать, какие аллели присутствуют. Путем анализа нескольких STR для отдельного человека будет найден набор аллелей для каждого человека, который статистически может быть уникальным. Исследователи определили полную последовательность генома человека. Эта последовательность может быть легко доступна через веб-сайт NCBI и используется во многих реальных приложениях. Например, ФБР составило набор сайтов ДНК-маркеров, используемых для идентификации, и они называются базой данных ДНК комбинированной системы индекса ДНК (CODIS). Использование этой базы данных позволяет использовать статистический анализ для определения вероятности совпадения образца ДНК. ПЦР - очень мощный и важный аналитический инструмент, который можно использовать для криминалистического типирования ДНК, потому что исследователям требуется лишь очень небольшое количество целевой ДНК для анализа. Например, один человеческий волос с прикрепленным к нему волосяным фолликулом содержит достаточно ДНК для проведения анализа. Точно так же несколько образцов спермы, образцов кожи из-под ногтей или небольшое количество крови могут предоставить достаточно ДНК для окончательного анализа.
  • Менее разборчивые формы дактилоскопии ДНК могут помочь в проверке отцовства по ДНК , когда человека сравнивают со своими близкими родственниками. Можно проверить ДНК неопознанных человеческих останков и сравнить с ДНК возможных родителей, братьев и сестер или детей. Подобное тестирование может быть использовано для подтверждения биологических родителей усыновленного (или похищенного) ребенка. Фактический биологический отец новорожденного также может быть подтвержден (или исключен).
  • Было показано, что конструкция ПЦР AMGX / AMGY не только облегчает амплификацию последовательностей ДНК из очень небольшого количества генома. Однако его также можно использовать для определения пола в реальном времени по образцам костей. Это обеспечивает мощный и эффективный способ определения пола в судебных делах и древних образцах.

Приложения для исследований

ПЦР применялась во многих областях молекулярной генетики:

  • ПЦР позволяет быстро получить короткие фрагменты ДНК, даже если известна не более чем последовательность двух праймеров. Эта способность ПЦР дополняет многие методы, такие как создание гибридизационных зондов для гибридизации по Саузерну или Нозерн-блоттингу . ПЦР обеспечивает эти методы с большим количеством чистой ДНК, иногда в виде одной цепи, что позволяет проводить анализ даже из очень небольших количеств исходного материала.
  • Задача секвенирования ДНК также может быть облегчена с помощью ПЦР. Известные сегменты ДНК могут быть легко получены от пациента с генетической мутацией заболевания. Модификации метода амплификации могут извлекать сегменты из совершенно неизвестного генома или генерировать только одну цепочку интересующей области.
  • ПЦР имеет множество приложений к более традиционному процессу клонирования ДНК . Он может извлекать сегменты для вставки в вектор из более крупного генома, который может быть доступен только в небольших количествах. Используя единый набор «векторных праймеров», он также может анализировать или извлекать фрагменты, которые уже были вставлены в векторы. Некоторые изменения в протоколе ПЦР могут вызвать мутации (общие или сайт-ориентированные) вставленного фрагмента.
  • Сайты с метками последовательностей - это процесс, в котором ПЦР используется в качестве индикатора того, что определенный сегмент генома присутствует в конкретном клоне. Проект « Геном человека» нашел это приложение жизненно важным для картирования клонов космид, которые они секвенировали, и для координации результатов из разных лабораторий.
  • Применение ПЦР - филогенетический анализ ДНК из древних источников , таких как ДНК , найденная в восстановленных костях неандертальцев , из замороженных тканей мамонтов или из мозга египетских мумий. В некоторых случаях сильно деградировавшая ДНК из этих источников может быть повторно собрана на ранних стадиях амплификации.
  • Распространенным применением ПЦР является изучение паттернов экспрессии генов . Ткани (или даже отдельные клетки) можно анализировать на разных этапах, чтобы увидеть, какие гены стали активными, а какие выключены. Это приложение также может использовать количественную ПЦР для количественного определения фактических уровней экспрессии.
  • Способность ПЦР одновременно амплифицировать несколько локусов из отдельных сперматозоидов значительно расширила более традиционную задачу генетического картирования путем изучения хромосомных кроссоверов после мейоза . Редкие случаи кроссовера между очень близкими локусами наблюдались непосредственно при анализе тысяч отдельных сперматозоидов. Точно так же можно анализировать необычные делеции, вставки, транслокации или инверсии, и все это без необходимости ждать (или платить) за долгие и трудоемкие процессы оплодотворения, эмбриогенеза и т. Д.
  • Сайт-направленный мутагенез : ПЦР можно использовать для создания мутантных генов с мутациями, выбранными учеными по желанию. Эти мутации могут быть выбраны для понимания того, как белки выполняют свои функции, а также для изменения или улучшения функции белков.

Преимущества

ПЦР имеет ряд преимуществ. Его довольно просто понять и использовать, и он быстро дает результаты. Этот метод очень чувствителен и может производить от миллионов до миллиардов копий конкретного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. qRT-PCR имеет те же преимущества, что и PCR, с дополнительным преимуществом количественной оценки синтезированного продукта. Следовательно, его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов при опухолях, микробах или других болезненных состояниях.

ПЦР - очень мощный и практичный инструмент исследования. С помощью ПЦР выясняется последовательность многих заболеваний неизвестной этиологии. Этот метод может помочь идентифицировать последовательность ранее неизвестных вирусов, связанных с уже известными, и, таким образом, дать нам лучшее понимание самого заболевания. Если можно будет еще больше упростить процедуру и разработать чувствительные нерадиометрические системы обнаружения, ПЦР займет видное место в клинической лаборатории на долгие годы.

Ограничения

Одним из основных ограничений ПЦР является то, что предварительная информация о целевой последовательности необходима для создания праймеров, которые позволят ее селективную амплификацию. Это означает, что, как правило, пользователи ПЦР должны знать точную последовательность (последовательности) перед целевой областью на каждой из двух одноцепочечных матриц, чтобы гарантировать, что ДНК-полимераза должным образом связывается с гибридами праймер-матрица и впоследствии генерирует вся область-мишень во время синтеза ДНК.

Как и все ферменты, ДНК-полимеразы также подвержены ошибкам, что, в свою очередь, вызывает мутации в генерируемых фрагментах ПЦР.

Еще одним ограничением ПЦР является то, что даже самое маленькое количество загрязняющей ДНК может быть амплифицировано, что приведет к вводящим в заблуждение или неоднозначным результатам. Чтобы свести к минимуму вероятность заражения, исследователи должны зарезервировать отдельные комнаты для подготовки реагентов, ПЦР и анализа продукта. Реагенты следует распределять по одноразовым аликвотам . Следует регулярно использовать дозаторы со сменными поршнями и удлиненными наконечниками для дозаторов. Кроме того, рекомендуется обеспечить однонаправленный рабочий процесс при настройке лаборатории. Никакие материалы или реагенты, используемые в помещениях для ПЦР и анализов, никогда не следует переносить в помещение для приготовления ПЦР без тщательной дезинфекции.

Образцы окружающей среды, содержащие гуминовые кислоты, могут препятствовать амплификации ПЦР и приводить к неточным результатам.

Вариации

  • Аллель-специфическая ПЦР : метод диагностики или клонирования, основанный на однонуклеотидных вариациях (SNV не следует путать с SNP ) (различия в одном основании у пациента). Он требует предварительного знания последовательности ДНК, включая различия между аллелями , и использует праймеры, 3'-концы которых охватывают SNV (обычно включаемый буфер пары оснований вокруг SNV). ПЦР-амплификация в строгих условиях намного менее эффективна при наличии несоответствия между матрицей и праймером, поэтому успешная амплификация с помощью SNP-специфичного праймера сигнализирует о наличии специфического SNP в последовательности. См. SNP-генотипирование для получения дополнительной информации.
  • Сборочная ПЦР или полимеразная циклическая сборка (PCA) : искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем выполнения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются между смысловым и антисмысловым направлениями, а перекрывающиеся сегменты определяют порядок фрагментов ПЦР, тем самым селективно продуцируя конечный продукт длинной ДНК.
  • Асимметричная ПЦР : предпочтительно амплифицирует одну цепь ДНК в матрице двухцепочечной ДНК. Он используется при секвенировании и гибридизационном зондировании, когда требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймера для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной ( арифметической ) амплификации на более поздних этапах реакции после того, как ограничивающий праймер израсходован, требуются дополнительные циклы ПЦР. Недавняя модификация этого процесса, известная как L inear- A fter- T he- E xponential-PCR (LATE-PCR), использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления ( T m ), чем избыточный праймер, для поддержания эффективности реакции, поскольку предельная концентрация праймера снижает середину реакции.
  • Конвективная ПЦР : псевдоизотермический способ проведения ПЦР. Вместо многократного нагрева и охлаждения смеси для ПЦР раствор подвергается температурному градиенту. Возникающий в результате конвективный поток, вызванный термической нестабильностью, автоматически перетасовывает реагенты для ПЦР из горячих и холодных областей, многократно обеспечивая ПЦР. Такие параметры, как тепловые граничные условия и геометрия корпуса ПЦР, могут быть оптимизированы для обеспечения надежной и быстрой ПЦР за счет использования появления хаотических полей потока. Такая установка ПЦР с конвективным потоком значительно снижает потребляемую мощность устройства и время работы.
  • Dial-out PCR : высокопараллельный метод получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Сложная библиотека молекул ДНК модифицируется уникальными фланкирующими тегами перед массовым параллельным секвенированием. Затем праймеры, ориентированные на метки, позволяют извлекать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР.
  • Цифровая ПЦР (dPCR) : используется для измерения количества целевой последовательности ДНК в образце ДНК. Образец ДНК сильно разбавлен, поэтому после нескольких параллельных ПЦР некоторые из них не получают ни одной молекулы целевой ДНК. Концентрация целевой ДНК рассчитывается с использованием доли отрицательных результатов. Отсюда и название «цифровая ПЦР».
  • Зависимая от геликазы амплификация : похожа на традиционную ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклы денатурации и отжига / удлинения. ДНК-геликаза , фермент, раскручивающий ДНК, используется вместо тепловой денатурации.
  • ПЦР с горячим стартом : метод, который снижает неспецифическую амплификацию на начальных этапах настройки ПЦР. Это может быть выполнено вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры денатурации (например, 95 ° C) перед добавлением полимеразы. Были разработаны специализированные ферментные системы, которые ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо за счет связывания антитела, либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после стадии высокотемпературной активации. ПЦР с горячим стартом / холодным окончанием достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре элонгации.
  • In silico PCR (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) относится к вычислительным инструментам, используемым для расчета теоретических результатов полимеразной цепной реакции с использованием заданного набора праймеров ( зондов ) для амплификациипоследовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома . In silico ПЦР ​​была предложена в качестве обучающего инструмента для молекулярной биологии.
  • Intersequence-specific PCR (ISSR): метод ПЦР для снятия отпечатков пальцев ДНК, при котором амплифицируются области между простыми повторами последовательностей для получения уникального отпечатка длины амплифицированных фрагментов.
  • Обратная ПЦР : обычно используется для идентификации фланкирующих последовательностей вокруг геномных вставок. Он включает в себя серию перевариваний ДНК и самолигирование , в результате чего на любом конце неизвестной последовательностиполучаютизвестные последовательности.
  • ПЦР, опосредованная лигированием: использует небольшие линкеры ДНК, лигированные с интересующей ДНК, и несколько праймеров, отжигаемых с линкерами ДНК; он использовался для секвенирования ДНК , прогулок по геному и снятия следов ДНК .
  • ПЦР, специфичная для метилирования (MSP): разработана Стивеном Бейлином и Джеймсом Г. Херманом из Медицинской школы Джонса Хопкинса и используется для обнаружения метилирования CpG-островков в геномной ДНК. Сначала ДНК обрабатывают бисульфитом натрия, который превращает неметилированные цитозиновые основания в урацил, который распознается праймерами ПЦР как тимин. Затем проводят две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием идентичных наборов праймеров, за исключением любых CpG-островков в последовательностях праймеров. В этих точках один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для амплификации метилированной ДНК, а один набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может быть выполнено для получения количественной, а не качественной информации о метилировании.
  • Минипраймерная ПЦР : использует термостабильную полимеразу (S-Tbr), которая может происходить от коротких праймеров (smalligos) длиной от 9 до 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет нацеливать ПЦР на меньшие участки связывания праймера и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген 16S (или эукариотического 18S) рРНК.
  • Мультиплексная амплификация зонда, зависящая от лигирования ( MLPA ): позволяет амплифицировать несколько мишеней с помощью одной пары праймеров, что позволяет избежать ограничений разрешения мультиплексной ПЦР (см. Ниже).
  • Мультиплексная ПЦР : состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР для получения ампликонов различного размера, специфичных для разных последовательностей ДНК. Путем нацеливания на несколько генов одновременно можно получить дополнительную информацию из одного теста, для которого в противном случае потребовалось бы в несколько раз больше реагентов и больше времени для выполнения. Температуры отжига для каждого из наборов праймеров должны быть оптимизированы для правильной работы в рамках одной реакции, а также размеры ампликонов. То есть их длина пары оснований должна быть достаточно различной, чтобы образовывать отдельные полосы при визуализации с помощью гель-электрофореза .
  • ПЦР с использованием наночастиц (наноПЦР) : некоторые наночастицы (НЧ) могут повышать эффективность ПЦР (таким образом, называемые наноПЦР), а некоторые могут даже превосходить оригинальные усилители ПЦР. Сообщалось, что квантовые точки (КТ) могут улучшить специфичность и эффективность ПЦР. Однослойные углеродные нанотрубки (ОСУНТ) и многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) эффективны для усиления амплификации длинной ПЦР. Углеродный нанопорошок (CNP) может повысить эффективность повторной ПЦР и длительной ПЦР, в то время как оксид цинка , диоксид титана и НЧ Ag, как было обнаружено, увеличивают выход ПЦР. Предыдущие данные показали, что неметаллические НЧ сохраняют приемлемую точность амплификации. Учитывая, что многие НЧ способны повысить эффективность ПЦР, очевидно, что существует большой потенциал для усовершенствования технологии наноПЦР и разработки продуктов.
  • Вложенная ПЦР : увеличивает специфичность амплификации ДНК за счет снижения фона из-за неспецифической амплификации ДНК. Два набора праймеров используют в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для создания продуктов ДНК, которые, помимо намеченной мишени, могут еще состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Затем продукт (-ы) используют во второй ПЦР с набором праймеров, сайты связывания которых полностью или частично отличаются от каждого из праймеров, использованных в первой реакции, и расположены на 3 'от каждого из них. Вложенная ПЦР часто более успешна для специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем обычная ПЦР, но требует более детального знания целевых последовательностей.
  • ПЦР с удлинением с перекрытием или сплайсинг путем удлинения с перекрытием (SOEing) :метод генной инженерии , который используется для сращивания вместе двух или более фрагментов ДНК, содержащих комплементарные последовательности. Он используется для соединения частей ДНК, содержащих гены, регуляторные последовательности или мутации; методика позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК. Он также может вносить делеции, вставки или точечные мутации в последовательность ДНК.
  • PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может использоваться в живых клетках.
  • количественная ПЦР (кПЦР): используется для измерения количества целевой последовательности (обычно в режиме реального времени). Он количественно измеряет начальные количества ДНК, кДНК или РНК. количественная ПЦР обычно используется для определения наличия последовательности ДНК в образце и количества ее копий в образце. Количественная ПЦР имеет очень высокую точность. В количественных методах ПЦР используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, EvaGreen, илиДНК-зонды, содержащие флуорофор , такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта в режиме реального времени. Его также иногда сокращают до ОТ-ПЦР ( ПЦР в реальном времени ), но это сокращение следует использовать только для ПЦР с обратной транскрипцией . КПЦР - это подходящее сокращение для количественной ПЦР ( ПЦР в реальном времени).
  • ПЦР с обратным комплементом (RC-PCR): позволяет добавлять функциональные домены или выбранные последовательности независимо к любому концу сгенерированного ампликона в одной реакции в закрытой пробирке. Этот метод генерирует специфичные для мишени праймеры в реакции посредством взаимодействия универсальных праймеров (которые содержат желаемые последовательности или добавляемые домены) и зондов RC.
  • ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) : для амплификации ДНК из РНК. Обратная транскриптаза осуществляет обратную транскрипцию РНК в кДНК , которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется при профилировании экспрессии для определения экспрессии гена или для идентификации последовательности транскрипта РНК, включая сайты начала и окончания транскрипции. Если последовательность геномной ДНК гена известна, можно использовать ОТ-ПЦР для картирования расположения экзонов и интронов в гене. 5'-конец гена (соответствующий сайту начала транскрипции) обычно идентифицируется с помощью RACE-PCR ( быстрой амплификации концов кДНК ).
  • РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): модификация ПЦР, в которой используются праймеры с 3'-блоком удлинения, который может быть удален термостабильным ферментом РНКазой HII. Эта система уменьшает количество димеров праймеров и позволяет проводить мультиплексные реакции с большим количеством праймеров.
  • ПЦР с одним специфическим праймером (SSP-PCR): позволяет амплифицировать двухцепочечную ДНК, даже если информация о последовательности доступна только на одном конце. Этот метод позволяет амплифицировать гены, для которых доступна только частичная информация о последовательности, и позволяет однонаправленно перемещаться по геному из известных в неизвестные области хромосомы.
  • Твердофазная ПЦР : включает в себя несколько значений, включая амплификацию полонии (где колонии ПЦР получают, например, в гелевой матрице), мостиковую ПЦР (праймеры ковалентно связаны с поверхностью твердой подложки), обычную твердофазную ПЦР (где асимметричная ПЦР является наносится в присутствии праймера, несущего твердую подложку, с последовательностью, соответствующей одному из водных праймеров) и улучшенной твердофазной ПЦР (где обычная твердофазная ПЦР может быть улучшена за счет использования грунтовки с высокой Tm и вложенной твердой подложки с необязательным нанесением термической «стадии» в пользу грунтовки твердой опоры).
  • Самоубийственная ПЦР : обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где наивысшим приоритетом является предотвращение ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента. Первоначально он был описан в исследовании для проверки присутствия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, взятых из могил 14-го века людей, предположительно погибших от чумы во время средневековой эпидемии черной смерти . Метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), который никогда не должен использоваться в какой-либо положительной контрольной реакции ПЦР, и праймеры всегда должны быть нацелены на область генома, никогда ранее не амплифицированную в lab с использованием этого или любого другого набора праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет загрязняющей ДНК из предыдущих реакций ПЦР, которая в противном случае могла бы привести к ложноположительным результатам.
  • Термическая асимметричная ПЦР с чересстрочной разверткой (TAIL-PCR) : для выделения неизвестной последовательности, фланкирующей известную последовательность. В пределах известной последовательности TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с разными температурами отжига; вырожденный праймер используется для амплификации в направлении, противоположном неизвестной последовательности.
  • Touchdown PCR ( Step-down PCR ): вариант ПЦР, который направлен на снижение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере продолжения цикла ПЦР. Температура отжига на начальных циклах обычно на несколько градусов (3-5 ° C) выше T m используемых праймеров, а на более поздних циклах она на несколько градусов (3-5 ° C) ниже T праймера. м . Более высокие температуры обеспечивают большую специфичность связывания праймеров, а более низкие температуры позволяют более эффективно амплифицировать специфические продукты, образованные во время начальных циклов.
  • Универсальная быстрая ходьба : для прогулок по геному и генетического дактилоскопирования с использованием более специфической «двусторонней» ПЦР, чем традиционные «односторонние» подходы (с использованием только одного специфичного для генов праймера и одного общего праймера, что может привести к искусственному «шуму») за счет механизма формирования лариатной структуры. Оптимизированными производными UFW являются LaNe RAGE (лариат-зависимая вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), 5'RACE LaNe и 3'RACE LaNe.

История

Схематическое изображение примера пары праймеров. Использование праймеров в анализе in vitro, позволяющее синтез ДНК, было важным нововведением, которое позволило разработать ПЦР.

Термостойкие ферменты, которые являются ключевым компонентом полимеразной цепной реакции, были обнаружены в 1960-х годах как продукт микробной формы жизни, обитавшей в перегретых водах Грибного источника Йеллоустоуна .

1971 г. , в статье журнала молекулярной биологии по Kjell Клеппе и сотрудниками в лаборатории H. Gobind Khorana впервые описан способ использования ферментативного анализа , чтобы повторить короткую ДНК - матрицы с использованием праймеров в пробирке . Однако это раннее проявление основного принципа ПЦР не получило особого внимания в то время, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году обычно приписывают Кэри Маллис .

"Baby Blue", прототип машины 1986 года для проведения ПЦР.

Когда Маллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле , Калифорния, в Cetus Corporation , одной из первых биотехнологических компаний, где он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Муллис написал, что он задумал идею PCR, путешествуя по шоссе Тихоокеанского побережья однажды ночью в своей машине. Он мысленно играл с новым способом анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда он понял, что вместо этого он изобрел метод амплификации любой области ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, управляемой ДНК-полимеразой. В журнале Scientific American Муллис резюмировал процедуру: «Начиная с одной молекулы ДНК генетического материала, ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за полдень. Реакцию легко выполнить. Для этого требуется не более чем пробирка. несколько простых реагентов и источник тепла ». Снятие отпечатков пальцев ДНК было впервые использовано для проверки отцовства в 1988 году.

Маллис считал использование ЛСД неотъемлемой частью его разработки ПЦР: «Изобрел бы я ПЦР, если бы я не принимал ЛСД? Я серьезно сомневаюсь в этом. Я мог бы сидеть на молекуле ДНК и смотреть, как проходят полимеры. Я узнал это частично из-за психоделических препаратов ".

Муллис и профессор Майкл Смит , разработавшие другие важные способы манипулирования ДНК, были совместно удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году, через семь лет после того, как Маллис и его коллеги из Cetus впервые реализовали свое предложение на практике. Работа Маллиса 1985 года с Р.К. Сайки и Х.А. Эрлихом «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» - изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) - была удостоена награды Citation for Chemical Breakthrough от Отдел истории химии Американского химического общества в 2017 году.

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы, способной выдерживать высокие температуры> 90 ° C (194 ° F), необходимые для разделения двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации . ДНК-полимеразы, первоначально использованные для экспериментов in vitro перед ПЦР, не выдерживали этих высоких температур. Таким образом, ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективными и трудоемкими, требовали большого количества ДНК-полимеразы и непрерывной обработки на протяжении всего процесса.

Открытие в 1976 году Taq полимеразы -a ДНК - полимеразы очищали из термофильных бактерий , Thermus адиайсиза , что , естественно , живет в горячем ( от 50 до 80 ° C (122 до 176 ° F)) , сред , таких как горячие источники, открыл путь к драматическому улучшения метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из T. aquaticus , стабильна при высоких температурах, оставаясь активной даже после денатурации ДНК, что устраняет необходимость добавления новой ДНК-полимеразы после каждого цикла. Это позволило автоматизировать процесс амплификации ДНК на основе термоциклера.

Патентные споры

Метод ПЦР был запатентован Кэри Маллис и передан Cetus Corporation , где Маллис работал, когда изобрел метод в 1983 году. Фермент полимераза Taq также был защищен патентами. Было несколько громких судебных процессов, связанных с этой техникой, в том числе безуспешный судебный процесс, поданный DuPont . Швейцарская фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году и в настоящее время владеет теми, которые все еще защищены.

Связанная с этим патентная битва за фермент полимеразу Taq все еще продолжается в нескольких юрисдикциях по всему миру между компаниями Roche и Promega . Юридические аргументы вышли за рамки срока действия оригинальных патентов на ПЦР и Taq- полимеразу, срок действия которых истек 28 марта 2005 г.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки