Спектроскопия белков ядерного магнитного резонанса. Nuclear magnetic resonance spectroscopy of proteins

Ядерно-магнитная резонансная спектроскопия белков (обычно сокращенно белковый ЯМР ) - это область структурной биологии, в которой ЯМР-спектроскопия используется для получения информации о структуре и динамике белков , а также нуклеиновых кислот и их комплексов. Пионерами в этой области стали Ричард Р. Эрнст и Курт Вютрих из ETH , а также Эд Бакс , Мариус Клор , Анджела Гроненборн из NIH , Герхард Вагнер из Гарвардского университета и другие. Определение структуры методом ЯМР-спектроскопии обычно состоит из нескольких этапов, для каждой из которых используется отдельный набор узкоспециализированных методов. Подготавливается образец, проводятся измерения, применяются интерпретирующие подходы, рассчитывается и проверяется структура.

ЯМР включает квантово-механические свойства центрального ядра (« ядра ») атома. Эти свойства зависят от локального молекулярного окружения, и их измерение дает карту того, как атомы связаны химически, насколько близко они находятся в пространстве и как быстро они движутся относительно друг друга. Эти свойства в основном те же, что и те, которые используются в более знакомой магнитно-резонансной томографии (МРТ) , но в молекулярных приложениях используется несколько иной подход, соответствующий изменению масштаба от миллиметров (интересующих радиологов) до нанометров (связанные атомы обычно доли нанометра друг от друга), в миллион раз. Это изменение масштаба требует гораздо более высокой чувствительности обнаружения и стабильности для долгосрочных измерений. В отличие от МРТ, исследования структурной биологии не создают изображение напрямую, а полагаются на сложные компьютерные вычисления для создания трехмерных молекулярных моделей.

В настоящее время большинство образцов исследуются в растворе в воде, но разрабатываются методы, позволяющие также работать с твердыми образцами . Сбор данных основан на помещении образца внутри мощного магнита, посылке радиочастотных сигналов через образец и измерении поглощения этих сигналов. В зависимости от окружения атомов в белке ядра отдельных атомов будут поглощать различные частоты радиосигналов. Кроме того, сигналы поглощения различных ядер могут нарушаться соседними ядрами. Эта информация может быть использована для определения расстояния между ядрами. Эти расстояния, в свою очередь, можно использовать для определения общей структуры белка.

Типичное исследование может включать в себя то, как два белка взаимодействуют друг с другом, возможно, с целью разработки небольших молекул, которые можно использовать для исследования нормальной биологии взаимодействия (« химическая биология ») или для обеспечения возможных результатов для фармацевтического использования ( разработка лекарств ). Часто взаимодействующая пара белков может быть идентифицирована исследованиями генетики человека, что указывает на то, что взаимодействие может быть нарушено неблагоприятными мутациями, или они могут играть ключевую роль в нормальной биологии «модельного» организма, такого как плодовая муха, дрожжи. , червь C. elegans или мыши. Для приготовления образца обычно используются методы молекулярной биологии для получения количеств путем бактериальной ферментации . Это также позволяет изменять изотопный состав молекулы, что желательно, поскольку изотопы ведут себя по-разному и предоставляют методы для идентификации перекрывающихся сигналов ЯМР.

Базовые приготовления

Образец ЯМР готовят в тонкостенной стеклянной трубке .

Ядерный магнитный резонанс белка выполняется на водных образцах высокоочищенного белка. Обычно образец состоит из 300-600 микролитров с концентрацией белка в диапазоне 0,1 - 3 миллимолярных . Источник белка может быть либо естественным, либо произведенным в производственной системе с использованием методов рекомбинантной ДНК посредством генной инженерии . Рекомбинантно экспрессируемые белки обычно легче продуцировать в достаточном количестве, и этот метод делает возможным изотопное мечение .

Очищенный белок обычно растворяют в буферном растворе и доводят до желаемых условий растворителя. Образец ЯМР готовят в тонкостенной стеклянной трубке .

Сбор данных

ЯМР белков использует эксперименты с многомерным ядерным магнитным резонансом для получения информации о белке. В идеале каждое отдельное ядро ​​в молекуле испытывает различное электронное окружение и, таким образом, имеет отчетливый химический сдвиг, по которому его можно распознать. Однако в больших молекулах, таких как белки, количество резонансов обычно может достигать нескольких тысяч, и одномерный спектр неизбежно имеет случайные перекрытия. Поэтому проводятся многомерные эксперименты, которые коррелируют частоты отдельных ядер. Дополнительные измерения уменьшают вероятность перекрытия и имеют большее информационное содержание, поскольку они коррелируют сигналы от ядер в определенной части молекулы. Намагничивание передается в образец с помощью импульсов электромагнитной ( радиочастотной ) энергии и между ядрами с помощью задержек; процесс описывается так называемыми импульсными последовательностями . Последовательности импульсов позволяют экспериментатору исследовать и выбирать определенные типы связей между ядрами. Множество экспериментов по ядерному магнитному резонансу, используемых с белками, делятся на две основные категории: в одной намагниченность передается через химические связи, а во вторую - через пространство, независимо от структуры связывания. Первая категория используется для присвоения различных химических сдвигов конкретному ядру, а вторая в основном используется для создания ограничений расстояния, используемых при вычислении структуры и при назначении с немеченым белком.

В зависимости от концентрации образца, магнитного поля спектрометра и типа эксперимента, один эксперимент с многомерным ядерным магнитным резонансом на образце белка может занять часы или даже несколько дней для получения подходящего отношения сигнал / шум. посредством усреднения сигнала и для обеспечения достаточной эволюции передачи намагниченности в различных измерениях эксперимента. При прочих равных условиях эксперименты с более высокой размерностью займут больше времени, чем эксперименты с более низкой размерностью.

Обычно первый эксперимент, который должен быть измерен с меченным изотопом белком, представляет собой 2D- спектр гетероядерной одноканальной квантовой корреляции (HSQC), где «гетероядерный» относится к ядрам, отличным от 1H. Теоретически гетероядерная одноквантовая корреляция имеет один пик для каждого H, связанного с гетероядром. Таким образом, в 15N-HSQC с 15 N меченым белком ожидается один сигнал для каждого атома азота в позвоночнике, за исключением пролина , который не имеет амид-водород из-за циклической природы его основной цепи. Дополнительные сигналы 15N-HSQC вносятся каждым остатком с азотно-водородной связью в его боковой цепи (W, N, Q, R, H, K). 15N-HSQC часто называют «отпечатком пальца» белка, потому что каждый белок имеет уникальный паттерн сигнальных положений. Анализ 15N-HSQC позволяет исследователям оценить, присутствует ли ожидаемое количество пиков, и, таким образом, выявить возможные проблемы из-за множественных конформаций или неоднородности образца. Относительно быстрый эксперимент с одноквантовой гетероядерной корреляцией помогает определить возможность проведения последующих более длительных, более дорогих и сложных экспериментов. Невозможно приписать пики конкретным атомам только на основе одноканальной гетероядерной корреляции.

Назначение резонанса

Для анализа данных ядерного магнитного резонанса важно получить резонансное назначение для белка, то есть выяснить, какой химический сдвиг соответствует какому атому. Обычно это достигается последовательной ходьбой с использованием информации, полученной в результате нескольких различных типов экспериментов ЯМР. Точная процедура зависит от того, помечен ли белок изотопами или нет, поскольку многие эксперименты по назначению зависят от углерода-13 и азота-15.

Сравнение спектров COSY и TOCSY 2D для такой аминокислоты, как глутамат или метионин . TOCSY показывает диагональные кросс-пики между всеми протонами в спектре, но CZY имеет кросс-пики только между соседями.

Гомоядерный ядерный магнитный резонанс

С немеченым белком обычная процедура заключается в регистрации набора двумерных гомоядерных экспериментов по ядерному магнитному резонансу с помощью корреляционной спектроскопии (COSY), из которых несколько типов включают обычную корреляционную спектроскопию, полную корреляционную спектроскопию (TOCSY) и ядерную спектроскопию эффекта Оверхаузера (NOESY). . Двумерный ядерный магнитный резонанс дает двумерный спектр. Единицами обеих осей являются химические сдвиги. COSY и TOCSY передают намагниченность через химические связи между соседними протонами. Традиционный эксперимент корреляционной спектроскопии способен передавать намагниченность только между протонами на соседних атомах, тогда как в эксперименте полной корреляционной спектроскопии протоны могут передавать намагниченность, поэтому она передается между всеми протонами, которые связаны соседними атомами. Таким образом, в обычной корреляционной спектроскопии альфа-протон передает намагниченность бета-протонам, бета-протоны передаются альфа- и гамма-протонам, если таковые имеются, затем гамма-протон передается бета- и дельта-протонам, и процесс продолжается. . В полной корреляционной спектроскопии альфа и все другие протоны способны передавать намагниченность в бета, гамма, дельта, эпсилон, если они связаны непрерывной цепочкой протонов. Непрерывная цепь протонов является боковой цепью отдельных аминокислот . Таким образом, эти два эксперимента используются для построения так называемых спиновых систем, то есть построения списка резонансов химического сдвига пептидного протона, альфа-протонов и всех протонов из боковой цепи каждого остатка . Какие химические сдвиги соответствуют каким ядрам в спиновой системе, определяется обычными связями корреляционной спектроскопии и тем фактом, что разные типы протонов имеют характерные химические сдвиги. Чтобы соединить различные спиновые системы в последовательном порядке, необходимо использовать эксперимент ядерной спектроскопии эффекта Оверхаузера. Поскольку этот эксперимент передает намагниченность через пространство, он покажет кросс-пики для всех протонов, находящихся близко в пространстве, независимо от того, находятся они в одной спиновой системе или нет. Соседние остатки по своей природе близки в пространстве, поэтому отнесения могут быть сделаны по пикам в NOESY с другими спиновыми системами.

Одной из важных проблем использования гомоядерного ядерного магнитного резонанса является перекрытие пиков. Это происходит, когда разные протоны имеют одинаковые или очень похожие химические сдвиги. Эта проблема усугубляется по мере того, как белок становится больше, поэтому гомоядерный ядерный магнитный резонанс обычно ограничивается небольшими белками или пептидами.

Ядерный магнитный резонанс Азот-15

Наиболее часто выполняемый эксперимент 15N - это 1 H- 15 N HSQC. Эксперимент очень чувствителен и поэтому может быть проведен относительно быстро. Его часто используют для проверки пригодности белка для определения структуры с помощью ЯМР, а также для оптимизации условий образца. Это один из стандартных наборов экспериментов, используемых для определения структуры раствора белка. HSQC можно расширить до трехмерных и четырехмерных ЯМР-экспериментов, таких как 15 N-TOCSY-HSQC и 15 N-NOESY-HSQC.

Схема HNCA и HNCOCA для четырех последовательных остатков. Размер азота-15 перпендикулярен экрану. Каждое окно сфокусировано на химическом сдвиге азота этой аминокислоты. Последовательное присвоение осуществляется путем сопоставления химических сдвигов альфа-углерода. В HNCA каждый остаток видит свой альфа-углерод и предыдущий остаток. HNCOCA видит только альфа-углерод предыдущего остатка.

Ядерный магнитный резонанс углерода-13 и азота-15

Когда белок помечен углеродом-13 и азотом-15, можно записывать эксперименты с тройным резонансом, которые переносят намагниченность по пептидной связи и, таким образом, соединяют различные спиновые системы через связи. Обычно это делается с помощью следующих экспериментов: HNCO , HN (CA) CO }, HNCA , HN (CO) CA , HNCACB и CBCA (CO) NH . Все шесть экспериментов состоят из плоскости 1 H- 15 N (подобной спектру HSQC), расширенной размером углерода. В HN (CA) CO каждая плоскость H N содержит пики карбонильного углерода от его остатка, а также предыдущий в последовательности. HNCO содержит карбонильную углерода химический сдвиг от предыдущего только остатка, но гораздо более чувствителен , чем HN (CA) CO . Эти эксперименты позволяют связать каждый пик 1 H- 15 N с предыдущим карбонильным углеродом, и затем можно выполнить последовательное сопоставление путем сопоставления сдвигов каждого собственного и предыдущего атомов углерода спиновой системы. HNCA и HN (СО) СА работает аналогично, только с альфа - углеродов (C α ) , а не карбонилов, а HNCACB и КАУК (СО) NH содержит как альфа - углерод и бета - углерод (С β ). Обычно требуется несколько из этих экспериментов, чтобы разрешить перекрытие в углеродном измерении. Эта процедура обычно менее двусмысленна, чем метод на основе NOESY, поскольку он основан на переводе облигаций. В методах, основанных на NOESY, появятся дополнительные пики, соответствующие атомам, которые расположены близко в пространстве, но не принадлежат последовательным остаткам, что затрудняет процесс присвоения. После первоначального последовательного назначения резонанса обычно можно расширить назначение от C α и C β до остальной части боковой цепи, используя такие эксперименты, как HCCH-TOCSY, который в основном является экспериментом TOCSY, разрешенным в дополнительном углеродном измерении.

Поколение сдержанности

Для проведения расчетов конструкции необходимо создать ряд экспериментально определенных ограничений. Они попадают в разные категории; наиболее широко используются ограничения расстояния и ограничения угла.

Ограничения расстояния

Перекрестный пик в эксперименте NOESY означает пространственную близость между двумя рассматриваемыми ядрами. Таким образом, каждый пик может быть преобразован в максимальное расстояние между ядрами, обычно от 1,8 до 6 ангстрем . Интенсивность пика NOESY пропорциональна расстоянию до минус 6-й степени, поэтому расстояние определяется в соответствии с интенсивностью пика. Отношение интенсивности к расстоянию не является точным, поэтому обычно используется диапазон расстояний.

Очень важно отнести пики NOESY к правильным ядрам на основе химических сдвигов. Если эта задача выполняется вручную, это обычно очень трудоемко, поскольку белки обычно имеют тысячи пиков NOESY. Некоторые компьютерные программы, такие как PASD / XPLOR-NIH , UNIO , CYANA , ARIA / CNS и AUDANA / PONDEROSA-C / S на платформе Integrative ЯМР, выполняют эту задачу автоматически на предварительно обработанных вручную списках положений пиков и объемов пиков, связанных к расчету конструкции. Прямой доступ к необработанным данным NOESY без громоздкой потребности в итеративно уточняемых списках пиков пока предоставляется только алгоритмом PASD, реализованным в XPLOR-NIH , подходом ATNOS / CANDID, реализованным в программном пакете UNIO, и PONDEROSA-C / S. и, таким образом, действительно гарантирует объективный и эффективный спектральный анализ NOESY.

Чтобы получить как можно более точные отнесения, большое преимущество имеет доступ к экспериментам NOESY с углеродом-13 и азотом-15, поскольку они помогают устранить перекрытие в протонном измерении. Это приводит к более быстрым и надежным заданиям и, в свою очередь, к лучшим структурам.

Угловые ограничения

В дополнение к ограничению расстояния могут быть созданы ограничения на торсионные углы химических связей, обычно это углы psi и phi . Один из подходов заключается в использовании уравнения Карплюса для создания угловых ограничений на основе констант связи . Другой подход использует химические сдвиги для создания угловых ограничений. Оба метода используют тот факт, что геометрия вокруг альфа-углерода влияет на константы связи и химические сдвиги, поэтому, учитывая константы связи или химические сдвиги, можно сделать квалифицированное предположение о торсионных углах.

Ограничения ориентации

Синие стрелки представляют ориентацию связи N - H выбранных пептидных связей. Определив ориентацию достаточного количества связей относительно внешнего магнитного поля, можно определить структуру белка. Из записи PDB 1KBH

Молекулы аналита в образце можно частично упорядочить по отношению к внешнему магнитному полю спектрометра, манипулируя условиями образца. Общие методы включают добавление бактериофагов или бицелл к образцу или приготовление образца в растянутом полиакриламидном геле . Это создает локальную среду, которая способствует определенной ориентации несферических молекул. Обычно в растворе ЯМР диполярные связи между ядрами усредняются из-за быстрого переворачивания молекулы. Небольшое перенаселенность одной ориентации означает, что остаточная диполярная связь еще предстоит наблюдать. Диполярная связь обычно используется в твердотельном ЯМР и предоставляет информацию об относительной ориентации векторов связей относительно единой глобальной системы отсчета. Обычно ориентацию вектора NH исследуют в эксперименте, подобном HSQC. Первоначально остаточные диполярные связи использовались для уточнения ранее определенных структур, но также были предприняты попытки определения структуры de novo.

Водородно-дейтериевый обмен

ЯМР-спектроскопия специфична для ядра. Таким образом, он может различать водород и дейтерий. Протоны амида в белке легко обмениваются с растворителем, и, если растворитель содержит другой изотоп, обычно дейтерий , реакцию можно контролировать с помощью ЯМР-спектроскопии. Насколько быстро данный амид обменивается, отражает его доступность для растворителя. Таким образом, скорости обмена амида могут дать информацию о том, какие части белка погребены, связаны водородными связями и т. Д. Обычным применением является сравнение обмена свободной формы с комплексной. Предполагается, что амиды, которые становятся защищенными в комплексе, находятся в интерфейсе взаимодействия.

Расчет конструкции

Определение структуры ядерного магнитного резонанса порождает ансамбль структур. Структуры будут сходиться только в том случае, если данных достаточно, чтобы определить конкретную складку. В этих конструкциях это касается только части конструкции. Из записи PDB 1SSU .

Экспериментально определенные ограничения могут использоваться в качестве входных данных для процесса расчета конструкции. Исследователи, используя компьютерные программы, такие как XPLOR-NIH , CYANA или GeNMR, пытаются удовлетворить как можно больше ограничений в дополнение к общим свойствам белков, таким как длина связей и углы. Алгоритмы преобразуют ограничения и общие свойства белка в энергетические термины, а затем пытаются минимизировать эту энергию. Результатом процесса является ансамбль структур, которые, если бы данных было достаточно, чтобы определять определенную складку, сходились.

Проверка структуры

Важно отметить, что полученный ансамбль структур является «экспериментальной моделью», т. Е. Представлением определенного вида экспериментальных данных. Признание этого факта действительно важно, потому что это означает, что модель может быть хорошим или плохим представлением этих экспериментальных данных. В общем, качество модели будет зависеть как от количества и качества экспериментальных данных, используемых для ее создания, так и от правильной интерпретации таких данных.

Важно помнить, что с каждым экспериментом связаны ошибки. Случайные ошибки повлияют на воспроизводимость и точность полученных структур. Если ошибки систематические, это повлияет на точность модели. Прецизионность указывает на степень воспроизводимости измерения и часто выражается как дисперсия набора измеренных данных при одинаковых условиях. Однако точность указывает степень приближения измерения к своему «истинному» значению.

В идеале модель белка будет тем точнее, чем больше соответствует действительная молекула, которая представляет, и будет более точной, поскольку меньше неопределенности относительно положения их атомов. На практике не существует «стандартной молекулы», с которой можно было бы сравнивать модели белков, поэтому точность модели определяется степенью согласия между моделью и набором экспериментальных данных. Исторически структуры, определенные с помощью ЯМР, были, как правило, более низкого качества, чем структуры, определенные с помощью дифракции рентгеновских лучей. Частично это связано с меньшим количеством информации, содержащейся в данных, полученных с помощью ЯМР. Из-за этого факта стало обычной практикой определять качество ансамблей ЯМР, сравнивая его с уникальной конформацией, определенной с помощью дифракции рентгеновских лучей, для того же белка. Однако структура дифракции рентгеновских лучей может не существовать, и, поскольку белки в растворе являются гибкими молекулами, белок, представленный единственной структурой, может привести к недооценке внутренней вариации атомных положений белка. Набор конформаций, определенный с помощью ЯМР или рентгеновской кристаллографии, может быть лучшим представлением экспериментальных данных белка, чем уникальная конформация.

Полезность модели будет определяться, по крайней мере частично, степенью точности и точности модели. Точная модель с относительно низкой точностью может быть полезна для изучения эволюционных взаимосвязей между структурами набора белков, в то время как рациональный дизайн лекарств требует как точных, так и точных моделей. Модель, которая не является точной, независимо от степени точности, с которой она была получена, не будет очень полезной.

Поскольку белковые структуры представляют собой экспериментальные модели, которые могут содержать ошибки, очень важно уметь обнаруживать эти ошибки. Процесс, направленный на обнаружение ошибок, известен как проверка. Существует несколько методов проверки структур, некоторые из которых являются статистическими, например PROCHECK и WHAT IF, в то время как другие основаны на физических принципах, таких как CheShift , или на смеси статистических и физических принципов PSVS .

Динамика

Помимо структур, ядерный магнитный резонанс может дать информацию о динамике различных частей белка . Обычно это включает измерение времен релаксации, таких как T 1 и T 2, для определения параметров порядка, времен корреляции и скоростей химического обмена. ЯМР-релаксация является следствием локальных флуктуирующих магнитных полей внутри молекулы. Локальные флуктуирующие магнитные поля создаются движением молекул. Таким образом, измерения времен релаксации могут предоставить информацию о движениях внутри молекулы на атомном уровне. В ЯМР-исследованиях динамики белков изотоп азота-15 является предпочтительным ядром для изучения, потому что его времена релаксации относительно просто соотнести с молекулярными движениями. Однако это требует изотопного мечения белка. Времена релаксации T 1 и T 2 могут быть измерены с помощью различных типов экспериментов на основе HSQC . Типы движений, которые могут быть обнаружены, - это движения, которые происходят во времени в диапазоне от примерно 10 пикосекунд до примерно 10 наносекунд. Кроме того, можно изучать более медленные движения, которые имеют место в масштабе времени от 10 микросекунд до 100 миллисекунд. Однако, поскольку атомы азота находятся в основном в основе белка, результаты в основном отражают движения основы, которая является наиболее жесткой частью молекулы белка. Таким образом, результаты, полученные из измерений релаксации азота-15, могут не отражать весь белок. Поэтому недавно были разработаны методы, использующие измерения релаксации углерода-13 и дейтерия , которые позволяют систематически изучать движения боковых цепей аминокислот в белках. Сложный и частный случай изучения динамики и гибкости пептидов и полноразмерных белков представлен неупорядоченными структурами. В настоящее время принято считать, что белки могут проявлять более гибкое поведение, известное как беспорядок или отсутствие структуры; однако можно описать ансамбль структур вместо статической картины, представляющей полностью функциональное состояние белка. Многие достижения представлены в этой области, в частности, с точки зрения новых импульсных последовательностей, технологических усовершенствований и тщательной подготовки исследователей в этой области.

ЯМР-спектроскопия на больших белках

Традиционно спектроскопия ядерного магнитного резонанса ограничивалась относительно небольшими белками или белковыми доменами. Это частично вызвано проблемами с разрешением перекрывающихся пиков в более крупных белках, но это было облегчено введением изотопного мечения и многомерными экспериментами. Еще одна более серьезная проблема заключается в том, что в больших белках намагниченность релаксирует быстрее, а это означает, что у вас меньше времени для обнаружения сигнала. Это, в свою очередь, приводит к тому, что пики становятся шире и слабее и в конечном итоге исчезают. Были введены два метода ослабления релаксации: спектроскопия, оптимизированная для поперечной релаксации (TROSY) и дейтерирование белков. С помощью этих методов стало возможным изучать белки в комплексе с шапероном 900 кДа GroES - GroEL .

Автоматизация процесса

Определение структуры с помощью ЯМР традиционно было трудоемким процессом, требующим интерактивного анализа данных высококвалифицированным ученым. Был проявлен значительный интерес к автоматизации процесса, чтобы увеличить скорость определения структуры и сделать ЯМР белков доступным для неспециалистов (см. Структурную геномику ). Двумя наиболее трудоемкими процессами являются назначение резонанса для конкретной последовательности (назначение основной и боковой цепи) и задачи назначения NOE. Было опубликовано несколько различных компьютерных программ, которые нацелены на отдельные части общего процесса определения структуры ЯМР в автоматическом режиме. Наибольший прогресс был достигнут в задаче автоматического присвоения NOE. До сих пор были предложены только подходы FLYA и UNIO для выполнения всего процесса определения структуры ЯМР белка в автоматическом режиме без какого-либо вмешательства человека. В последнее время модули в NMRFAM-SPARKY, такие как APES (двухбуквенный код: ae), I-PINE / PINE-SPARKY (двухбуквенный код: ep; веб-сервер I-PINE ) и PONDEROSA (двухбуквенный- code: c3, up; веб-сервер PONDEROSA ) интегрированы таким образом, что обеспечивает полную автоматизацию с возможностью визуальной проверки на каждом этапе. Также были предприняты усилия по стандартизации протокола расчета конструкции, чтобы сделать его более быстрым и поддающимся автоматизации.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки