Мышиные модели метастазов рака груди - Mouse models of breast cancer metastasis

Мышиные модели с метастазами рака молочной железы представляют собой экспериментальные подходы, в которых мышей генетически манипулируют для развития опухоли молочной железы, приводящей к удаленным очаговым поражениям эпителия молочной железы, создаваемым метастазами . Рак молочной железы у мышей может быть вызван генетическими мутациями , обнаруженными при раке человека. Это означает, что модели могут быть созданы на основе молекулярных повреждений, соответствующих заболеванию человека.

Метастазы рака груди

Метастазирование представляет собой процесс миграции из опухолевых клеток от участка первичного рака в отдаленное место , где раковые клетки образуют вторичные опухоли. Метастатический рак молочной железы представляет собой наиболее разрушительный признак рака и считается заболеванием на поздней стадии. Рак груди человека метастазирует во множество отдаленных органов, таких как мозг , легкие , кости и печень .

Генетическое разнообразие между первичной и метастатической опухолью

Классическая теория, разработанная в начале 70-х годов, предполагала, что метастазирование происходит из-за генетически детерминированных субпопуляций в первичных опухолях. Генетическая дисперсия между метастатическими очагами значима только для определенного локуса и в пределах определенных клеточных популяций, или только одноклеточная популяция показывает различия, а некоторые локусы расходятся только в одной клеточной субпопуляции. Это объясняет концепцию гетерогенности опухоли и порядок генетических событий во время эволюции опухоли . Многие из генов, управляющих ростом на первичном участке, могут определять распространение и колонизацию на эктопическом участке . Рак молочной железы считается генетически и клинически гетерогенным заболеванием, поскольку он отражает гетерогенность нормальной ткани молочной железы по своему происхождению17873350. Должен произойти ряд дискретных генетических событий, чтобы дать возможность отдельным опухолевым клеткам, которые обладают способностью расти на эктопическом участке. Прогрессирование метастазов зависит от регулирования программ развития и событий окружающей среды. Метастатический потенциал субпопуляций в клетках молочных желез мышей теперь рассматривается как относительно раннее событие, и распространение происходит одновременно с преинвазивными или микроинвазивными поражениями. Генетические профили первичных и метастатических поражений в карциномах молочной железы показывают большую степень клональной принадлежности между поражениями. Существуют различные закономерности распространенности генетических мутаций в геномах первичной опухоли молочной железы и ее метастазов. Это также подтверждает генетическую гетерогенность между первичным новообразованием больных раком груди и соответствующими метастазами.

Гены, участвующие в органоспецифических метастазах

Рак молочной железы фенотипы периодически выражают гены в метастазе, которые необходимы для метастатического процесса. Метастатическое разнообразие опосредуется активацией генов, которые действуют как сцепление с органо-специфическим ростом. Рост поражений на эктопическом участке зависит от множества сложных взаимодействий между метастатическими клетками и гомеостатическими механизмами хозяина . Летальные белок-белковые взаимодействия в месте метастазирования помогают выжить адаптированным клеткам.

Создание мышиных моделей рака груди

Направленная экспрессия онкогенов в эпителиальных клетках молочной железы мышей является способом моделирования рака молочной железы человека. Мутация или сверхэкспрессия онкогенов может контролироваться экспрессией в очень специфическом клеточном контексте, а не во всем организме. Другой способ моделирования рака груди человека - целевое ингибирование гена-супрессора опухоли.

Мыши в генетических исследованиях

Человек и мышь: геномное сравнение

Генетические исследования распространенных заболеваний человека имеют значительные ограничения по практическим и этическим причинам. Линии клеток человека можно использовать для моделирования болезни, но сложно изучать процессы на тканевом уровне, внутри органа или во всем теле. Мыши могут быть хорошим представителем болезней человека, потому что:

  • У мышей и людей есть много общего в физиологии , развитии и клеточной биологии.
  • У людей и мышей около 30 000 генов, кодирующих белок. Количество генов мыши без соответствующего человеческого гомолога составляет менее 1%.
  • 90% геномов человека и мыши синтеничны .
  • 40% геномов человека и мыши можно выровнять на уровне нуклеотидов .
  • У мышей относительно короткий период беременности .
  • Мышам требуется короткое время, чтобы достичь половой зрелости.
  • У мышей большие размеры помета.
  • Наличие сотен мутаций, затрагивающих практически все ткани и аспекты развития.

Мыши не могут быть идеальной моделью для рака груди. В основном это связано с отсутствием точности во многих моделях. Глядя на метастаз, трудно определить точное местоположение, а также частоту его появления. Другая проблема связана с подтипами эпителия и неспособностью целенаправленно воздействовать на них при нацеливании на мутацию. Примером этого может быть определение развития опухолей у мышей K14-Cre BRCA2. В стандартном случае иссечение BRCA2 не приводило к опухолевому генезу, но если р53 был мутирован и инактивирован, то опухольгенез возник бы. Следовательно, нет однозначного ответа относительно происхождения опухоли из-за дополнительной мутации в p53.

Клеточные линии метастатической карциномы молочной железы мыши

Различные клеточные линии карциномы молочной железы мыши, такие как 4T1 и TS / A , являются метастатическими у сингенных иммунокомпетентных мышей и могут использоваться для идентификации генов и путей, участвующих в метастатическом процессе.

Простые модели трансплантации опухолей

Трансплантация опухолевых клеток мышам с иммунодефицитом - это инструмент для изучения рака груди и его метастатических эффектов. Трансплантация происходит в виде аллотрансплантатов или ксенографических трансплантатов. Как правило, человеческие клетки высевали в иммунодефицитном мышином реципиенте. Инокуляция клеток с помощью внутрипротоковых трансплантаций, инъекций очищенных жировых отложений молочных желез или путем трансплантации в хвостовую вену. Различные органы могут быть засеяны клетками рака груди в зависимости от пути введения.

  • Сердечная инъекция: кость
  • Инъекция в хвостовую вену: легкое
  • Инъекция в селезенку: печень
  • Инъекция сонной артерии: мозг

Модели трансплантата опухолевой ткани

В качестве мышей со специфическим иммунодефицитом использовались мыши NOD / SCID (диабет без ожирения / тяжелый условный иммунодефицит). Эти мутации позволяют интегрировать новую ткань ксенотрансплантата. Мыши сначала должны гуманизировать жировые подушечки молочной железы путем инъекции иммортализованных телеморазой человека стромальных фибробластов молочной железы человека (фибробласты RMF / EG) в жировые подушечки молочных желез. Без этой инъекции эпителиальные клетки молочной железы человека, привитые к подушечке, не могут колонизировать и расти. Затем необходимо облучить фибробласт RMF / EG, чтобы обеспечить экспрессию ключевых белков и факторов роста. После 4 недель развития недавно привитые эпителиальные клетки молочной железы человека увеличивались в жировой подушке.

Генно-инженерные мыши для изучения метастазов

Генно-инженерные мыши созданы для моделирования фенотипов и патологий человека . Мутантные мыши могут включать трансгены с использованием различных способов доставки:

Трансгенные мышиные модели рака груди

Мыши, претерпевающие процесс трансгенеза, известны как трансгенные мыши. Основной трансген имеет промоторную область, последовательность, кодирующую белок, интрон и стоп-кодон . Вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV) - это ретро-вирус, который, как известно, вызывает опухоли молочной железы после активации. MMTV - это наследственный соматический мутаген, диапазон мишеней которого ограничен. Он содержит регуляторную последовательность ДНК, называемую длинным концевым повтором (LTR), которая способствует транскрипции, индуцируемой стероидными гормонами. Опухоль, индуцированная вирусом опухоли молочной железы мыши, также может быть осуществлена ​​путем интеграции вирусного генома. Известно, что сайты интеграции являются критическими генами для клеточной регуляции. Кислый белок молочной сыворотки (WAP) - еще один распространенный промотор, используемый для создания моделей рака молочной железы у мышей. Список других промоторов, специфичных для молочных желез, и моделей мышей см.

Схематическое изображение моделей исследования метастазов рака молочной железы

ММТВ-ПыМТ

MMTV-PyMT представляет собой модель метастазирования рака молочной железы, в которой MMTV-LTR используется для управления экспрессией среднего Т-антигена полиомавируса, специфичного для молочной железы , что приводит к быстрому развитию высокометастатических опухолей. MMTV-PyMT - наиболее часто используемая модель для изучения прогрессирования и метастазирования опухоли молочной железы. Затем мышей MMTV-PyMT скрещивают с другими генетически модифицированными мышами для создания различных типов моделей рака груди, включая:

MMTV- HER2 / neu

MMTV-LTR может также использоваться для стимулирования рецепторной тирозин-протеинкиназы ErbB2 для трансформации эпителия молочной железы мыши. ErbB2 - это онкоген, усиленный и сверхэкспрессируемый примерно в 20% случаев рака груди у человека. У мышей, несущих этот онкоген, примерно через 15 недель после беременности развиваются мультифокальные аденокарциномы с метастазами в легких. Чтобы создать более точное представление о мутациях гена HER2, исследователи объединили ген мыши, содержащий neu, и ген крысы, содержащий neu. Это решает проблему с точки зрения моделирования амплификации HER2 в развитии мышей. У неслитых мышей молочная железа вернется к почти девственной форме, но с этим добавлением молочная железа сохранит развитую функцию.

Би-трансгенные модели

Мышиные модели, содержащие два трансгена, называются би-трансгенными. Чтобы проверить взаимодействие двух онкогенов, Тим Стеверт и его группа создали первые би-трансгенные модели мышей в 1987 году, мышей MMTV- Myc и MMTV- Ras скрестили, что привело к ускорению онкогенеза. Экспрессия TGFβ в клетках рака груди MMTV-ErbB2; Двойные трансгенные мыши MMTV-TGFβ могут индуцировать более высокие уровни циркулирующих опухолевых клеток и метастазирование в легкие. Ген Ras можно комбинировать с rtTA (обратный трансактиватор тетрациклина) для создания би-трансгенной индуцибельной модели мыши с помощью транскрипционной активации, контролируемой тетрациклином, например, мыши, несущие TetO-KrasG12D (TOR) и MMTV-rtTA (MTB), имеют трансген, экспрессирующий обратный трансактиватор тетрациклина (rtTA) в эпителиальных клетках молочной железы.

Три-трансгенные модели

Три-трансгенные мышиные модели состоят из более чем двух генов. Множественные комбинации и генетические модификации выполняются таким образом, что один или все гены переводятся в состояние непрерывной экспрессии или контролируемым образом, чтобы активировать их в разные моменты времени. Например, ТОМ (TetO-myc); ТЗ; Мыши MTB, у которых гены myc (M) и ras (R) находятся под контролем операторов тетрациклина. Их также можно как активировать, так и деактивировать, добавляя доксициклин. Другими комбинациями в этом отношении являются TOM; Крас; MTB, где myc может индуцироваться и не индуцироваться в различные моменты времени, в то время как Kras находится в непрерывно экспрессируемом состоянии, и myc; ТЗ; Модель МТБ наоборот.

Применение генетически модифицированных мышей для изучения метастазов

Метастатический каскад можно изучить, контролируя активацию гена или добавляя репортерный ген, например, бета-актин GFP (зеленый флуоресцентный белок) или RFP (красный флуоресцентный белок).

Идентификация генов, регулирующих метастазирование

Путем включения / выключения определенных генов посредством гомологичной рекомбинации можно измерить степень метастазирования и достичь идентификации новых генов-мишеней, например, ген, который последовательно регулирует метастатическое поведение раковых клеток, представляет собой TGF-β1. Резкое прекращение передачи сигналов TGF-β в опухолевых клетках молочной железы MMTV-PyMT приводит к пятикратному увеличению метастазов в легких. Некоторые области энхансера также могут быть проанализированы и могут быть определены как критически важные части пролиферации клеток, например, область усиления, которая связана с критическим для рака геном p53, который был определен с помощью CRISPR-Cas9.

Отслеживание происхождения в моделях метастазов

Стратегии количественного отслеживания клонов оказались успешными в разрешении судьбы клеток в нормальных эпителиальных тканях с использованием тканеспецифичных или специфичных для стволовых клеток трансгенов. Для проведения эксперимента по отслеживанию индуцируемых клонов в геном мыши должны быть встроены два компонента: переключатель и репортер. Переключатель обычно является лекарственно регулируемой формой бактериального фермента Cre-рекомбиназы. Этот фермент распознает определенные последовательности, называемые сайтами LoxP. Белки, которые способны улучшить идентификацию меченых клеток или конкретной популяции немеченых клеток, кодируются репортерными трансгенами. После сбора всех десяти молочных желез мышей у трансгенных мышей обычно готовят суспензию единичных клеток и трансплантируют либо в хвостовую вену нетрансгенных мышей-реципиентов, либо в очищенную жировую подушку нетрансгенных мышей, повторно заселяющих жировую подушку молочной железы. Затем эти клетки отслеживаются в кровотоке, легких, костном мозге и печени, чтобы найти благоприятное место для метастазирования. Эти трансгенные клетки можно проследить в соответствии с их особенностями флуоресценции или индуцирования путем помещения реципиентов на пищу с доксициклином.

Циркулирующие опухолевые клетки

Другой инструмент для изучения метастазов рака молочной железы - это поиск циркулирующих опухолевых клеток у трансгенных мышей, например, мыши MMTV-PyMT могут реагировать на различные методы лечения, выделяя опухолевые клетки в кровь, что приводит к метастазам в легкие. Не только в крови, но и клетки могут быть обнаружены в костном мозге, например, цитокератин- положительные клетки в костном мозге трансгенных мышей MMTV-pyMT и MMTV-Neu были идентифицированы, но не в контроле дикого типа.

Ограничения

В отсутствие специфических маркеров для клеток молочной железы модели с генетической маркировкой опухолевых клеток дают лучшее экспериментальное преимущество, однако небольшой объем периферической крови, который можно получить от живых животных, ограничивает применение этого метода.

Визуализация in vivo моделей метастатических мышей

Модели трансгенных мышей можно визуализировать с помощью различных неинвазивных методов.

Биолюминесцентная визуализация

Биолюминесцентная визуализация

Визуализация биолюминесценции основана на обнаружении света, производимого ферментативным окислением экзогенного субстрата. Субстрат люциферин окисляется до оксилюциферина в присутствии люциферазы и излучает свет, который может быть обнаружен с помощью системы IVIS, такой как аппарат Xenogen. Диссоциированные клетки молочной железы из MMTV-PyMT: IRES: Luc; Животным MTB ( внутреннее место попадания рибосомы : люциферин ) (которые не подвергались воздействию доксициклина) можно вводить инъекции в боковые хвостовые вены мышей с иммунодефицитом на диете без доксициклина. Сигнал биолюминесценции не будет наблюдаться в легких мышей-реципиентов до тех пор, пока им не будет дан корм с доксициклином. Затем биолюминесценция может быть обнаружена в грудной клетке в течение 2 недель после начала воздействия доксициклина. Люцифераза вводится непосредственно перед съемкой изображений.

Флуоресцентная визуализация

Прижизненная микроскопия с многофотонным возбуждением - это метод визуализации генно-инженерных клеток непосредственно in vivo. Многоступенчатые метастатические каскады можно визуализировать, пометив их уникальным флуоресцентным цветом под флуоресцентным микроскопом .

Радиоизотопная визуализация

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и компьютерная томография (КТ) использовались для сравнения эффективности этих изображений in vivo для обнаружения поражений на ранней стадии и для оценки реакции на химиотерапию.

МРТ

Магнитно-резонансная томография требует использования наночастиц (липосом) и контрастного вещества для МРТ, называемого гадолинием. Затем частицы помещали в пузырьки через поликарбонатный мембранный фильтр. Наночастицы вводят мышам с метастазами и оставляют там на двадцать четыре часа. Затем этих мышей сканируют, и в программном обеспечении для визуализации обнаруживаются скопления этих частиц в определенных областях, где клетки метастазировали.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки