Лазерная микродиссекция - Laser capture microdissection

Перенос чистых эпителиальных клеток протока молочной железы с помощью лазерного микродиссекции. Левая панель показывает срез ткани с удаленными выбранными клетками. На правой панели показаны изолированные эпителиальные клетки на трансферной пленке.

Лазерная микродиссекция ( LCM ), также называемая микродиссекцией , лазерной микродиссекцией ( LMD ) или лазерной микродиссекцией ( LMD или LAM ), представляет собой метод выделения конкретных представляющих интерес клеток из микроскопических областей ткани / клеток / организмов ( рассечение на микроскопическая шкала с помощью лазера ).

Принцип

Лазерная микродиссекция (LCM) - это метод получения субпопуляций тканевых клеток при прямой микроскопической визуализации. Технология LCM может собирать интересующие клетки напрямую или может изолировать определенные клетки, отсекая нежелательные клетки, чтобы получить гистологически чистые обогащенные популяции клеток. Существует множество последующих приложений: генотипирование ДНК и анализ потери гетерозиготности (LOH), профилирование транскриптов РНК , создание библиотеки кДНК , открытие протеомики и профилирование сигнальных путей. Общее время, необходимое для выполнения этого протокола, обычно составляет 1–1,5 часа.

Добыча

Лазер соединен в микроскоп и фокусируется на ткань на слайде. При перемещении лазера с помощью оптики или предметного столика фокус следует по траектории, заданной пользователем. Затем эта траектория, также называемая элементом , вырезается и отделяется от прилегающей ткани. После процесса резки должен следовать процесс экстракции, если требуется процесс экстракции. В более современных технологиях используется бесконтактная микродиссекция.

Есть несколько способов извлечь ткань из предметного стекла микроскопа с гистопатологическим образцом на нем. Прижмите липкую поверхность к образцу и вырвите. Это позволяет извлечь желаемую область, но также может удалить частицы или нежелательную ткань с поверхности, поскольку поверхность не является селективной. Расплавьте пластиковую мембрану на образец и вырвите ее. Тепло подводится, например, с помощью красного или инфракрасного (ИК) лазера к мембране, окрашенной поглощающим красителем. Поскольку при этом желаемый образец приклеивается к мембране, как и в случае любой мембраны, которая помещается близко к поверхности гистопатологического образца, может быть извлечен некоторый мусор. Еще одна опасность - это внесенное тепло: некоторые молекулы, такие как ДНК, РНК или белок, не позволяют нагреваться слишком сильно или вообще, чтобы их изолировать как можно более чисто.

Для бесконтактной транспортировки. Есть три разных подхода. Транспортировка под действием силы тяжести с использованием вертикального микроскопа (так называемая GAM, гравитационная микродиссекция ) или транспортировка с помощью катапульты с лазерным давлением ; самое последнее поколение использует технологию, основанную на лазерном прямом переносе (LIFT). При использовании метода разрезания и захвата колпачок, покрытый клеем, помещается непосредственно на тонко разрезанный (5-8 мкм) срез ткани, причем сам срез опирается на тонкую мембрану (полиэтиленнафталин). ИК-лазер мягко нагревает клей на колпачке, сплавляя его с подлежащей тканью, а УФ-лазер прорезает ткань и подлежащую мембрану. Существо мембрана-ткань теперь прикрепляется к крышке, и клетки на крышке могут использоваться в последующих приложениях (ДНК, РНК, анализ белков).

Процедура

Лазерная микродиссекция

Под микроскопом с использованием программного интерфейса просматривается срез ткани (обычно толщиной 5-50 микрометров), и отдельные клетки или кластеры клеток идентифицируются либо вручную, либо полуавтоматическими или более полностью автоматизированными способами, позволяющими визуализировать и затем автоматически выбирать цели для изоляции. В настоящее время существует шесть технологий первичной изоляции / сбора с использованием микроскопа и устройства для выделения клеток. В четырех из них обычно используется ультрафиолетовый импульсный лазер (355 нм) для резки тканей непосредственно или мембран / пленки, а иногда и в сочетании с ИК- лазером, отвечающим за нагрев / плавление липкого полимера для адгезии и изоляции клеток. ИК-лазер обеспечивает более щадящий подход к микродиссекции. В пятой технологии, основанной на ультрафиолетовом лазере, используются специальные слайды, покрытые энергопередающим покрытием, которое при активации лазерным импульсом перемещает ткань или клетки в колпачок для сбора.

Ширина лазерной резки обычно составляет менее 1 мкм, поэтому лазерный луч не влияет на клетки-мишени. Даже живые клетки не повреждаются при лазерной резке и после резки становятся жизнеспособными для клонирования и повторного культивирования.

Различные технологии различаются процессом сбора, возможными методами визуализации ( флуоресцентная микроскопия / светлопольная микроскопия / дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия / фазово-контрастная микроскопия и т. Д.), А также типами держателей и препаратами ткани, необходимыми перед визуализацией и выделением. Большинство из них - это в первую очередь специализированные системы микродиссекции, а некоторые могут использоваться в качестве исследовательских микроскопов, только одна технология (здесь №2, Leica) использует вертикальный микроскоп, что несколько ограничивает некоторые возможности обработки образцов, особенно для работы с живыми клетками.

Первая технология (используемая Carl Zeiss PALM) обрезает образец, а затем собирает его с помощью технологии «катапультирования». Образец может быть катапультирован с предметного стекла или специальной чашки для культивирования с помощью расфокусированного ультрафиолетового лазерного импульса, который генерирует фотонную силу для продвижения материала с предметного стекла / чашки, метод, который иногда называют катапультированием под давлением лазерного микродиссекции. Рассеченный материал направляется вверх (до нескольких миллиметров) в колпачок микроцентрифужной пробирки или другой коллектор, который содержит буфер или специальный липкий материал в колпачке пробирки, к которому ткань будет прилипать. Этот активный процесс катапультирования позволяет избежать некоторых статических проблем при использовании слайдов с мембранным покрытием.

Другой процесс следует за методом микродиссекции с помощью силы тяжести, который включает гравитацию для сбора образцов в пробирке под используемым предметным стеклом (используется системой ION LMD , Jungwoo F&B). В случае этой системы он перемещает моторизованный столик, чтобы разрезать интересующие клетки, сохраняя лазерный луч фиксированным. В системе используется твердотельный лазер с длиной волны 355 нм ( УФ-А ), который является самым безопасным способом разрезания тканей без повреждения РНК или ДНК.

Другой тесно связанный процесс LCM (используемый Leica) разрезает образец сверху, и образец падает под действием силы тяжести (микродиссекция под действием силы тяжести) в устройство захвата под образцом. Точка, отличная от верхней, заключается в том, что здесь лазерный луч движется, чтобы разрезать ткань, перемещая дихроичное зеркало.

Когда выбранные клетки (на предметном стекле или специальной культуральной чашке) находятся в центре поля зрения, оператор выбирает интересующие клетки с помощью программного обеспечения прибора. Область, которая должна быть изолирована, когда лазер ближнего ИК-диапазона активирует переносящую пленку на колпачке, помещенном на образец ткани, расплавляя клей, который затем сплавляет пленку с выбранными подлежащими клетками (см. Системы Arcturus); и / или путем активации УФ-лазера для вырезания интересующей клетки. Затем клетки поднимаются с тонкого среза ткани, оставляя все нежелательные клетки. Затем интересующие клетки просматриваются и документируются перед экстракцией.

Четвертая технология на основе УФ (используемая Molecular Machines and Industries AG) предлагает небольшое отличие от третьей технологии, по сути создавая своего рода сэндвич со слайдом> образец> и мембраной, покрывающей образец, за счет использования каркаса слайда, поверхность мембраны которого разрезается лазером и, в конечном итоге, улавливается сверху специальной липкой крышкой.

Пятая технология, основанная на УФ-излучении, использует стандартные стеклянные предметные стекла, покрытые инертным покрытием, передающим энергию, и систему лазерной микродиссекции на основе УФ-излучения (обычно это Leica LMD или PALM Zeiss). Срезы ткани устанавливаются поверх покрытия, передающего энергию. Энергия УФ-лазера преобразуется в кинетическую энергию при ударе о покрытие, его испарение и мгновенное перемещение выбранных элементов ткани в трубку для сбора. Слайды с покрытием, передающим энергию, выпускаемые под торговым названием DIRECTOR слайды компанией Expression Pathology Inc. (Роквилл, Мэриленд), предлагают несколько преимуществ для протеомной работы. Они также не обладают автофлуоресценцией, поэтому их можно использовать для применений с использованием флуоресцентных красителей, ДИК или поляризованного света.

Помимо срезов тканей, LCM можно проводить на живых клетках / организмах, мазках клеток, препаратах хромосом и тканях растений.

Приложения

Процесс микродиссекции с помощью лазерного захвата не изменяет и не повреждает морфологию и химический состав собранных образцов, а также окружающие клетки. По этой причине LCM является полезным методом сбора выбранных клеток для анализа ДНК , РНК и / или белков . LCM также использовался для выделения бесклеточных структур, таких как амилоидные бляшки . LCM можно проводить на различных образцах тканей, включая мазки крови , цитологические препараты, клеточные культуры и аликвоты твердых тканей. Также можно использовать замороженные и залитые в парафин архивные ткани.

использованная литература

внешние ссылки