ТИЛЛИНГ (молекулярная биология) - TILLING (molecular biology)

TILLING ( нацеливание на индуцированные локальные поражения в геномах ) - это метод в молекулярной биологии, который позволяет направленно идентифицировать мутации в конкретном гене . TILLING был введен в 2000 году с использованием модельного растения Arabidopsis thaliana и расширен в другие области применения и методологии небольшой группой ученых, включая Луку Комаи . С тех пор обработка почвы используется в качестве метода обратной генетики для других организмов, таких как рыбки данио , кукуруза , пшеница , рис , соя , помидоры и салат .

Обзор

Этот метод сочетает в себе стандартный и эффективный метод мутагенеза с использованием химического мутагена, такого как этилметансульфонат (EMS), с техникой чувствительного ДНК-скрининга, который выявляет одноосновные мутации (также называемые точечными мутациями) в целевом гене. Метод TILLING основан на образовании гетеродуплексов ДНК , которые образуются, когда несколько аллелей амплифицируются с помощью ПЦР, а затем нагреваются и медленно охлаждаются. При несовпадении двух цепей ДНК образуется « пузырек », который затем расщепляется одноцепочечной нуклеазой . Затем продукты разделяются по размеру на нескольких разных платформах (см. Ниже).

Несоответствия могут быть вызваны индуцированной мутацией, гетерозиготностью внутри человека или естественной изменчивостью между людьми.

EcoTILLING - это метод, использующий методы TILLING для поиска естественных мутаций у людей, обычно для анализа популяционной генетики. ДЕКОТИЛЛИНГ - это модификация ТИЛЛИНГА и ЭКОТИЛЛИНГА, в которой используется недорогой метод идентификации фрагментов. С момента появления технологий секвенирования NGS , TILLING-by-секвенирование было разработано на основе секвенирования Illumina целевых генов, амплифицированных из многомерных объединенных матриц для выявления возможных однонуклеотидных изменений.

Однонитевые ферменты расщепления

Существует несколько источников однонитевых нуклеаз. Первым широко используемым ферментом была нуклеаза маша , но было показано, что эта нуклеаза обладает высокой неспецифической активностью и работает только при низком pH, что может разрушать продукты ПЦР и праймеры, меченные красителями. Первоначальным источником однонитевой нуклеазы был CEL1 или CJE (экстракт сока сельдерея), но на рынок вышли и другие продукты, в том числе ферменты SNiPerase от Frontier Genomics, которые были оптимизированы для использования на платформах, использующих меченые и немеченые продукты ПЦР (см. следующий раздел). Transgenomic изолировал белок однонитевой нуклеазы и продает его в виде рекомбинантной формы. Преимущество рекомбинантной формы состоит в том, что, в отличие от смесей ферментов, она не обладает неспецифической нуклеазной активностью, которая может разрушать красители на праймерах ПЦР. Недостаток - существенно более высокая стоимость.

Разделение продуктов скола

В первой статье, описывающей TILLING, для выявления мутаций использовалась ВЭЖХ (McCallum et al., 2000a). Этот метод стал более производительным за счет использования рестрикционного фермента Cel-I в сочетании с системой на основе геля LICOR для выявления мутаций (Colbert et al., 2001). Преимущества использования этой системы заключаются в том, что сайты мутации можно легко подтвердить и отличить от шума. Это связано с тем, что для прямой и обратной грунтовки можно использовать красители разного цвета. После того, как продукты расщепления были обработаны на геле, их можно просматривать в отдельных каналах, и, как и в случае с RFLP, размеры фрагментов в пределах дорожки в каждом канале должны составлять в сумме размер продукта полной длины. Преимущества системы LICOR - разделение больших фрагментов (~ 2 КБ), высокая производительность образцов (96 образцов, загруженных на бумажные гребенки) и бесплатное программное обеспечение для выявления мутаций (GelBuddy). Недостатки системы LICOR - необходимость заливки гелей для плит и длительное время работы (~ 4 часа). Методы TILLING и EcoTILLING теперь используются в капиллярных системах от Advanced Analytical Technologies, ABI и Beckman.

Для разделения продуктов ПЦР, не помеченных красителями, можно использовать несколько систем. Простые системы электрофореза в агарозе позволят разделить продукты расщепления недорого и со стандартным лабораторным оборудованием. Это было использовано для обнаружения SNP у кеты и получило название ДЕКОТИЛЛИНГ. Недостатком этой системы является меньшая разрешающая способность по сравнению с полиакриламидными системами. Elchrom Scientific продает гели Spreadex, которые являются сборными, могут иметь высокую пропускную способность и более чувствительны, чем стандартные полиакриламидные гели. Advanced Analytical Technologies Inc. продает флуоресцентную систему дцДНК AdvanCE FS96, которая представляет собой систему для 96 капиллярного электрофореза, которая имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами; включая возможность разделения больших фрагментов (до 40 КБ), отсутствие необходимости в стадии обессоливания или осаждения, короткое время анализа (~ 30 минут), чувствительность до 5 мкг / мкл и отсутствие необходимости во флуоресцентно меченных праймерах.

Пахотные центры

В мире существует несколько центров обработки почвы, специализирующихся на выращивании важных для сельского хозяйства видов:

  • Райс - Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
  • Кукуруза - Университет Пердью (США)
  • Brassica napus - Университет Британской Колумбии (Калифорния)
  • Brassica rapa - Центр Джона Иннеса (Великобритания)
  • Arabidopsis - Исследования рака Фреда Хатчинсона
  • Соя - Университет Южного Иллинойса (США)
  • Лотос и Медикаго - Центр Джона Иннеса (Великобритания)
  • Пшеница - Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
  • Горох, помидор - INRA (Франция)
  • Помидор - RTGR, Хайдарабадский университет (Индия)

использованная литература

Научная литература

внешние ссылки