Эпигенетика - Epigenetics

Эпигенетические механизмы

В биологии , эпигенетика является изучение наследуемых фенотипических изменений , которые не связаны изменения в последовательности ДНК . Греческий префикс эпи- ( ἐπι- «над, вне, вокруг») в эпигенетике подразумевает функцию, которые «сверху» или «в дополнении к» традиционной генетической основе для наследования. Эпигенетика чаще всего включает изменения, которые влияют на активность и экспрессию генов , но этот термин также может использоваться для описания любых наследственных фенотипических изменений. Такое воздействие на клеточные и физиологические фенотипические признаки может быть результатом внешних факторов или факторов окружающей среды или быть частью нормального развития.

Этот термин также относится к самим изменениям: функционально значимым изменениям генома, которые не связаны с изменением нуклеотидной последовательности . Примерами механизмов, вызывающих такие изменения, являются метилирование ДНК и модификация гистонов , каждый из которых изменяет способ экспрессии генов без изменения лежащей в основе последовательности ДНК . Экспрессия генов может контролироваться действием репрессорных белков, которые прикрепляются к сайленсирующим участкам ДНК. Эти эпигенетические изменения могут длиться через клеточные деления на протяжении всей жизни клетки, а также могут продолжаться в течение нескольких поколений, даже если они не связаны с изменениями в основной последовательности ДНК организма; вместо этого негенетические факторы заставляют гены организма вести себя (или «выражать себя») по-разному.

Одним из примеров эпигенетических изменений в биологии эукариот является процесс клеточной дифференциации . Во время морфогенеза , тотипотентными стволовые клетки становятся различные плюрипотентные клеточные линии этого эмбриона , которые в свою очередь становятся полностью дифференцированными клетками. Другими словами, в виде одной оплодотворенной яйцеклетки - The зиготы - продолжает разрыва , полученные в результате дочерние клетки превращаются в всех различных типов клеток в организме, в том числе нейроны , мышечные клетки , эпителий , эндотелий из кровеносных сосудов и т.д., путем активация одних генов при подавлении экспрессии других.

Определения

Термин « эпигенетика» в его современном использовании появился в 1990-х годах, но в течение нескольких лет использовался в несколько различных значениях. Определение концепции эпигенетического признака как «стабильно наследуемого фенотипа, возникающего в результате изменений в хромосоме без изменений в последовательности ДНК» было сформулировано на встрече в Колд-Спринг-Харбор в 2008 году, хотя альтернативные определения, которые включают ненаследуемые признаки, все еще находятся в стадии разработки. широко используется.

Термин эпигенез имеет общее значение «дополнительный рост» и используется в английском языке с 17 века.

Канализация Уоддингтона, 1940-е годы

Гипотезу об эпигенетических изменениях, влияющих на экспрессию хромосом, выдвинул российский биолог Николай Кольцов . Исходя из общего значения и связанного с ним прилагательного « эпигенетика» , британский эмбриолог Ч. К. Уоддингтон ввел термин « эпигенетика» в 1942 г. как относящийся к эпигенезу , параллельно с «феногенетикой» Валентина Хеккера ( Phänogenetik ). Эпигенез в контексте биологии того периода относился к дифференцировке клеток от их первоначального тотипотентного состояния во время эмбрионального развития .

Когда Уоддингтон придумал этот термин, физическая природа генов и их роль в наследственности не были известны. Вместо этого он использовал это как концептуальную модель того, как генетические компоненты могут взаимодействовать с окружающей средой, чтобы произвести фенотип ; он использовал фразу « эпигенетический ландшафт » как метафору биологического развития . Уоддингтон считал, что судьбы клеток были установлены во время развития в процессе, который он назвал канализацией, подобно тому, как шарик скатывается до самой низкой локальной возвышенности . Уоддингтон предложил визуализировать возрастающую необратимость дифференцировки клеточного типа в виде гребней, поднимающихся между долинами, по которым перемещаются шарики (аналогичные клеткам).

В последнее время представление Уоддингтона об эпигенетическом ландшафте было строго формализовано в контексте подхода системной динамики к изучению судьбы клеток. Предполагается, что определение судьбы клетки будет демонстрировать определенную динамику, такую ​​как аттрактор-конвергенция (аттрактор может быть точкой равновесия, предельным циклом или странным аттрактором ) или колебаться.

Современный

Робин Холлидей определил в 1990 году эпигенетику как «изучение механизмов временного и пространственного контроля активности генов во время развития сложных организмов». Таким образом, в самом широком смысле эпигенетика может использоваться для описания чего угодно, кроме последовательности ДНК, которая влияет на развитие организма.

Более позднее использование этого слова в биологии следует более строгим определениям. Это, по определению Артура Риггса и его коллег, «изучение митотически и / или мейотически наследуемых изменений функции генов, которые нельзя объяснить изменениями в последовательности ДНК».

Однако этот термин также использовался для описания процессов, наследственность которых не была продемонстрирована, таких как некоторые формы модификации гистонов; поэтому есть попытки переопределить «эпигенетику» в более широких терминах, чтобы избежать ограничений, связанных с требованием наследуемости . Например, Адриан Берд определил эпигенетику как «структурную адаптацию хромосомных областей с целью регистрации, передачи сигналов или сохранения измененных состояний активности». Это определение будет включать временные модификации, связанные с репарацией ДНК или фазами клеточного цикла, а также стабильные изменения, сохраняющиеся в нескольких поколениях клеток, но исключая другие, такие как создание шаблонов мембранной архитектуры и прионов, если они не влияют на функцию хромосом. Однако такие переопределения не являются общепринятыми и все еще являются предметом обсуждения. В «Дорожной карте эпигеномного проекта» Национального института здравоохранения, продолжающемся с 2016 года, используется следующее определение: «Для целей этой программы эпигенетика относится как к наследственным изменениям в активности и экспрессии генов (в потомстве клеток или индивидов), так и к стабильным, долгосрочные изменения транскрипционного потенциала клетки, которые не обязательно передаются по наследству ». В 2008 году на встрече в Колд-Спринг-Харбор было принято согласованное определение эпигенетического признака, «стабильно наследуемого фенотипа, возникающего в результате изменений в хромосоме без изменений в последовательности ДНК» .

Сходство этого слова с «генетикой» породило множество параллельных употреблений. « Эпигеном » является параллелью слову « геном », относящимся к общему эпигенетическому состоянию клетки, а эпигеномика относится к глобальному анализу эпигенетических изменений во всем геноме. Фраза « генетический код » также была адаптирована - « эпигенетический код » использовался для описания набора эпигенетических особенностей, которые создают разные фенотипы в разных клетках из одной и той же базовой последовательности ДНК. В крайнем случае «эпигенетический код» может представлять общее состояние клетки с положением каждой молекулы, учитываемым на эпигеномной карте , схематическим представлением экспрессии гена, метилированием ДНК и статусом модификации гистонов конкретного генома. область. Чаще термин используется в отношении систематических усилий по измерению конкретных релевантных форм эпигенетической информации, таких как гистоновый код или паттерны метилирования ДНК .

Психология развития

В некотором смысле, не имеющем отношения к его использованию в каких-либо биологических дисциплинах, термин «эпигенетический» также использовался в психологии развития для описания психологического развития как результата непрерывного двустороннего обмена между наследственностью и окружающей средой. Интерактивные идеи развития обсуждались в разных формах и под разными названиями на протяжении 19 и 20 веков. Ранняя версия была предложена, в том числе основополагающих утверждений в эмбриологии , по Бэр и популяризировал Эрнста Геккеля . Радикальный эпигенетический взгляд (физиологический эпигенез) был разработан Полом Винтребертом . Другой вариант, вероятностный эпигенез, был представлен Гилбертом Готлибом в 2003 году. Этот взгляд охватывает все возможные факторы развития организма и то, как они влияют не только на организм и друг на друга, но и на то, как организм также влияет на свое собственное развитие. Точно так же давнее понятие «клетки, которые срабатывают вместе, соединяются вместе» происходит от теории Хебба , которая утверждает, что синаптогенез , процесс развития с большим эпигенетическим приоритетом, зависит от активности соответствующих синапсов в нейронной сети. Там, где опыт изменяет возбудимость нейронов, повышенная нервная активность связана с усилением деметилирования.

Психолог развития Эрик Эриксон написал об эпигенетическом принципе в своей книге 1968 года ` ` Идентичность: молодость и кризис '' , охватывающей представление о том, что мы развиваемся через развертывание нашей личности на заранее определенных стадиях, и что наша среда и окружающая культура влияют на то, как мы продвигаемся через эти стадии. . Это биологическое развертывание по отношению к нашим социокультурным условиям происходит на этапах психосоциального развития , где «прогресс на каждом этапе частично определяется нашим успехом или неуспехом на всех предыдущих этапах».

Хотя эмпирические исследования дали противоречивые результаты, считается, что эпигенетические модификации являются биологическим механизмом трансгенеративной травмы .

Молекулярная основа

Эпигенетические изменения изменяют активацию определенных генов, но не последовательности генетического кода ДНК. Микроструктура (не код) самой ДНК или связанных с ней белков хроматина может быть изменена, вызывая активацию или молчание. Этот механизм позволяет дифференцированным клеткам многоклеточного организма экспрессировать только те гены, которые необходимы для их собственной деятельности. Эпигенетические изменения сохраняются при делении клеток. Большинство эпигенетических изменений происходит только в течение жизни одного индивидуального организма; однако эти эпигенетические изменения могут передаваться потомству организма посредством процесса, называемого трансгенерационным эпигенетическим наследованием . Более того, если в сперматозоидной или яйцеклетке происходит инактивация гена, которая приводит к оплодотворению, эта эпигенетическая модификация также может быть передана следующему поколению.

Специфические эпигенетические процессы включают парамутации , закладку , импринтинг , молчание генов , инактивацию Х-хромосомы , эффект положения , репрограммирование метилирования ДНК , трансвекцию , материнские эффекты , прогресс канцерогенеза , многие эффекты тератогенов , регуляцию модификаций гистонов и гетерохроматина , а также технические ограничения, влияющие на партеногенез и клонирование .

Повреждение ДНК

Повреждение ДНК также может вызывать эпигенетические изменения. Повреждение ДНК происходит очень часто, в среднем около 60 000 раз в день на одну клетку человеческого тела (см. Повреждение ДНК (естественное происхождение) ). Эти повреждения в значительной степени восстанавливаются, но в месте репарации ДНК могут оставаться эпигенетические изменения. В частности, двухцепочечный разрыв в ДНК может инициировать незапрограммированное подавление эпигенетического гена как за счет метилирования ДНК, так и за счет стимулирования типов молчания модификаций гистонов (ремоделирование хроматина - см. Следующий раздел). Кроме того, фермент Parp1 (поли (АДФ) -рибоза-полимераза) и его продукт поли (АДФ) -рибоза (PAR) накапливаются в местах повреждения ДНК как часть процесса репарации. Это накопление, в свою очередь, направляет набор и активацию ремоделирующего хроматин белка ALC1, который может вызывать ремоделирование нуклеосом . Было обнаружено, что ремоделирование нуклеосом вызывает, например, эпигенетическое подавление гена репарации ДНК MLH1. Химические вещества, повреждающие ДНК, такие как бензол , гидрохинон , стирол , четыреххлористый углерод и трихлорэтилен , вызывают значительное гипометилирование ДНК, в некоторых случаях за счет активации путей окислительного стресса.

Известно, что пища изменяет эпигенетику крыс на разных диетах. Некоторые пищевые компоненты эпигенетически повышают уровни ферментов репарации ДНК , такие как MGMT и MLH1 и р53 . Другие пищевые компоненты, например изофлавоны сои, могут уменьшить повреждение ДНК . В одном исследовании маркеры окислительного стресса, такие как модифицированные нуклеотиды, которые могут возникнуть в результате повреждения ДНК, были уменьшены за счет трехнедельной диеты с добавлением сои. Снижение окислительного повреждения ДНК наблюдалось также через 2 ч после потребления антоцианов -богатой черника ( Vaccinium myrtillius L.) выжимки экстракта.

Методы изучения эпигенетики

В эпигенетических исследованиях используется широкий спектр молекулярно-биологических методов для дальнейшего понимания эпигенетических явлений, включая иммунопреципитацию хроматина (вместе с его крупномасштабными вариантами ChIP-on-chip и ChIP-Seq ), флуоресцентную гибридизацию in situ , чувствительные к метилированию рестрикционные ферменты , Идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ( DamID ) и бисульфитное секвенирование . Кроме того, использование методов биоинформатики играет важную роль в вычислительной эпигенетике .

Механизмы

Некоторые типы систем эпигенетического наследования могут играть роль в том, что стало известно как клеточная память, однако обратите внимание, что не все из них повсеместно считаются примерами эпигенетики.

Ковалентные модификации

Ковалентные модификации ДНК (например, метилирование и гидроксиметилирование цитозина) или гистоновых белков (например, ацетилирование лизина, метилирование лизина и аргинина, фосфорилирование серина и треонина, убиквитинирование и сумоилирование лизина) играют центральную роль во многих типах эпигенетического наследования. Поэтому слово «эпигенетика» иногда используется как синоним этих процессов. Однако это может ввести в заблуждение. Ремоделирование хроматина не всегда передается по наследству, и не все эпигенетические наследования включают ремоделирование хроматина. В 2019 году в научной литературе появилась еще одна модификация лизина, связывающая модификацию эпигенетики с клеточным метаболизмом, то есть лактилирование.

ДНК связывается с гистоновыми белками с образованием хроматина.

Поскольку фенотип клетки или индивидуума зависит от того, какой из ее генов транскрибируется, наследуемые состояния транскрипции могут вызывать эпигенетические эффекты. Есть несколько уровней регуляции экспрессии генов . Один из способов регуляции генов - это ремоделирование хроматина. Хроматин - это комплекс ДНК и гистоновых белков, с которыми он связан. Если меняется способ обертывания ДНК вокруг гистонов, может измениться и экспрессия генов. Ремоделирование хроматина осуществляется с помощью двух основных механизмов:

  1. Первый способ - посттрансляционная модификация аминокислот, составляющих гистоновые белки. Гистоновые белки состоят из длинных цепочек аминокислот. Если аминокислоты в цепи изменены, форма гистона может измениться. ДНК не разматывается полностью во время репликации. Тогда возможно, что модифицированные гистоны могут быть перенесены в каждую новую копию ДНК. Оказавшись там, эти гистоны могут действовать как шаблоны, инициируя формирование окружающих новых гистонов новым способом. Изменяя форму окружающих их гистонов, эти модифицированные гистоны д. Гарантировать, что программа транскрипции, специфичная для клонов, сохраняется после деления клетки.
  2. Второй способ - добавление метильных групп к ДНК, в основном в сайтах CpG , для превращения цитозина в 5-метилцитозин . 5-Метилцитозин действует так же, как обычный цитозин, соединяясь с гуанином в двухцепочечной ДНК. Однако, когда метилированные цитозины присутствуют в сайтах CpG в промоторных и энхансерных областях генов, гены часто репрессируются. Когда метилированные цитозины присутствуют в сайтах CpG в теле гена (в кодирующей области, исключая сайт начала транскрипции), экспрессия гена часто усиливается. Транскрипция гена обычно зависит от связывания фактора транскрипции с последовательностью распознавания (10 оснований или меньше) в промоторной области этого гена. Приблизительно 22% факторов транскрипции ингибируют связывание, когда последовательность узнавания содержит метилированный цитозин. Кроме того, присутствие метилированных цитозинов в промоторной области может привлекать белки метил-CpG-связывающего домена (MBD). Все MBD взаимодействуют с ремоделированием нуклеосом и комплексами гистондеацетилазы , что приводит к молчанию генов. Кроме того, еще одна ковалентной модификации с участием метилированного цитозина является его деметилированием с помощью TET ферментов . Сотни таких деметилирований происходят, например, во время обучения и формирования памяти в нейронах .

Механизмы наследственности состояния гистонов изучены недостаточно; однако многое известно о механизме наследственности состояния метилирования ДНК во время деления и дифференцировки клеток. Наследственность состояния метилирования зависит от определенных ферментов (таких как DNMT1 ), которые имеют более высокое сродство к 5-метилцитозину, чем к цитозину. Если этот фермент достигает «полуметилированной» части ДНК (где 5-метилцитозин находится только в одной из двух цепей ДНК), фермент метилирует другую половину.

Хотя модификации гистонов происходят по всей последовательности, неструктурированные N-концы гистонов (называемые хвостами гистонов) особенно сильно модифицированы. Эти модификации включают ацетилирование , метилирование , убиквитилирование , фосфорилирование , сумоилирование , рибозилирование и цитруллинирование. Ацетилирование - наиболее изученная из этих модификаций. Например, ацетилирование лизинов K14 и K9 хвоста гистона H3 ферментами гистонацетилтрансферазы (HAT) обычно связано с транскрипционной компетентностью.

Один из способов мышления состоит в том, что эта тенденция ацетилирования, связанная с «активной» транскрипцией, имеет биофизическую природу. Поскольку в норме лизин имеет на конце положительно заряженный азот, лизин может связывать отрицательно заряженные фосфаты основной цепи ДНК. Событие ацетилирования превращает положительно заряженную аминогруппу на боковой цепи в нейтральную амидную связь. Это удаляет положительный заряд, тем самым освобождая ДНК от гистона. Когда это происходит, такие комплексы, как SWI / SNF и другие факторы транскрипции, могут связываться с ДНК и обеспечивать возможность транскрипции. Это «цис-модель» эпигенетической функции. Другими словами, изменения хвостов гистонов имеют прямое влияние на саму ДНК.

Другой моделью эпигенетической функции является «транс» модель. В этой модели изменения гистоновых хвостов косвенно воздействуют на ДНК. Например, ацетилирование лизина может создавать сайт связывания для ферментов, модифицирующих хроматин (а также для механизмов транскрипции). Этот ремоделер хроматина может затем вызвать изменения в состоянии хроматина. Действительно, бромодомен - белковый домен, который специфически связывает ацетил-лизин - обнаружен во многих ферментах, которые помогают активировать транскрипцию, включая комплекс SWI / SNF . Возможно, что ацетилирование действует этим и предыдущим способом, помогая в активации транскрипции.

Идея о том, что модификации действуют как стыковочные модули для родственных факторов, также подтверждается метилированием гистонов . Метилирование лизина 9 гистона H3 долгое время было связано с конститутивно не транскрипционно молчащим хроматином (конститутивным гетерохроматином ). Было определено, что хромодомен (домен, который специфически связывает метил-лизин) в репрессивном транскрипционном белке HP1 рекрутирует HP1 в метилированные области K9. Одним из примеров, который, кажется, опровергает эту биофизическую модель метилирования, является то, что три-метилирование гистона H3 по лизину 4 сильно связано с (и требуется для полной) активации транскрипции. В этом случае триметилирование привносит фиксированный положительный заряд на хвост.

Было показано, что гистоновый лизинметилтрансфераза (KMT) ответственна за эту активность метилирования в структуре гистонов H3 и H4. Этот фермент использует каталитически активный сайт, называемый доменом SET (супрессор пестроты, усилитель зесте, Trithorax). Домен SET представляет собой последовательность из 130 аминокислот, участвующую в модуляции активности генов. Было продемонстрировано, что этот домен связывается с гистоновым хвостом и вызывает метилирование гистона.

Различные модификации гистонов могут действовать по-разному; ацетилирование в одном положении, вероятно, будет действовать иначе, чем ацетилирование в другом положении. Кроме того, одновременно могут происходить множественные модификации, и эти модификации могут работать вместе, чтобы изменить поведение нуклеосомы . Идея о том, что множественные динамические модификации регулируют транскрипцию генов систематическим и воспроизводимым образом, называется гистоновым кодом , хотя идея о том, что состояние гистонов может считываться линейно как цифровой носитель информации, была в значительной степени опровергнута. Одной из наиболее изученных систем, которые управляют подавлением на основе хроматина, является подавление на основе белка SIR дрожжевых скрытых локусов типа спаривания HML и HMR.

Метилирование ДНК часто происходит в повторяющихся последовательностях и помогает подавить экспрессию и подвижность « мобильных элементов »: поскольку 5-метилцитозин может спонтанно дезаминироваться (заменяя азот кислородом) до тимидина , сайты CpG часто мутируются и становятся редкими в геноме. , за исключением островов CpG, где они остаются неметилированными. Таким образом, эпигенетические изменения этого типа могут способствовать увеличению частоты постоянных генетических мутаций. Известно, что паттерны метилирования ДНК устанавливаются и модифицируются в ответ на факторы окружающей среды за счет сложного взаимодействия по крайней мере трех независимых ДНК-метилтрансфераз , DNMT1, DNMT3A и DNMT3B, потеря любой из которых смертельна для мышей. DNMT1 является наиболее распространенной метилтрансферазой в соматических клетках, локализуется в фокусах репликации, имеет 10-40-кратное предпочтение гемиметилированной ДНК и взаимодействует с ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA).

Предпочтительно модифицируя гемиметилированную ДНК, DNMT1 передает паттерны метилирования на вновь синтезированную цепь после репликации ДНК , и поэтому ее часто называют «поддерживающей» метилтрансферазой. DNMT1 необходим для правильного эмбрионального развития, импринтинга и X-инактивации. Чтобы подчеркнуть отличие этого молекулярного механизма наследования от канонического механизма спаривания оснований Уотсона-Крика для передачи генетической информации, был введен термин «эпигенетический шаблон». Более того, в дополнение к поддержанию и передаче состояний метилированной ДНК, тот же принцип может работать в поддержании и передаче модификаций гистонов и даже цитоплазматических ( структурных ) наследственных состояний.

Гистонами H3 и H4 также можно манипулировать посредством деметилирования с использованием гистонолизиндеметилазы (KDM). Этот недавно идентифицированный фермент имеет каталитически активный сайт, называемый доменом Jumonji (JmjC). Деметилирование происходит, когда JmjC использует несколько кофакторов для гидроксилирования метильной группы, тем самым удаляя ее. JmjC способен деметилировать моно-, ди- и три-метилированные субстраты.

Хромосомные области могут принимать стабильные и наследуемые альтернативные состояния, приводящие к бистабильной экспрессии генов без изменений последовательности ДНК. Эпигенетический контроль часто связан с альтернативными ковалентными модификациями гистонов. Предполагается, что стабильность и наследуемость состояний более крупных хромосомных областей включает положительную обратную связь, когда модифицированные нуклеосомы рекрутируют ферменты, которые аналогичным образом модифицируют близлежащие нуклеосомы. Здесь находится упрощенная стохастическая модель для этого типа эпигенетики.

Было высказано предположение, что регуляция транскрипции на основе хроматина может быть опосредована действием малых РНК. Малые интерферирующие РНК могут модулировать экспрессию транскрипционных генов посредством эпигенетической модуляции промоторов- мишеней .

Транскрипты РНК

Иногда ген после включения транскрибирует продукт, который (прямо или косвенно) поддерживает активность этого гена. Например, Hnf4 и MyoD усиливают транскрипцию многих генов, специфичных для печени и специфичных для мышц, соответственно, включая их собственный, за счет активности факторов транскрипции белков, которые они кодируют. Передача сигналов РНК включает дифференциальное привлечение иерархии общих модифицирующих хроматин комплексов и ДНК-метилтрансфераз к конкретным локусам с помощью РНК во время дифференцировки и развития. Другие эпигенетические изменения опосредованы производства различных сплайс форм из РНК , или путем образования двухцепочечной РНК ( RNAi ). Потомки клетки, в которой был включен ген, унаследуют эту активность, даже если исходный стимул для активации гена больше не присутствует. Эти гены часто включаются или выключаются посредством передачи сигнала , хотя в некоторых системах, где важны синцитии или щелевые соединения , РНК может распространяться непосредственно в другие клетки или ядра путем диффузии . Большое количество РНК и белка вносится в зиготу матерью во время оогенеза или через питательные клетки , что приводит к фенотипам материнского эффекта . Меньшее количество РНК сперматозоидов передается от отца, но недавно появились доказательства того, что эта эпигенетическая информация может приводить к видимым изменениям в нескольких поколениях потомства.

МикроРНК

МикроРНК (миРНК) являются членами некодирующих РНК , размер которых варьируется от 17 до 25 нуклеотидов. miRNA регулируют широкий спектр биологических функций у растений и животных. На данный момент, в 2013 году, у людей было обнаружено около 2000 miRNA, и их можно найти в Интернете в базе данных miRNA. Каждая миРНК, экспрессируемая в клетке, может нацеливаться на примерно 100-200 матричных РНК (мРНК), которые она подавляет. Большая часть подавления мРНК происходит, вызывая распад целевой мРНК, в то время как некоторое подавление происходит на уровне трансляции в белок.

Похоже, что около 60% генов, кодирующих человеческие белки, регулируются miRNA. Многие miRNA регулируются эпигенетически. Около 50% генов miRNA связаны с островками CpG , которые могут подавляться эпигенетическим метилированием. Транскрипция с метилированных CpG-островков сильно и наследственно репрессируется. Другие миРНК эпигенетически регулируются либо модификациями гистонов, либо комбинированным метилированием ДНК и модификацией гистонов.

мРНК

В 2011 году было показано , что метилирование в мРНК играет важную роль в человеческой энергии гомеостаза . Показано, что ген FTO, связанный с ожирением, способен деметилировать N6-метиладенозин в РНК.

мРНК

мРНК представляют собой небольшие (50–250 нуклеотидов) высокоструктурированные некодирующие фрагменты РНК, обнаруженные у бактерий. Они контролируют экспрессию генов, включая гены вирулентности в патогенах, и рассматриваются как новые мишени в борьбе с устойчивыми к лекарствам бактериями. Они играют важную роль во многих биологических процессах, связываясь с мРНК и белками-мишенями у прокариот. Их филогенетический анализ, например, с помощью взаимодействий мРНК-мишеней или свойств связывания белков , используется для создания всеобъемлющих баз данных. Также строятся карты мРНК- генов на основе их мишеней в микробных геномах.

Прионы

Прионы - это инфекционные формы белков . В общем, белки складываются в дискретные единицы, которые выполняют различные клеточные функции, но некоторые белки также способны формировать инфекционное конформационное состояние, известное как прион. Хотя прионы часто рассматриваются в контексте инфекционного заболевания , прионы более свободно определяются по их способности каталитически преобразовывать другие версии того же белка в нативном состоянии в инфекционное конформационное состояние. Именно в этом последнем смысле их можно рассматривать как эпигенетические агенты, способные вызывать фенотипические изменения без модификации генома.

Некоторые считают, что прионы грибов являются эпигенетическими, поскольку инфекционный фенотип, вызываемый прионом, может быть унаследован без модификации генома. PSI + и URE3, обнаруженные у дрожжей в 1965 и 1971 годах, являются двумя наиболее изученными прионами этого типа. Прионы могут иметь фенотипический эффект за счет секвестрации белка в агрегатах, тем самым снижая активность этого белка. В клетках PSI + потеря белка Sup35 (который участвует в прекращении трансляции) приводит к тому, что рибосомы имеют более высокую скорость считывания стоп- кодонов , что приводит к подавлению бессмысленных мутаций в других генах. Способность Sup35 образовывать прионы может быть консервативным признаком. Это может дать адаптивное преимущество, давая клеткам возможность переключаться в состояние PSI + и выражать неактивные генетические особенности, которые обычно прекращаются мутациями стоп-кодонов.

Эпигенетика на основе прионов также наблюдалась у Saccharomyces cerevisiae .

Структурное наследование

У инфузорий, таких как Tetrahymena и Paramecium , генетически идентичные клетки обнаруживают наследственные различия в строении рядов ресничек на их клеточной поверхности. Измененные экспериментально паттерны могут передаваться дочерним клеткам. Кажется, что существующие структуры действуют как шаблоны для новых структур. Механизмы такого наследования неясны, но есть основания предполагать, что многоклеточные организмы также используют существующие клеточные структуры для сборки новых.

Расположение нуклеосом

Геномы эукариот содержат множество нуклеосом . Положение нуклеосом не является случайным и определяет доступность ДНК для регуляторных белков. Было показано, что промоторы, активные в разных тканях, имеют разные особенности позиционирования нуклеосом. Это определяет различия в экспрессии генов и дифференцировке клеток. Было показано, что по крайней мере некоторые нуклеосомы сохраняются в сперматозоидах (где большая часть, но не все гистоны заменены протаминами ). Таким образом, расположение нуклеосом в некоторой степени наследуется. Недавние исследования выявили связь между позиционированием нуклеосом и другими эпигенетическими факторами, такими как метилирование ДНК и гидроксиметилирование.

Варианты гистонов

Различные варианты гистонов включаются в определенные области генома неслучайно. Их дифференциальные биохимические характеристики могут влиять на функции генома через их роль в регуляции генов и поддержании структур хромосом.

Геномная архитектура

Трехмерная конфигурация генома (3D-геном) сложна, динамична и имеет решающее значение для регулирования геномной функции и ядерных процессов, таких как репликация ДНК, транскрипция и восстановление повреждений ДНК.

Функции и последствия

Разработка

Эпигенетику развития можно разделить на предопределенный и вероятностный эпигенез. Предопределенный эпигенез - это однонаправленное движение от структурного развития ДНК к функциональному созреванию белка. «Предопределенный» здесь означает, что разработка ведется по сценарию и предсказуема. С другой стороны, вероятностный эпигенез - это двунаправленное структурно-функциональное развитие с развитием опыта и внешнего формирования.

Соматическое эпигенетическое наследование, в частности, посредством ковалентных модификаций ДНК и гистонов и репозиции нуклеосом , очень важно в развитии многоклеточных эукариотических организмов. Последовательность генома статична (за некоторыми заметными исключениями), но клетки дифференцируются на множество разных типов, которые выполняют разные функции и по-разному реагируют на окружающую среду и межклеточную передачу сигналов. Таким образом, по мере развития индивидов морфогены активируют или заглушают гены эпигенетически наследуемым образом, давая клеткам память. У млекопитающих большинство клеток терминально дифференцируются, и только стволовые клетки сохраняют способность дифференцироваться на несколько типов клеток («тотипотентность» и «мультипотентность»). У млекопитающих некоторые стволовые клетки продолжают продуцировать вновь дифференцированные клетки на протяжении всей жизни, например, в нейрогенезе , но млекопитающие не способны реагировать на потерю некоторых тканей, например неспособность регенерировать конечности, на которую способны некоторые другие животные. Эпигенетические модификации регулируют переход от нервных стволовых клеток к глиальным клеткам-предшественникам (например, дифференцировка в олигодендроциты регулируется деацетилированием и метилированием гистонов. В отличие от животных, растительные клетки не дифференцируются окончательно, оставаясь тотипотентными со способностью вызывать новое отдельное растение. Хотя растения действительно используют многие из тех же эпигенетических механизмов, что и животные, такие как ремоделирование хроматина , была выдвинута гипотеза, что некоторые виды растительных клеток не используют или не требуют «клеточной памяти», сбрасывая паттерны экспрессии генов с использованием позиционной информации из окружающей среды и окружающих клеток, чтобы определить их судьбу.

Эпигенетические изменения могут происходить в ответ на воздействие окружающей среды - например, пищевые добавки матери с генистеином (250 мг / кг) имеют эпигенетические изменения, влияющие на экспрессию гена агути , который влияет на цвет их шерсти, вес и склонность к развитию рака. Текущие исследования сосредоточены на изучении влияния других известных тератогенов , таких как диабетическая эмбриопатия , на сигнатуры метилирования .

Противоречивые результаты одного исследования показали, что травматический опыт может вызвать эпигенетический сигнал, который может быть передан будущим поколениям. Мышей учили, используя удары ногами, бояться запаха цветков сакуры. Исследователи сообщили, что потомство мышей испытывало повышенное отвращение к этому специфическому запаху. Они предложили эпигенетические изменения, которые увеличивают экспрессию гена, а не в самой ДНК, в гене M71, который управляет функционированием рецептора запаха в носу, который специфически реагирует на запах цветков сакуры. Были физические изменения, которые коррелировали с обонятельной функцией мозга обученных мышей и их потомков. Сообщалось о нескольких критических замечаниях, в том числе о низкой статистической мощности исследования как свидетельстве некоторых нарушений, таких как предвзятость в представлении результатов. Из-за ограничений размера выборки существует вероятность того, что эффект не будет продемонстрирован в пределах статистической значимости, даже если он существует. Критика показала, что вероятность того, что все описанные эксперименты дадут положительные результаты, если будет соблюдаться идентичный протокол, при условии, что заявленные эффекты существуют, составляет всего 0,4%. Авторы также не указали, какие мыши были братьями и сестрами, и рассматривали всех мышей как статистически независимых. Первоначальные исследователи указали отрицательные результаты в приложении к статье, которые критика не учла в своих расчетах, и взяли на себя обязательство отслеживать, какие мыши были братьями и сестрами в будущем.

Трансгенерационный

Эпигенетические механизмы были необходимой частью эволюционного происхождения дифференцировки клеток . Хотя обычно считается, что эпигенетика многоклеточных организмов является механизмом, вовлеченным в дифференциацию, с эпигенетическими паттернами, «сбрасываемыми» при воспроизводстве организмов, были некоторые наблюдения трансгенерационного эпигенетического наследования (например, феномен парамутации, наблюдаемый у кукурузы ). Хотя большинство этих эпигенетических черт нескольких поколений постепенно утрачиваются в течение нескольких поколений, остается возможность, что эпигенетика нескольких поколений может быть еще одним аспектом эволюции и адаптации. Как упоминалось выше, некоторые определяют эпигенетику как наследственную.

Изолированная зародышевая линия или барьер Вейсмана специфичны для животных, а эпигенетическая наследственность чаще встречается у растений и микробов. Ева Яблонка , Мэрион Дж. Лэмб и Этьен Данчен утверждали, что эти эффекты могут потребовать усовершенствования стандартной концептуальной основы современного синтеза, и призвали к расширенному эволюционному синтезу . Другие эволюционные биологи, такие как Джон Мейнард Смит , включили эпигенетическое наследование в модели популяционной генетики или открыто скептически относятся к расширенному эволюционному синтезу ( Майкл Линч ). Томас Дикинс и Кази Рахман заявляют, что эпигенетические механизмы, такие как метилирование ДНК и модификация гистонов, наследуются генетически под контролем естественного отбора и, следовательно, соответствуют более раннему «современному синтезу» .

Два важных аспекта, по которым эпигенетическое наследование может отличаться от традиционного генетического наследования с важными последствиями для эволюции:

  • скорость эпимутации может быть намного выше, чем скорость мутации
  • эпимутации более обратимы

У растений вероятность возникновения наследственных мутаций метилирования ДНК в 100 000 раз выше, чем у мутаций ДНК. Эпигенетически унаследованный элемент, такой как система PSI + , может действовать как «временная остановка», достаточно хорошая для краткосрочной адаптации, которая позволяет клону выживать достаточно долго, чтобы мутация и / или рекомбинация генетически ассимилировали адаптивные фенотипические изменения. Наличие такой возможности увеличивает эволюционируемость вида.

Сообщалось о более чем 100 случаях феномена трансгенеративного эпигенетического наследования у широкого круга организмов, включая прокариот, растений и животных. Например, бабочки в траурном плаще меняют цвет из-за гормональных изменений в ответ на эксперименты с изменяющейся температурой.

Нитчатый гриб Neurospora crassa - выдающаяся модельная система для понимания контроля и функции метилирования цитозина. В этом организме метилирование ДНК связано с реликтами системы защиты генома, называемой RIP (точечная мутация, индуцированная повтором), и подавляет экспрессию генов, подавляя элонгацию транскрипции.

Дрожжевой прион PSI порождается изменение конформации фактора терминации трансляции, который затем унаследованного дочерними клетками. Это может обеспечить преимущество выживания в неблагоприятных условиях, например, эпигенетическая регуляция, которая позволяет одноклеточным организмам быстро реагировать на стресс окружающей среды. Прионы можно рассматривать как эпигенетические агенты, способные вызывать фенотипические изменения без модификации генома.

Прямое обнаружение эпигенетических меток в микроорганизмах возможно с помощью секвенирования отдельной молекулы в реальном времени , при котором чувствительность к полимеразе позволяет измерять метилирование и другие модификации по мере секвенирования молекулы ДНК. Несколько проектов продемонстрировали возможность сбора эпигенетических данных по всему геному бактерий.

Эпигенетика у бактерий

Бактерии кишечной палочки

Хотя эпигенетика имеет фундаментальное значение для эукариот , особенно многоклеточных , у бактерий она играет иную роль. Что наиболее важно, эукариоты используют эпигенетические механизмы, прежде всего, для регулирования экспрессии генов, что у бактерий бывает редко. Однако бактерии широко используют пострепликативное метилирование ДНК для эпигенетического контроля взаимодействий ДНК-белок. Бактерии также используют метилирование аденина ДНК (а не метилирование цитозина ДНК ) в качестве эпигенетического сигнала. Метилирование аденина ДНК важно для вирулентности бактерий в таких организмах, как Escherichia coli , Salmonella , Vibrio , Yersinia , Haemophilus и Brucella . У Alphaproteobacteria метилирование аденина регулирует клеточный цикл и связывает транскрипцию гена с репликацией ДНК. У Gammaproteobacteria метилирование аденина обеспечивает сигналы для репликации ДНК, сегрегации хромосом, восстановления несоответствия, упаковки бактериофага, активности транспозаз и регуляции экспрессии генов. Существует генетический переключатель, контролирующий Streptococcus pneumoniae (пневмококк), который позволяет бактерии случайным образом изменять свои характеристики до шести альтернативных состояний, которые могут проложить путь к улучшенным вакцинам. Каждая форма случайным образом генерируется системой метилирования с переменной фазой. Способность пневмококка вызывать смертельные инфекции различна в каждом из этих шести состояний. Подобные системы существуют и у других родов бактерий. У Firmicutes, такого как Clostridioides difficile , метилирование аденина регулирует споруляцию , образование биопленок и адаптацию хозяина.

Медицина

Эпигенетика имеет множество разнообразных потенциальных медицинских применений. В 2008 году Национальный институт здоровья объявил, что на исследования эпигенетики в течение следующих пяти лет было выделено 190 миллионов долларов. Объявляя о финансировании, правительственные чиновники отметили, что эпигенетика может объяснить механизмы старения, человеческого развития и происхождение рака, болезней сердца, психических заболеваний, а также ряда других состояний. Некоторые исследователи, такие как Рэнди Джиртл , доктор философии из Медицинского центра Университета Дьюка, считают, что в конечном итоге эпигенетика может играть более важную роль в болезнях, чем генетика.

Двойняшки

Прямые сравнения однояйцевых близнецов представляют собой оптимальную модель для исследования эпигенетики окружающей среды. В случае людей с различным воздействием окружающей среды монозиготные (однояйцевые) близнецы были эпигенетически неотличимы в ранние годы, в то время как у старших близнецов были заметные различия в общем содержании и геномном распределении ДНК 5-метилцитозина и ацетилировании гистонов. Пары близнецов, которые провели вместе меньше времени и / или имели большие различия в истории болезни, были теми, кто показал самые большие различия в уровнях ДНК 5-метилцитозина и ацетилировании гистонов H3 и H4.

Дизиготные (разнояйцевые) и монозиготные (идентичные) близнецы демонстрируют доказательства эпигенетического влияния на людей. Различия в последовательностях ДНК, которых было бы много в одноэлементном исследовании, не мешают анализу. Различия в окружающей среде могут вызывать долгосрочные эпигенетические эффекты, и разные подтипы монозиготных близнецов в процессе развития могут различаться в отношении их восприимчивости к дискордантности с эпигенетической точки зрения.

Высокопроизводительное исследование, которое обозначает технологию, которая рассматривает обширные генетические маркеры, сосредоточено на эпигенетических различиях между монозиготными близнецами для сравнения глобальных и локус-специфичных изменений метилирования ДНК и модификаций гистонов в образце из 40 пар монозиготных близнецов. В данном случае изучались только здоровые пары близнецов, но был представлен широкий диапазон возрастов от 3 до 74 лет. Одним из основных выводов этого исследования было то, что существует возрастное накопление эпигенетических различий между двумя братьями и сестрами пар близнецов. Это накопление свидетельствует о существовании эпигенетического «дрейфа». Эпигенетический дрейф - это термин, используемый для эпигенетических модификаций, поскольку они происходят как прямая функция с возрастом. Хотя возраст является известным фактором риска для многих заболеваний, было обнаружено, что возрастное метилирование по-разному происходит на определенных участках генома. Со временем это может привести к измеримым различиям между биологическим и хронологическим возрастом. Было обнаружено, что эпигенетические изменения отражают образ жизни и могут действовать как функциональные биомаркеры заболевания до достижения клинического порога.

Более недавнее исследование, в котором 114 монозиготных близнецов и 80 дизиготных близнецов были проанализированы на предмет статуса метилирования ДНК примерно 6000 уникальных геномных областей, пришло к выводу, что эпигенетическое сходство во время расщепления бластоцисты может также вносить вклад в фенотипическое сходство у монозиготных близнецов. Это подтверждает представление о том, что микросреда на ранних стадиях эмбрионального развития может быть очень важной для установления эпигенетических меток. Врожденное генетическое заболевание хорошо понятно и ясно , что эпигенетика может играть определенную роль, например, в случае Angelman синдрома и синдрома Прадера-Вилли . Это нормальные генетические заболевания, вызванные делециями генов или инактивацией генов, но они необычно распространены, потому что люди по существу гемизиготны из-за геномного импринтинга , и поэтому нокаут одного гена достаточно, чтобы вызвать заболевание, где в большинстве случаев требуется, чтобы обе копии были быть выбитым.

Геномный импринтинг

Некоторые заболевания человека связаны с геномным импринтингом - феноменом у млекопитающих, когда отец и мать вносят разные эпигенетические паттерны для конкретных геномных локусов в своих половых клетках . Самым известным случаем импринтинга при заболеваниях человека является синдром Ангельмана и синдром Прадера-Вилли - оба могут быть вызваны одной и той же генетической мутацией, частичной делецией хромосомы 15q , и конкретный синдром, который будет развиваться, зависит от того, наследуется ли мутация. от матери ребенка или от отца. Это связано с наличием геномного импринтинга в регионе. Синдром Беквита-Видемана также связан с геномным импринтингом, часто вызываемым аномалиями материнского геномного импринтинга области на хромосоме 11.

Метил-CpG-связывающий белок 2 ( MeCP2 ) является регулятором транскрипции, который должен быть фосфорилирован перед высвобождением из промотора BDNF для обеспечения транскрипции. В основе синдрома Ретта лежат мутации в гене MeCP2, несмотря на то, что при анализе микрочипов не было обнаружено крупномасштабных изменений в экспрессии MeCP2. BDNF подавляется в мутанте MECP2, что приводит к синдрому Ретта, а также к увеличению раннего нервного старения и накоплению поврежденной ДНК.

В исследовании Överkalix , внуки по отцовской (но не по материнской) линии шведских мужчин, которые в XIX веке подверглись голоду в раннем подростковом возрасте, с меньшей вероятностью умирали от сердечно-сосудистых заболеваний. Если еды было много, то смертность от диабета у внуков возрастала, что позволяет предположить, что это эпигенетическая наследственность между поколениями. Противоположный эффект наблюдался у женщин - внучки по отцовской (но не по материнской) линии женщин, которые пережили голод в утробе матери (и, следовательно, во время формирования их яиц), в среднем жили короче.

Рак

При разных типах рака могут нарушаться различные эпигенетические механизмы. Эпигенетические изменения генов репарации ДНК или генов, контролирующих клеточный цикл, очень часто встречаются при спорадических формах рака (не зародышевой линии), значительно чаще, чем мутации зародышевой линии (семейные) при этих спорадических формах рака. Эпигенетические изменения важны для трансформации клеток в рак, и их манипуляции открывают большие перспективы для профилактики, обнаружения и лечения рака. При некоторых из этих заболеваний используются несколько лекарств, обладающих эпигенетическим действием. Эти аспекты эпигенетики рассматриваются в эпигенетике рака .

Заживление диабетических ран

Эпигенетические модификации позволили лучше понять патофизиологию различных болезненных состояний. Хотя они тесно связаны с раком, их роль в других патологических состояниях не менее важна. Похоже, что гипергликемическая среда может запечатлеть такие изменения на геномном уровне, что макрофаги ориентированы на провоспалительное состояние и могут не проявлять каких-либо фенотипических изменений в сторону про-заживляющего типа. Этот феномен измененной поляризации макрофагов в основном связан со всеми диабетическими осложнениями в клинических условиях. По состоянию на 2018 год несколько отчетов показывают актуальность различных эпигенетических модификаций в отношении диабетических осложнений. Рано или поздно, с развитием биомедицинских инструментов, обнаружение таких биомаркеров в качестве прогностических и диагностических инструментов у пациентов может стать альтернативным подходом. Здесь следует отметить, что использование эпигенетических модификаций в качестве терапевтических целей требует обширных доклинических, а также клинических оценок перед использованием.

Примеры лекарств, изменяющих экспрессию генов в результате эпигенетических событий

Использование бета-лактамных антибиотиков может изменить активность рецептора глутамата и действие циклоспорина на несколько факторов транскрипции. Кроме того, литий может влиять на аутофагию аберрантных белков, а опиоидные препараты при хроническом употреблении могут увеличивать экспрессию генов, связанных с аддиктивными фенотипами.

Психология и психиатрия

Стресс в раннем возрасте

В новаторском отчете 2003 года Каспи и его коллеги продемонстрировали, что в устойчивой когорте из более чем тысячи субъектов, многократно оцениваемых от дошкольного до взрослого возраста, субъекты, несущие одну или две копии короткого аллеля полиморфизма промотора серотонинового переносчика, демонстрировали более высокие показатели депрессия и суицидальность у взрослых при жестоком обращении в детстве по сравнению с гомозиготами с длинным аллелем с равным воздействием ELS.

Питание родителей, внутриутробное воздействие стресса или химических веществ , нарушающих работу эндокринной системы , вызванные мужчинами материнские эффекты, такие как привлекательность различного качества партнера, материнский и отцовский возраст, а также пол потомства - все это может повлиять на то, будет ли эпимутация зародышевой линии в конечном итоге выражаться в потомство и степень, в которой наследование от поколения к поколению остается стабильным на протяжении всего потомства. Однако остается неясным, могут ли эпигенетические эффекты передаваться из поколения в поколение и в какой степени, особенно у людей.

Зависимость

Зависимость - это нарушение системы вознаграждения мозга, которое возникает через транскрипционные и нейроэпигенетические механизмы и возникает с течением времени из-за хронически высоких уровней воздействия вызывающего привыкание стимула (например, морфина, кокаина, полового акта, азартных игр и т. Д.). В доклинических исследованиях отмечается трансгендерное эпигенетическое наследование аддиктивных фенотипов . Однако надежных доказательств в поддержку стойкости эпигенетических эффектов на протяжении нескольких поколений у людей еще предстоит; например, эпигенетический эффект пренатального воздействия курения, наблюдаемый у правнуков, которые не подвергались воздействию табака.

Тем временем, однако, накапливаются доказательства того, что употребление каннабиса матерями во время - а также обоими родителями до - беременности приводит к эпигенетическим изменениям у новорожденных, которые, как известно, связаны с повышенным риском развития психических расстройств позже во время их беременности. жизни, такие как аутизм , СДВГ , шизофрения , аддиктивное поведение и другие.

Депрессия

Об эпигенетическом наследовании фенотипов, связанных с депрессией, также сообщалось в доклиническом исследовании. Наследование отцовских признаков, вызванных стрессом, от поколения к поколению связано с небольшими некодирующими сигналами РНК, передаваемыми через отцовскую зародышевую линию.

Исследовать

Две формы наследуемой информации, а именно генетическая и эпигенетическая, в совокупности обозначаются как двойное наследование. Члены APOBEC / AID семейства цитозина дезаминаз могут одновременно влиять на генетическое и эпигенетическое наследование с использованием аналогичных молекулярных механизмов, и могут быть точкой перекрестных помех между этими концептуально разобщенными процессами.

Фторхинолоновые антибиотики вызывают эпигенетические изменения в клетках млекопитающих за счет хелатирования железа . Это приводит к эпигенетическим эффектам за счет ингибирования зависимых от α-кетоглутарата диоксигеназ , которым в качестве сопутствующего фактора требуется железо .

Для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) или поддержания фенотипа эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с помощью эпигенетического подхода применяются различные фармакологические агенты. Взрослые стволовые клетки, такие как стволовые клетки костного мозга, также продемонстрировали способность дифференцироваться в компетентные клетки сердца при обработке ингибитором гистон-метилтрансферазы G9a BIX01294.

Лженаука

Поскольку эпигенетика как наука находится на ранних стадиях развития и окружена сенсациями в средствах массовой информации, Дэвид Горски и генетик Адам Резерфорд рекомендовали проявлять осторожность в отношении распространения ложных и псевдонаучных выводов авторов нового века, делающих необоснованные предположения о том, что гены человека и здоровьем можно управлять, контролируя разум . Неправильное использование научного термина авторами-шарлатанами привело к дезинформации среди широкой публики.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

  • Хак Ф. Н., Готтесман II, Вонг А. Х. (май 2009 г.). «Не совсем идентичны: эпигенетические различия у монозиготных близнецов и значение для исследований близнецов в психиатрии». Американский журнал медицинской генетики. Часть C, Семинары по медицинской генетике . 151С (2): 136–41. DOI : 10.1002 / ajmg.c.30206 . PMID  19378334 . S2CID  205327825 .

внешние ссылки