Ингибитор фермента -Enzyme inhibitor

Вверху: фермент (E) ускоряет превращение субстратов (S) в продукты (P). Внизу: связываясь с ферментом, ингибитор (I) блокирует связывание субстрата. Сайт связывания показан синим в шахматном порядке, субстрат - черным прямоугольником, а ингибитор - зеленым прямоугольником со скругленными углами.

Ингибитор фермента представляет собой молекулу , которая связывается с ферментом и блокирует его активность . Ферменты — белки , ускоряющие необходимые для жизни химические реакции , в которых молекулы субстрата превращаются в продукты . Фермент способствует протеканию специфической химической реакции, связывая субстрат со своим активным центром , специализированной областью фермента, которая ускоряет наиболее трудную стадию реакции .

Ингибитор фермента останавливает («ингибирует») этот процесс, либо связываясь с активным центром фермента (таким образом предотвращая связывание самого субстрата), либо связываясь с другим сайтом фермента, так что катализ реакции ферментом блокируется . Ингибиторы ферментов могут связываться обратимо или необратимо. Необратимые ингибиторы образуют химическую связь с ферментом, так что фермент ингибируется до тех пор, пока химическая связь не разорвется. Напротив, обратимые ингибиторы связываются нековалентно и могут спонтанно покидать фермент, позволяя ферменту возобновить свою функцию. Обратимые ингибиторы вызывают различные типы ингибирования в зависимости от того, связываются ли они с ферментом, комплексом фермент-субстрат или с тем и другим.

Ингибиторы ферментов играют важную роль во всех клетках, поскольку каждый из них обычно специфичен для одного фермента и служит для контроля активности этого фермента. Например, ферменты в метаболическом пути могут ингибироваться молекулами, образующимися позже в этом пути, что ограничивает производство молекул, которые больше не нужны. Этот тип отрицательной обратной связи является важным способом поддержания баланса в клетке . Ингибиторы ферментов также контролируют основные ферменты, такие как протеазы или нуклеазы , которые, если их не остановить, могут повредить клетку. Многие яды, вырабатываемые животными или растениями, являются ингибиторами ферментов, которые блокируют активность важнейших ферментов у добычи или хищника .

Многие лекарственные молекулы являются ингибиторами ферментов, которые ингибируют аномальный человеческий фермент или фермент, критически важный для выживания патогена, такого как вирус , бактерия или паразит . Примеры включают метотрексат (используемый в химиотерапии и при лечении ревматического артрита ) и ингибиторы протеазы, используемые для лечения ВИЧ/СПИДа . Поскольку ингибиторы антипатогенов обычно нацелены только на один фермент, такие лекарства являются высокоспецифичными и обычно вызывают мало побочных эффектов у людей, при условии, что у людей не обнаружен аналогичный фермент. (Это часто имеет место, поскольку такие патогены и люди генетически далеки друг от друга . ) Медицинские ингибиторы ферментов часто имеют низкие константы диссоциации , а это означает, что для ингибирования фермента требуется лишь незначительное количество ингибитора. Низкая концентрация ингибитора фермента снижает риск поражения печени и почек и других побочных реакций на лекарственные средства у человека. Поэтому открытие и усовершенствование ингибиторов ферментов является активной областью исследований в области биохимии и фармакологии .

Структурные классы

Ингибиторы ферментов представляют собой химически разнообразный набор веществ, размеры которых варьируются от небольших органических молекул до макромолекулярных белков .

Низкомолекулярные ингибиторы включают основные первичные метаболиты , которые ингибируют предшествующие ферменты, производящие эти метаболиты. Это обеспечивает петлю отрицательной обратной связи, которая предотвращает перепроизводство метаболитов и, таким образом, поддерживает клеточный гомеостаз (стабильные внутренние условия). Низкомолекулярные ингибиторы ферментов также включают вторичные метаболиты , которые не являются необходимыми для организма, который их производит, но дают организму эволюционное преимущество, поскольку их можно использовать для отпугивания хищников или конкурирующих организмов или обездвиживания добычи. Кроме того, многие лекарства представляют собой низкомолекулярные ингибиторы ферментов, нацеленные либо на модифицирующие болезнь ферменты у пациента, либо на ферменты патогенов, которые необходимы для роста и размножения патогена.

Помимо небольших молекул, некоторые белки действуют как ингибиторы ферментов. Наиболее ярким примером являются серпины ( ингибиторы сериновых протеаз ), которые вырабатываются животными для защиты от ненадлежащей активации ферментов и растениями для предотвращения нападения хищников . Другой класс белков-ингибиторов — это ингибиторы рибонуклеаз , которые связываются с рибонуклеазами в одном из самых тесных известных белок-белковых взаимодействий . Частным случаем белковых ингибиторов ферментов являются зимогены , содержащие аутоингибиторный N-концевой пептид, который связывается с активным центром фермента и внутримолекулярно блокирует его активность в качестве защитного механизма от неконтролируемого катализа. N-концевой пептид отщепляется (расщепляется) от предшественника фермента зимогена другим ферментом с высвобождением активного фермента.

Сайт связывания ингибиторов ферментов чаще всего является тем же сайтом, который связывает субстрат фермента . Эти ингибиторы активного центра известны как ортостерические («регулярной» ориентации) ингибиторы. Механизм ортостерического ингибирования заключается в простом предотвращении связывания субстрата с ферментом посредством прямой конкуренции, что, в свою очередь, не позволяет ферменту катализировать превращение субстрата в продукты. Альтернативно, ингибитор может связываться с сайтом, удаленным от активного сайта фермента. Они известны как аллостерические («альтернативной» ориентации) ингибиторы. Механизмы аллостерического ингибирования разнообразны и включают изменение конформации ( формы) фермента таким образом, что он больше не может связывать субстрат ( кинетически неотличимый от конкурентного ортостерического ингибирования), или, альтернативно, стабилизирует связывание субстрата с ферментом, но фиксирует фермент в конформации. который уже не является каталитически активным.

Обратимые ингибиторы

Схема механизма торможения

Кинетические механизмы обратимого торможения. Связывание субстрата (S) с ферментом (E) выделено синим цветом, продукт катализа (P) выделен красным, связывание ингибитора (I) с ферментом выделено зеленым цветом.

Схема обратимого ингибирования. Сайт связывания показан синим цветом, субстрат - черным, ингибитор - зеленым, а аллостерический сайт - светло-зеленым.

Конкурентные ингибиторы обычно связываются с активным центром. Неконкурентное связывание с удаленным (аллостерическим) сайтом. Неконкурентные ингибиторы связываются только после связывания субстрата, полностью нарушая катализ, а смешанное ингибирование аналогично, но с частичным нарушением катализа.

Обратимые ингибиторы присоединяются к ферментам с помощью нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи , гидрофобные взаимодействия и ионные связи . Множественные слабые связи между ингибитором и активным центром фермента объединяются, чтобы обеспечить сильное и специфическое связывание.

В отличие от необратимых ингибиторов, обратимые ингибиторы обычно не вступают в химические реакции при связывании с ферментом и могут быть легко удалены путем разбавления или диализа . Особым случаем являются ковалентные обратимые ингибиторы , которые образуют химическую связь с ферментом, но эта связь может быть расщеплена, так что ингибирование становится полностью обратимым.

Обратимые ингибиторы обычно подразделяются на четыре типа, введенные Клеландом в 1963 г. Они классифицируются в соответствии с влиянием ингибитора на V _max (максимальная скорость реакции, катализируемая ферментом) и K _m (концентрация субстрата, приводящая к уменьшению вдвое максимальная активность фермента) при изменении концентрации субстрата фермента.

Конкурентоспособный

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор не могут одновременно связываться с ферментом. Обычно это происходит из-за того, что ингибитор обладает сродством к активному центру фермента, где также связывается субстрат; субстрат и ингибитор конкурируют за доступ к активному центру фермента. Преодолеть этот тип ингибирования можно при достаточно высоких концентрациях субстрата ( Vmax остается постоянной), _т . е. за счет вытеснения ингибитора. Однако кажущаяся K _m будет увеличиваться, поскольку для достижения точки K _m требуется более высокая концентрация субстрата , или половина V _max . Конкурентные ингибиторы часто схожи по структуре с реальным субстратом (см., например, рисунок «Метотрексат против фолиевой кислоты» в разделе «Лекарства» ).

Неконкурентоспособный

При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом. Этот тип ингибирования вызывает снижение V _max (максимальная скорость уменьшается в результате удаления активированного комплекса) и K _m уменьшается (из-за лучшей эффективности связывания в результате действия принципа Ле-Шателье и эффективного удаления комплекса ES, что снижает K _m , что указывает на более высокую аффинность связывания). Неконкурентное ингибирование встречается редко.

Внеконкурсный

При неконкурентном ингибировании связывание ингибитора с ферментом снижает его активность , но не влияет на связывание субстрата. В результате степень ингибирования зависит только от концентрации ингибитора. V _max уменьшится из-за неспособности реакции протекать столь же эффективно, но K _m останется прежним, так как фактическое связывание субстрата, по определению, все еще будет функционировать должным образом.

Смешанный

При смешанном ингибировании ингибитор может связываться с ферментом независимо от того, уже связан субстрат или нет. Следовательно, смешанное торможение представляет собой сочетание конкурентного и неконкурентного торможения. Кроме того, сродство ингибитора к свободному ферменту и комплексу фермент-субстрат может различаться. При увеличении концентрации субстрата [S] этот тип ингибирования может быть снижен (за счет конкурентного вклада), но не преодолен полностью (за счет неконкурентного компонента). Хотя ингибиторы смешанного типа могут связываться в активном центре, этот тип ингибирования обычно возникает в результате аллостерического эффекта , когда ингибитор связывается с другим центром фермента. Связывание ингибитора с этим аллостерическим сайтом изменяет конформацию (то есть третичную структуру или трехмерную форму) фермента, так что сродство субстрата к активному сайту снижается.

Эти четыре типа ингибирования также можно различить по влиянию увеличения концентрации субстрата [S] на степень ингибирования, вызываемого данным количеством ингибитора. При конкурентном торможении степень торможения снижается при увеличении [S], при неконкурентном торможении степень торможения не изменяется, а при неконкурентном (называемом также антиконкурентным) торможении степень торможения увеличивается при увеличении [S].

Количественное описание

Обратимое ингибирование можно количественно описать с точки зрения связывания ингибитора с ферментом и комплексом фермент-субстрат и его влияния на кинетические константы фермента. В классической схеме Михаэлиса-Ментен (показанной на диаграмме «схема механизма ингибирования») фермент (E) связывается со своим субстратом (S) с образованием фермент-субстратного комплекса ES. При катализе этот комплекс распадается с высвобождением продукта P и свободного фермента. Ингибитор (I) может связываться либо с E, либо с ES с константами диссоциации K _i или K _i ' соответственно.

• Конкурентные ингибиторы могут связываться с E, но не с ES. Конкурентное ингибирование увеличивает K _m (т. е. ингибитор препятствует связыванию субстрата), но не влияет на V _max (ингибитор не препятствует катализу в ЭС, поскольку не может связываться с ЭС).
• Неконкурентные ингибиторы связываются с ES. Неконкурентное ингибирование снижает K _m и V _max . Ингибитор влияет на связывание субстрата, увеличивая сродство фермента к субстрату (уменьшая K _m ), а также препятствуя катализу (уменьшая V _max ).
• Неконкурентные ингибиторы имеют одинаковое сродство к E и ES ( K _i = K _i '). Неконкурентное ингибирование не изменяет K _m (т. е. не влияет на связывание субстрата), но снижает V _max (т. е. связывание ингибитора затрудняет катализ).
• Ингибиторы смешанного типа связываются как с E, так и с ES, но их сродство к этим двум формам фермента различно ( K _i ≠ K _i '). Таким образом, ингибиторы смешанного типа влияют на связывание субстрата (увеличение или уменьшение K _m ) и затрудняют катализ в комплексе ES (уменьшение V _max ).

Когда фермент имеет несколько субстратов, ингибиторы могут проявлять различные типы ингибирования в зависимости от того, какой субстрат рассматривается. Это происходит из-за того, что активный центр содержит два разных сайта связывания внутри активного сайта, по одному для каждого субстрата. Например, ингибитор может конкурировать с субстратом А за первый сайт связывания, но быть неконкурентным ингибитором по отношению к субстрату В за второй сайт связывания.

Традиционно обратимые ингибиторы ферментов классифицируют как конкурентные, неконкурентные или неконкурентные в зависимости от их влияния на K _m и V _max . Эти три типа ингибирования являются результатом соответственно связывания ингибитора только с ферментом Е в отсутствие субстрата S, с фермент-субстратным комплексом ES или с обоими. Разделение этих классов возникает из-за проблемы их вывода и приводит к необходимости использовать две разные константы привязки для одного события привязки. Далее предполагается, что связывание ингибитора с ферментом приводит к 100% ингибированию, и не учитывается возможность частичного ингибирования. Общая форма ингибирующего термина также скрывает связь между связыванием ингибитора с ферментом и его отношением к любому другому термину связывания, будь то уравнение Михаэлиса-Ментен или кривая доза-ответ, связанная со связыванием лиганда с рецептором. Чтобы продемонстрировать взаимосвязь, можно сделать следующую перестановку:

${\ displaystyle {\ begin {align} {\ cfrac {V _ {\ max}} {1 + {\ cfrac {\ ce {[I]}} {K_ {i}}}}} & = {V _ {\ max }} \ left ({\ cfrac {K_ {i}} {K_ {i} + [{\ ce {I}}]}} \ right) & & {\ text {умножить на}} {\ cfrac {K_ {i }}{K_{i}}}=1\\&={V_{\max}}\left({\cfrac {K_{i}+[{\ce {I}}]-[{\ce {I }}]}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}\right)&&{\text{добавить}}[{\ce {I}}]-[{\ce {I}} ] = 0 {\ text {к числителю}} \\ & = {V _ {\ max }} \ left (1 - {\ cfrac {[{\ ce {I}}]} {K_ {i} + [{\ ce {I}}]}} \ right) && {\ text {упростить}} {\ cfrac {K_ {i} + [{\ ce {I}}]} {K_ {i} + [{\ ce {I }}]}} = 1 \\ & = V _ {\ max } -V _ {\ max } {\ cfrac {\ ce {[I]}} {K_ {i} + [{\ ce {I}}]} }&&{\text{умножить на}}V_{\max}\end{выровнено}}}$

Эта перегруппировка демонстрирует, что, как и в уравнении Михаэлиса-Ментен, максимальная скорость реакции зависит от доли популяции фермента, взаимодействующей со своим субстратом.

доля популяции фермента, связанная субстратом

${\ displaystyle {\ cfrac {\ ce {[S]}} {[{\ ce {S}}] + K_ {m}}}}$

доля популяции фермента, связанная ингибитором

${\ displaystyle {\ cfrac {\ ce {[I]}} {[{\ ce {I}}] + K_ {i}}}}$

эффект ингибитора является результатом процента популяции ферментов, взаимодействующих с ингибитором. Единственная проблема с этим уравнением в его нынешнем виде заключается в том, что оно предполагает абсолютное ингибирование фермента при связывании ингибитора, тогда как на самом деле может быть широкий диапазон эффектов от 100% ингибирования оборота субстрата до отсутствия ингибирования. _{Чтобы учесть это ,} уравнение можно легко изменить, чтобы учесть различные степени ингибирования, включив в него член дельта Vmax .

${\ displaystyle V _ {\ max} - \ Delta V _ {\ max } {\ cfrac {\ ce {[I]}} {[{\ ce {I}}] + K_ {i}}}}$

или

${\ displaystyle V _ {\ max 1} - (V _ {\ max 1} -V _ {\ max 2}) {\ cfrac {\ ce {[I]}} {[{\ ce {I}}] + K_ { я}}}}$

Затем этот термин может определять остаточную ферментативную активность, присутствующую при взаимодействии ингибитора с отдельными ферментами в популяции. Однако включение этого члена имеет дополнительную ценность, поскольку допускает возможность активации, если вторичный член V _max окажется выше начального члена. Чтобы учесть возможность активации, обозначение можно затем переписать, заменив ингибитор «I» термином-модификатором (стимулятор или ингибитор), обозначенным здесь как «X».

${\ displaystyle V _ {\ max 1} - (V _ {\ max 1} -V _ {\ max 2}) {\ cfrac {\ ce {[X]}} {[{\ ce {X}}] + K_ { Икс}}}}$

Хотя эта терминология приводит к упрощенному способу рассмотрения кинетических эффектов, связанных с максимальной скоростью уравнения Михаэлиса-Ментен, она выдвигает на первый план потенциальные проблемы с термином, используемым для описания эффектов, связанных с K _m . K _m , относящийся к сродству фермента к субстрату, в большинстве случаев должен относиться к потенциальным изменениям в сайте связывания фермента, которые могут быть прямым результатом взаимодействия с ингибитором фермента . _{Поскольку такой термин ,} аналогичный термину дельта Vmax , предложенному выше для модуляции Vmax , должен быть уместным в большинстве ситуаций _:

${\ displaystyle K_ {m1} - (K_ {m1} -K_ {m2}) {\ cfrac {\ ce {[X]}} {[{\ ce {X}}] + K_ {x}}}}$

Константы диссоциации

Диаграммы Лайнуивера-Берка для различных типов обратимых ингибиторов ферментов. Стрелка показывает эффект увеличения концентрации ингибитора.

Ингибитор фермента характеризуется константой диссоциации K _i , концентрацией, при которой ингибитор занимает половину фермента. При неконкурентном ингибировании ингибитор также может связываться с фермент-субстратным комплексом, и присутствие связанного субстрата может изменить сродство ингибитора к ферменту, что приводит к второй константе диссоциации K _i '. Следовательно, K _i и K _i ' являются константами диссоциации ингибитора фермента и фермент-субстратного комплекса соответственно. Константа фермента-ингибитора K _i может быть измерена непосредственно различными методами; одним особенно точным методом является изотермическая титрационная калориметрия , при которой ингибитор титруется в раствор фермента и измеряется выделяемое или поглощаемое тепло. Однако другую константу диссоциации K _i ' трудно измерить напрямую, поскольку комплекс фермент-субстрат недолговечен и подвергается химической реакции с образованием продукта. Следовательно, K _i ' обычно измеряют косвенно, наблюдая за активностью фермента при различных концентрациях субстрата и ингибитора и подгоняя данные с помощью нелинейной регрессии к модифицированному уравнению Михаэлиса-Ментен .

${\ displaystyle V = {\ frac {V_ {max} [S]} {\ alpha K_ {m} + \ alpha ^ {\ prime} [S]}} = {\ frac {(1/\ alpha ^ {\ простое число})V_{max}[S]}{(\alpha /\alpha ^{\prime})K_{m}+[S]}}}$

где модифицирующие факторы α и α' определяются концентрацией ингибитора и двумя его константами диссоциации

${\ displaystyle \ alpha = 1 + {\ frac {[I]} {K_ {i}}}}$

${\ displaystyle \ alpha ^ {\ prime} = 1 + {\ frac {[I]} {K_ {i} ^ {\ prime}}}.}$

Таким образом, в присутствии ингибитора эффективные K _m и V _max фермента становятся (α/α') K _m и (1/α') V _max соответственно. Однако модифицированное уравнение Михаэлиса-Ментен предполагает, что связывание ингибитора с ферментом достигло равновесия, что может быть очень медленным процессом для ингибиторов с субнаномолярными константами диссоциации. В этих случаях ингибирование становится фактически необратимым, поэтому более практично рассматривать такие ингибиторы с сильной связью как необратимые (см. Ниже ).

Влияние различных типов обратимых ингибиторов ферментов на ферментативную активность можно визуализировать с помощью графических представлений уравнения Михаэлиса-Ментен, таких как графики Лайнуивера-Берка , Эди-Хофсти или Ханеса-Вульфа . Иллюстрацией служат три графика Лайнуивера-Берка, изображенные на рисунке диаграммы Лайнуивера-Берка . На верхней диаграмме линии конкурентного ингибирования пересекаются по оси ординат , показывая, что такие ингибиторы не влияют на V _max . На нижней диаграмме линии неконкурентного ингибирования пересекаются по оси x , показывая, что эти ингибиторы не влияют на K _m . Однако, поскольку по таким графикам может быть трудно точно оценить K _i и K _i ', рекомендуется оценивать эти константы с использованием более надежных методов нелинейной регрессии.

Особые случаи

Частично конкурентоспособный

Механизм частично конкурентного ингибирования аналогичен неконкурентному, за исключением того, что комплекс ЭИС обладает каталитической активностью, которая может быть ниже или даже выше (частично конкурентная активация), чем фермент-субстратный (ЭС) комплекс. Это ингибирование обычно показывает более низкое значение V _max , но не влияет на значение K _m .

Субстрат или продукт

Ингибирование субстратом или продуктом - это когда либо субстрат фермента, либо продукт также действуют как ингибитор. Это торможение может быть конкурентным, неконкурентным или смешанным. При ингибировании субстрата происходит постепенное снижение активности при высоких концентрациях субстрата, возможно, из-за фермента, имеющего два конкурирующих сайта связывания субстрата. При низком уровне субстрата сайт с высоким сродством занят, и наблюдается нормальная кинетика . Однако при более высоких концентрациях второй ингибирующий сайт становится занятым, что приводит к ингибированию фермента. Ингибирование продукта (либо собственного продукта фермента, либо продукта фермента ниже по течению в его метаболическом пути) часто является регуляторной особенностью метаболизма и может быть формой отрицательной обратной связи .

Медленно тайтовый

Медленно-плотное ингибирование происходит, когда исходный комплекс фермент-ингибитор EI подвергается конформационной изомерии (изменение формы) во второй, более прочно удерживаемый комплекс, EI*, но общий процесс ингибирования является обратимым. Это проявляется в медленно нарастающем ингибировании фермента. В этих условиях традиционная кинетика Михаэлиса-Ментен дает ложное значение K _i , которое зависит от времени. Истинное значение K _i может быть получено путем более сложного анализа констант скорости включения ( k _on ) и выключения ( k _off ) ассоциации ингибитора с кинетикой, сходной с необратимым ингибированием .

Многосубстратные аналоги

Ингибитор мультисубстратного аддукта TGDDF/GDDF. Аналог субстрата выделен черным, аналог кофактора выделен синим, нерасщепляемый линкер выделен красным.

Ингибитор протеазы ВИЧ-1 на основе пептидов ритонавир с сайтами связывания субстрата, расположенными в ферменте, обозначенном как S2, S1, S1' и S2'.

Непептидный ингибитор протеазы ВИЧ-1 типранавир

Мультисубстратные ингибиторы-аналоги представляют собой селективные ингибиторы с высоким сродством, которые можно приготовить для ферментов, катализирующих реакции с более чем одним субстратом, за счет захвата энергии связывания каждого из этих субстратов в одну молекулу. Например, в реакциях переноса формила при биосинтезе пуринов мощный мультисубстратный ингибитор аддукта (MAI) к глицинамидрибонуклеотидной (GAR) ТФазе был получен синтетическим путем соединения аналогов субстрата GAR и кофактора N-10-формилтетрагидрофолата вместе с продуцировать тиоглицинамидрибонуклеотиддидеазафолат (TGDDF) или ферментативно из природного субстрата GAR с получением GDDF. Здесь субнаномолярная константа диссоциации (KD) TGDDF была больше, чем предсказывалось, предположительно из-за полученных энтропийных преимуществ и/или положительных взаимодействий, приобретенных через атомы, связывающие компоненты. Также было замечено, что MAI продуцируются в клетках в результате реакций пролекарств, таких как изониазид или лиганды-ингибиторы ферментов (например, PTC124 ), с клеточными кофакторами, такими как никотинамидадениндинуклеотид (NADH) и аденозинтрифосфат (АТФ) соответственно.

Примеры

Поскольку ферменты эволюционировали, чтобы прочно связывать свои субстраты, а большинство обратимых ингибиторов связываются в активном центре ферментов, неудивительно, что некоторые из этих ингибиторов поразительно похожи по структуре на субстраты их мишеней. Яркими примерами являются ингибиторы дигидрофолатредуктазы (DHFR). Другими примерами этих имитаторов субстрата являются ингибиторы протеазы , терапевтически эффективный класс антиретровирусных препаратов , используемых для лечения ВИЧ/СПИДа . Структура ритонавира , пептидомиметического (имитирующего пептиды) ингибитора протеазы, содержащего три пептидные связи , показана на рисунке «конкурентное ингибирование» выше. Поскольку этот препарат похож на пептид, являющийся субстратом протеазы ВИЧ, он конкурирует с субстратом в активном центре фермента.

Ингибиторы ферментов часто предназначены для имитации переходного состояния или промежуточного продукта реакции, катализируемой ферментом. Это гарантирует, что ингибитор использует эффект стабилизации переходного состояния фермента, что приводит к лучшему сродству связывания (более низкий K _i ), чем конструкции на основе субстрата. Примером такого ингибитора переходного состояния является противовирусный препарат осельтамивир ; этот препарат имитирует плоскую природу кольцевого иона оксония в реакции вирусного фермента нейраминидазы .

Однако не все ингибиторы основаны на структурах субстратов. Например, структура другого ингибитора протеазы ВИЧ типранавира не основана на пептиде и не имеет явного структурного сходства с белковым субстратом. Эти непептидные ингибиторы могут быть более стабильными, чем ингибиторы, содержащие пептидные связи, поскольку они не будут субстратами для пептидаз и с меньшей вероятностью будут разлагаться.

При разработке лекарств важно учитывать концентрации субстратов, воздействию которых подвергаются целевые ферменты. Например, некоторые ингибиторы протеинкиназ имеют химическую структуру, аналогичную АТФ, одному из субстратов этих ферментов. Однако лекарства, являющиеся простыми конкурентными ингибиторами, должны будут конкурировать с высокими концентрациями АТФ в клетке. Протеинкиназы также могут ингибироваться конкуренцией в местах связывания, где киназы взаимодействуют со своими белками-субстратами, и большинство белков присутствуют внутри клеток в концентрациях, намного более низких, чем концентрация АТФ. Как следствие, если два ингибитора протеинкиназы связываются в активном центре с одинаковой аффинностью, но только один должен конкурировать с АТФ, то конкурентный ингибитор в сайте связывания с белком будет ингибировать фермент более эффективно.

Необратимые ингибиторы

Типы

Реакция DFP

Реакция необратимого ингибитора диизопропилфторфосфата (ДФФ) с сериновой протеазой

Необратимые ингибиторы связываются с сайтом связывания фермента, затем вступают в химическую реакцию с образованием ковалентного комплекса фермент-ингибитор (EI*). Сайт связывания показан синим цветом, ингибитор — зеленым.

Необратимые ингибиторы ковалентно связываются с ферментом, поэтому этот тип ингибирования нельзя легко обратить. Необратимые ингибиторы часто содержат реакционноспособные функциональные группы, такие как азотистые иприты , альдегиды , галогеналканы , алкены , акцепторы Михаэля , фенилсульфонаты или фторфосфонаты . Эти электрофильные группы реагируют с боковыми цепями аминокислот с образованием ковалентных аддуктов . Модифицированными остатками являются остатки с боковыми цепями, содержащими нуклеофилы , такие как гидроксильные или сульфгидрильные группы; к ним относятся аминокислоты серин (который реагирует с ДФП , см. диаграмму «реакция ДФП»), а также цистеин , треонин или тирозин .

Необратимое ингибирование отличается от необратимой инактивации фермента. Необратимые ингибиторы обычно специфичны для одного класса ферментов и не инактивируют все белки; они функционируют не за счет разрушения структуры белка , а за счет специфического изменения активного центра своей мишени. Например, экстремальные значения pH или температуры обычно вызывают денатурацию всей белковой структуры, но это неспецифический эффект. Точно так же некоторые неспецифические химические обработки разрушают структуру белка: например, нагревание в концентрированной соляной кислоте гидролизует пептидные связи , удерживающие белки вместе, высвобождая свободные аминокислоты.

Необратимые ингибиторы проявляют ингибирование, зависящее от времени, и поэтому их эффективность не может быть охарактеризована значением IC ₅₀ . Это связано с тем, что количество активного фермента при данной концентрации необратимого ингибитора будет различным в зависимости от того, как долго ингибитор предварительно инкубируется с ферментом. Вместо этого используются значения k _obs / [ I ], где k _obs представляет собой наблюдаемую скорость инактивации псевдопервого порядка (полученную путем построения логарифма % активности в зависимости от времени), а [ I ] представляет собой концентрацию ингибитора. Параметр k _obs / [ I ] действителен до тех пор, пока ингибитор не насыщает связывание с ферментом (в этом случае k _obs = k _inact ), где k _inact — скорость инактивации.

Измерение

Необратимый механизм ингибирования

Кинетический механизм необратимого торможения. Связывание субстрата показано синим, катализ - красным, связывание ингибитора - зеленым, реакция инактивации - темно-зеленым.

Необратимые ингибиторы сначала образуют обратимый нековалентный комплекс с ферментом (EI или ESI). Затем между ферментом и ингибитором происходит химическая реакция с образованием ковалентно модифицированного «тупикового комплекса» EI* (необратимый ковалентный комплекс). Скорость образования EI* называется скоростью инактивации или k _inact . Поскольку образование ЭИ может конкурировать с ЭС, связывание необратимых ингибиторов можно предотвратить путем конкуренции либо с субстратом, либо со вторым, обратимым ингибитором. Этот защитный эффект является хорошим свидетельством специфической реакции необратимого ингибитора с активным центром.

Стадии связывания и инактивации этой реакции исследуют путем инкубации фермента с ингибитором и анализа количества оставшейся активности с течением времени. Активность будет снижаться в зависимости от времени, обычно после экспоненциального затухания . Подгонка этих данных к уравнению скорости дает скорость инактивации при этой концентрации ингибитора. Это делается при нескольких различных концентрациях ингибитора. Если задействован обратимый комплекс EI, скорость инактивации будет насыщаемой, и подгонка этой кривой даст k _inact и K _i .

Другим методом, который широко используется в этих анализах, является масс-спектрометрия . Здесь точное измерение массы немодифицированного нативного фермента и инактивированного фермента дает увеличение массы, вызванное реакцией с ингибитором, и показывает стехиометрию реакции. Обычно это делается с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF . В дополнительном методе фингерпринтинг пептидной массы включает расщепление нативного и модифицированного белка протеазой, такой как трипсин . Это позволит получить набор пептидов , которые можно проанализировать с помощью масс-спектрометра. Пептид, масса которого изменится после реакции с ингибитором, будет содержать сайт модификации.

Медленное связывание

Химический механизм необратимого ингибирования орнитиндекарбоксилазы DFMO. Пиридоксаль-5'-фосфат (Py) и фермент (Е) не показаны. Адаптировано из Poulin et al. , 1992.

Не все необратимые ингибиторы образуют ковалентные аддукты со своими ферментными мишенями. Некоторые обратимые ингибиторы настолько прочно связываются с ферментом-мишенью, что становятся практически необратимыми. Эти ингибиторы прочного связывания могут демонстрировать кинетику, сходную с ковалентными необратимыми ингибиторами. В этих случаях некоторые из этих ингибиторов быстро связываются с ферментом в низкоаффинном комплексе EI, который затем подвергается более медленной перестройке в очень прочно связанный комплекс EI* (см. диаграмму «механизм необратимого ингибирования»). Такое кинетическое поведение называется медленным связыванием. Эта медленная перегруппировка после связывания часто включает конформационные изменения , поскольку фермент «зажимает» молекулу ингибитора. Примеры ингибиторов медленного связывания включают некоторые важные препараты, такие как метотрексат , аллопуринол и активированная форма ацикловира .

Некоторые примеры

Трипанотионредуктаза , нижняя молекула ингибитора которой связана необратимо, а верхняя – обратимо. Создано из Bond et al , 2004. ( PDB : 1GXF )

Примером необратимого ингибитора протеазы является диизопропилфторфосфат (ДФП) (см. диаграмму «реакция ДФП»). Фермент гидролизует связь фосфор-фтор, но остаток фосфата остается связанным с серином в активном центре , дезактивируя его. Точно так же DFP также реагирует с активным центром ацетилхолинэстеразы в синапсах нейронов и, следовательно, является мощным нейротоксином со летальной дозой менее 100  мг.

Суицидальное ингибирование представляет собой необычный тип необратимого ингибирования, при котором фермент превращает ингибитор в реактивную форму в своем активном центре. Примером может служить ингибитор биосинтеза полиаминов , α-дифторметилорнитин (ДФМО), который является аналогом аминокислоты орнитина и используется для лечения африканского трипаносомоза (сонной болезни). Орнитиндекарбоксилаза может катализировать декарбоксилирование ДФМО вместо орнитина (см. схему «Механизм ингибитора ДФМО»). Однако за этой реакцией декарбоксилирования следует отщепление атома фтора, что превращает это каталитическое промежуточное соединение в сопряженный имин , обладающий высокой электрофильностью. Затем эта реактивная форма DFMO реагирует с остатком цистеина или лизина в активном центре, необратимо инактивируя фермент.

Поскольку необратимое ингибирование часто включает начальное образование нековалентного комплекса ингибитора фермента (EI), иногда ингибитор может связываться с ферментом более чем одним способом. Например, на рисунке, показывающем трипанотионредуктазу простейшего паразита человека Trypanosoma cruzi , две молекулы ингибитора, называемого акрихиновым ипритом , связаны в его активном центре. Верхняя молекула связана обратимо, а нижняя связана ковалентно, так как она прореагировала с аминокислотным остатком через свою азотистую ипритную группу.

Приложения

Ингибиторы ферментов встречаются в природе, а также производятся искусственно в лаборатории. Природные ингибиторы ферментов регулируют многие метаболические процессы и необходимы для жизни. Кроме того, естественные яды часто являются ингибиторами ферментов, которые эволюционировали для использования в качестве ядовитых агентов против хищников, добычи и конкурирующих организмов. Эти естественные токсины включают некоторые из самых ядовитых известных веществ. Искусственные ингибиторы часто используются в качестве лекарств, но также могут быть инсектицидами, такими как малатион , гербицидами, такими как глифосат , или дезинфицирующими средствами , такими как триклозан . Другие искусственные ингибиторы ферментов блокируют ацетилхолинэстеразу , фермент, расщепляющий ацетилхолин , и используются в качестве нервно-паралитических агентов в химическом оружии .

Метаболическая регуляция

Ингибирование ферментов является общей чертой контроля метаболических путей в клетках. Метаболический поток через путь часто регулируется метаболитами пути, действующими как ингибиторы и усилители для ферментов того же пути. Гликолитический путь является классическим примером. Этот катаболический путь потребляет глюкозу и производит АТФ , НАДН и пируват . Ключевым этапом регуляции гликолиза является ранняя реакция пути, катализируемая фосфофруктокиназой-1 (PFK1). Когда уровни АТФ повышаются, АТФ связывается с аллостерическим сайтом в PFK1, чтобы снизить скорость ферментативной реакции; гликолиз ингибируется и продукция АТФ падает. Этот контроль с отрицательной обратной связью помогает поддерживать постоянную концентрацию АТФ в клетке. Однако метаболические пути регулируются не только посредством ингибирования, поскольку не менее важна активация ферментов. Что касается PFK1, фруктозо-2,6-бисфосфат и АДФ являются примерами метаболитов, которые являются аллостерическими активаторами.

Физиологическое ингибирование ферментов также может быть вызвано специфическими белковыми ингибиторами. Этот механизм происходит в поджелудочной железе , которая синтезирует многие пищеварительные ферменты-предшественники, известные как зимогены . Многие из них активируются протеазой трипсина , поэтому важно ингибировать активность трипсина в поджелудочной железе, чтобы предотвратить самопереваривание органа. Одним из способов контроля активности трипсина является выработка специфического и сильнодействующего белка -ингибитора трипсина в поджелудочной железе. Этот ингибитор прочно связывается с трипсином, предотвращая активность трипсина, которая в противном случае была бы вредна для органа. Хотя ингибитор трипсина представляет собой белок, он избегает гидролиза субстрата протеазой за счет исключения воды из активного центра трипсина и дестабилизации переходного состояния. Другие примеры белков-ингибиторов физиологических ферментов включают барназный ингибитор барназы бактериальной рибонуклеазы .

Природные яды

Чтобы препятствовать хищничеству семян , бобовые содержат ингибиторы трипсина , которые мешают пищеварению.

Животные и растения эволюционировали, чтобы синтезировать широкий спектр ядовитых продуктов, включая вторичные метаболиты , пептиды и белки, которые могут действовать как ингибиторы. Природные токсины обычно представляют собой небольшие органические молекулы и настолько разнообразны, что, вероятно, существуют естественные ингибиторы большинства метаболических процессов. Метаболические процессы, на которые нацелены природные яды, включают в себя не только ферменты в метаболических путях, но и могут включать ингибирование функций рецепторов, каналов и структурных белков в клетке. Например, паклитаксел (таксол), органическая молекула, обнаруженная в тихоокеанском тисе , прочно связывается с димерами тубулина и ингибирует их сборку в микротрубочки в цитоскелете .

Многие природные яды действуют как нейротоксины , которые могут вызвать паралич , ведущий к смерти, и служат для защиты от хищников или при охоте и захвате добычи. Некоторые из этих естественных ингибиторов, несмотря на их токсические свойства, ценны для терапевтического применения в более низких дозах. Примером нейротоксина являются гликоалкалоиды из видов растений семейства Solanaceae (включая картофель , помидоры и баклажаны ), которые являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы . Ингибирование этого фермента вызывает неконтролируемое увеличение нейротрансмиттера ацетилхолина, мышечный паралич и затем смерть. Нейротоксичность также может быть результатом ингибирования рецепторов; например, атропин из белладонны ( Atropa belladonna ), который действует как конкурентный антагонист мускариновых ацетилхолиновых рецепторов .

Хотя многие природные токсины являются вторичными метаболитами, эти яды также включают пептиды и белки. Примером токсичного пептида является альфа-аманитин , который встречается у родственников бледной шляпки . Это мощный ингибитор фермента, в данном случае предотвращающий транскрипцию ДНК ферментом РНК-полимеразой II . Токсин водорослей микроцистин также является пептидом и является ингибитором протеинфосфатаз . Этот токсин может загрязнять источники воды после цветения водорослей и является известным канцерогеном, который также может вызывать острое кровотечение из печени и смерть при более высоких дозах.

Белки также могут быть естественными ядами или антипитательными веществами , такими как ингибиторы трипсина (обсуждаемые в разделе «Метаболическая регуляция» выше), которые содержатся в некоторых бобовых . Менее распространенным классом токсинов являются токсичные ферменты: они действуют как необратимые ингибиторы ферментов-мишеней и действуют путем химической модификации ферментов-субстратов. Примером может служить рицин , чрезвычайно мощный белковый токсин, содержащийся в бобах клещевины . Этот фермент представляет собой гликозидазу , инактивирующую рибосомы. Поскольку рицин является каталитическим необратимым ингибитором, это позволяет всего одной молекуле рицина убить клетку.

Наркотики

Коэнзим фолиевой кислоты (вверху) по сравнению с противораковым препаратом метотрексатом (внизу)

Структура силденафила (виагры)

Чаще всего ингибиторы ферментов используются в качестве лекарств для лечения болезней. Многие из этих ингибиторов нацелены на человеческий фермент и направлены на коррекцию патологического состояния. Например, аспирин является широко используемым лекарством, которое действует как суицидальный ингибитор фермента циклооксигеназы . Это ингибирование, в свою очередь, подавляет выработку провоспалительных простагландинов , и поэтому аспирин можно использовать для уменьшения боли, лихорадки и воспаления.

По состоянию на 2017 год примерно 29% одобренных лекарств являются ингибиторами ферментов, из которых примерно одна пятая - ингибиторами киназ . Примечательным классом киназных мишеней для лекарств являются рецепторные тирозинкиназы , которые являются важными ферментами, регулирующими рост клеток ; их чрезмерная активация может привести к раку. Следовательно, ингибиторы киназы , такие как иматиниб , часто используются для лечения злокачественных новообразований. Янус-киназы - еще один примечательный пример мишеней для лекарственных ферментов. Ингибиторы янус-киназ блокируют выработку воспалительных цитокинов , поэтому эти ингибиторы используются для лечения различных воспалительных заболеваний , включая артрит , астму и болезнь Крона .

Пример структурного сходства некоторых ингибиторов с субстратами ферментов, на которые они нацелены, можно увидеть на рисунке, сравнивающем метотрексат и фолиевую кислоту . Фолиевая кислота представляет собой окисленную форму субстрата дигидрофолатредуктазы , фермента, который сильно ингибируется метотрексатом. Метотрексат блокирует действие дигидрофолатредуктазы и тем самым останавливает биосинтез тимидина . Этот блок биосинтеза нуклеотидов избирательно токсичен для быстрорастущих клеток, поэтому метотрексат часто используют в химиотерапии рака.

Распространенным средством для лечения эректильной дисфункции является силденафил (виагра). Это соединение является мощным ингибитором цГМФ-специфической фосфодиэстеразы 5 типа , фермента, разрушающего сигнальную молекулу циклического гуанозинмонофосфата . Эта сигнальная молекула вызывает расслабление гладкой мускулатуры и обеспечивает приток крови к пещеристым телам , что вызывает эрекцию. Поскольку препарат снижает активность фермента, который останавливает сигнал, он продлевает этот сигнал в течение более длительного периода времени.

Антибиотики

Структура комплекса между пенициллином  G и транспептидазой Streptomyces ( PDB : 1PWC ​)

Лекарства также используются для ингибирования ферментов, необходимых для выживания патогенов. Например, бактерии окружены толстой клеточной стенкой , состоящей из сетчатого полимера, называемого пептидогликаном . Многие антибиотики, такие как пенициллин и ванкомицин, ингибируют ферменты, которые производят, а затем сшивают нити этого полимера вместе. Это приводит к тому, что клеточная стенка теряет прочность, и бактерии лопаются. На рисунке молекула пенициллина (показана в виде шарика и палочки) показана связанной со своей мишенью, транспептидазой из бактерий Streptomyces R61 (белок показан в виде ленточной диаграммы ).

Разработка антибиотиков облегчается, когда фермент, необходимый для выживания патогена, отсутствует или сильно отличается у людей. Человек не вырабатывает пептидогликан, поэтому антибиотики, подавляющие этот процесс, избирательно токсичны для бактерий. Селективная токсичность антибиотиков также достигается за счет использования различий в структуре рибосом у бактерий или в том, как они производят жирные кислоты .

Противовирусные препараты

Препараты, ингибирующие ферменты, необходимые для репликации вирусов, эффективны при лечении вирусных инфекций. Противовирусные препараты включают ингибиторы протеазы , используемые для лечения ВИЧ/СПИДа и гепатита С , ингибиторы обратной транскриптазы, нацеленные на ВИЧ/СПИД, ингибиторы нейраминидазы, нацеленные на грипп , и ингибиторы терминазы, нацеленные на цитомегаловирус человека .

пестициды

Многие пестициды являются ингибиторами ферментов. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) — это фермент, обнаруженный у животных, от насекомых до человека. Он необходим для функционирования нервных клеток благодаря механизму расщепления нейротрансмиттера ацетилхолина на его составляющие, ацетат и холин . Это несколько необычно для нейротрансмиттеров, поскольку большинство из них, включая серотонин , дофамин и норэпинефрин , поглощаются из синаптической щели , а не расщепляются. Большое количество ингибиторов АХЭ используется как в медицине, так и в сельском хозяйстве. Обратимые конкурентные ингибиторы, такие как эдрофоний , физостигмин и неостигмин , используются при лечении миастении и при анестезии для снятия мышечной блокады. Карбаматные пестициды также являются примерами обратимых ингибиторов АХЭ. Фосфорорганические пестициды, такие как малатион , паратион и хлорпирифос, необратимо ингибируют ацетилхолинэстеразу.

Гербициды

Гербицид глифосат является ингибитором 3-фосфошикимат-1-карбоксивинилтрансферазы , другие гербициды, такие как сульфонилмочевины , ингибируют фермент ацетолактатсинтазу . Оба фермента необходимы растениям для производства аминокислот с разветвленной цепью . Многие другие ферменты ингибируются гербицидами, в том числе ферменты, необходимые для биосинтеза липидов и каротиноидов , процессов фотосинтеза и окислительного фосфорилирования .

Открытие и разработка ингибиторов

Роботы используются для высокопроизводительного скрининга химических библиотек с целью обнаружения новых ингибиторов ферментов.

Новые лекарства являются продуктом длительного процесса разработки лекарств , первым этапом которого часто является открытие нового ингибитора ферментов. Существует два принципиальных подхода к обнаружению этих ингибиторов.

Первый общий метод — рациональная разработка лекарств , основанная на имитации переходного состояния химической реакции, катализируемой ферментом. Разработанный ингибитор часто очень похож на субстрат, за исключением того, что часть субстрата, которая подвергается химической реакции, заменяется химически стабильной функциональной группой , которая напоминает переходное состояние. Поскольку фермент эволюционировал для стабилизации переходного состояния, аналоги переходного состояния обычно обладают более высоким сродством к ферменту по сравнению с субстратом и, следовательно, являются эффективными ингибиторами.

Второй способ обнаружения новых ингибиторов ферментов — это высокопроизводительный скрининг больших библиотек структурно разнообразных соединений для выявления хитовых молекул, которые связываются с ферментом. Этот метод был расширен за счет виртуального скрининга баз данных различных молекул с использованием компьютеров, после чего следует экспериментальное подтверждение связывания результатов виртуального скрининга. Дополнительные подходы, которые могут предоставить новые отправные точки для ингибиторов, включают обнаружение свинца на основе фрагментов и химические библиотеки, кодированные ДНК (DEL).

Хиты любого из вышеперечисленных подходов могут быть оптимизированы для связывания с высоким сродством, которые эффективно ингибируют фермент. Компьютерные методы прогнозирования ориентации связывания и аффинности ингибитора к ферменту, такие как молекулярная стыковка и молекулярная механика, могут использоваться для помощи в процессе оптимизации. Новые ингибиторы используются для получения кристаллографических структур фермента в комплексе ингибитор/фермент, чтобы показать, как молекула связывается с активным центром, что позволяет вносить изменения в ингибитор для оптимизации связывания в процессе, известном как разработка лекарств на основе структуры . . Этот цикл тестирования и улучшения повторяется до тех пор, пока не будет получен достаточно мощный ингибитор.

Смотрите также

• Протеомика, основанная на активности - раздел протеомики , в котором ковалентные ингибиторы ферментов используются в качестве репортеров для мониторинга активности ферментов.
• Антиметаболит - ингибитор фермента, который используется для предотвращения роста и деления клеток.
• Аналог переходного состояния - тип ингибитора фермента, который имитирует переходное состояние химической реакции, катализируемой ферментом.

Рекомендации

Внешние ссылки

• "БРЕНДА" . Архивировано из оригинала 1 апреля 2022 года., База данных ферментов со списками известных ингибиторов для каждой записи
• «ПабХим» . Национальный центр биотехнологической информации . Национальная медицинская библиотека.База данных препаратов и ингибиторов ферментов
• «Символика и терминология в кинетике ферментов» . Архивировано из оригинала 20 июня 2006 г.Рекомендации Номенклатурного комитета Международного союза биохимиков (NC-IUB) по терминологии ингибирования ферментов