Спецификация эктодермы - Ectoderm specification
У Xenopus laevis спецификация трех зародышевых листков ( энтодермы , мезодермы и эктодермы ) происходит на стадии бластулы . Были предприняты большие усилия для определения факторов, определяющих энтодерму и мезодерму. С другой стороны, за последнее десятилетие было описано только несколько примеров генов, которые необходимы для спецификации эктодермы . Первой идентифицированной молекулой, необходимой для спецификации эктодермы, была убиквитинлигаза Ectodermin (Ecto, TIF1-γ, TRIM33); позже было обнаружено, что деубиквитинирующий фермент, FAM / USP9x , способен преодолевать эффекты убиквитинирования, производимого Ectodermin в Smad4 (Dupont et al., 2009). Было предложено два фактора транскрипции для контроля экспрессии генов, специфичных для эктодермы: POU91 / Oct3 / 4 и FoxIe1 / Xema . Новый фактор, специфичный для эктодермы, XFDL156 , оказался важным для подавления дифференцировки мезодермы из плюрипотентных клеток.
Эктодермин и ФАМ
Биологическая роль эктодермина и FAM
Белок эктодермин, впервые идентифицированный у эмбрионов Xenopus , способствует эктодермальной судьбе и подавляет образование мезодермы, опосредованное передачей сигналов трансформирующего фактора роста β (TGFβ) и костных морфогенных белков (BMP), членов суперсемейства TGFβ. Когда лиганды TGFβ связываются с рецепторами TGFβ, они вызывают активацию сигнальных преобразователей R-Smads ( Smad2 , Smad3 ). Smad4 образует комплекс с активированными R-Smads и активирует транскрипцию определенных генов в ответ на сигнал TGFβ. Путь BMP передает свои сигналы аналогичным образом, но через другие типы R-Smads ( Smad1 , Smad5 и Smad8 ). Фактор транскрипции Smad4 является единственным общим медиатором, общим для путей TGFβ и BMP. Во время спецификации эктодермы функция Smad4 регулируется посредством убиквитинирования и деубиквитинирования, производимого Ectodermin и FAM (аббревиатура от Fat acets у млекопитающих) соответственно. Состояние убиквитинирования Smad4 будет определять, способен ли он отвечать на сигналы, полученные от TGFβ и BMP. Равновесие активности, локализации и времени трансдукторов TGFβ и BMP, Smad4, FAM и эктодермина должно быть достигнуто, чтобы иметь возможность модулировать экспрессию генов, необходимых для формирования зародышевого листка.
Идентификация эктодермина и ФАМ
КДНК библиотеки из стадии бластулы из эмбриона лягушки клонируют в экспрессирующих плазмид РНК для генерирования синтетической мРНК. Затем мРНК вводили в несколько эмбрионов Xenopus на четырехклеточной стадии и искали в ранних эмбрионах бластулы расширение области эктодермального маркера Sox2 и снижение экспрессии мезодермального маркера Xbra . Эктодермин был одним из 50 клонов, демонстрирующих этот фенотип при введении эмбрионам. Идентификация FAM была проведена посредством скрининга siRNA для обнаружения деубиквитиназ, которые регулируют ответ на TGFβ.
Эктодермин и локализация FAM
МРНК эктодермина откладывается у матери в животном полюсе яйца. На ранней стадии бластулы эмбриона мРНК и белок эктодермина образуют градиент, который идет от анимального полюса (самая высокая концентрация) до маргинальной зоны (самая низкая концентрация), чтобы предотвратить TGFβ и узловые сигналы, которые вызывают мезодерму, исходящую из вегетативного полюса. МРНК эктодермина обогащается на дорсальной стороне эмбриона, и в конце этой стадии экспрессия постепенно исчезает. Smad4 убиквитинируется эктодермином в ядре и экспортируется в цитоплазму, где он может быть деубиквитинирован с помощью FAM; таким образом Smad4 можно переработать и снова заработать. Хотя профиль экспрессии FAM отсутствует у ранних эмбрионов у Xenopus , у рыбок данио гомолог FAM экспрессируется повсеместно на двухклеточной стадии, но по мере развития он экспрессируется только в головной центральной нервной системе.
Эктодермин и функции ФАМ
Эктодермин представляет собой лигазу убиквитина E3, которая ингибирует пути передачи сигналов TGFβ и BMP путем ингибирования Smad4 посредством убиквитинирования лизина 519, а также посредством прямого связывания с фосфо-Smad2. Инъекция мРНК Ecto в маргинальную зону приводит к экспансии раннего эктодермального маркера Sox2 и снижению мезодермальных маркеров (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 и Mixer). Противоположное происходит в экспериментах по нокдауну эктодермина с использованием стратегии морфолино; эмбрионы становятся более чувствительными к ответу активина, они демонстрируют увеличение и расширение экспрессии мезодермальных специфических генов и подавляют экспрессию нервной пластинки и маркера эпидермиса (Sox2 и цитокератин соответственно). В соответствии с зависимой от RING-пальца убиквитин-лигазной активностью эктодермина, мутант Ecto RING-finger (C97A / C100A) неактивен в отношении увеличения функции. Усиление функции FAM увеличивает ответ от BMP и TGFβ и его потерю функции из-за мутации в критическом остатке для его активности, вызывающей ингибирование ответа TGFβ.
Сохранение эктодермина и FAM у других видов
Молекулярная функция эктодермина человека действовать как негативный регулятор Smad4 предполагает, что эта специфическая функция сохраняется среди позвоночных. Идентичность последовательностей между гомологами FAM превышает 90% при сравнении гомологов Xenopus , рыбок данио, мышей и человека, что позволяет предположить, что это также может сохраняться среди других организмов. Действительно, инактивация гена нокаута у эмбрионов мышей показала, что функция эктодермина как ингибитора передачи сигналов TGF-бета сохраняется. Эмбрионы, лишенные эктодермина, демонстрируют дефектное развитие передней висцеральной энтодермы (AVE), которая является первой тканью, которая индуцируется сигналами TGF-бета у эмбрионов мыши; в соответствии с потерей ингибитора у эмбрионов эктодермина - / - наблюдается повышенная индукция AVE. Поскольку AVE является естественным источником секретируемых антагонистов TGF-бета, эта первичная экспансия AVE вызывала вторично, на более поздних стадиях, ингибирование внеклеточных лигандов TGF-бета, что приводило к отсутствию развития у эмбрионов мезодермы. Эта модель была подтверждена открытием, что эктодермин - / - эмбрионы были спасены до дикого типа (нормальный AVE, нормальное развитие мезодермы) за счет снижения генетической дозировки основного TGF-бета-лиганда эмбриона, Nodal. Кроме того, подтверждая роль ингибитора TGF-бета, ткане-селективная делеция эктодермина из эпибласта (от которого происходит мезодерма, но не AVE) оставила AVE нетронутой, но вызвала на этот раз расширение судьбы передней мезодермы, что свидетельствует об увеличении отзывчивость на сигналы TGF-бета. В совокупности эти данные подтвердили с помощью генетических инструментов клеточно-автономную роль эктодермина как ингибитора ответов Smad4, ранее идентифицированных у эмбрионов Xenopus и линий клеток человека.
FOXI1e
Биологическая роль FOXI1e
Во время раннего развития у Xenopus фактор транскрипции FoxI1e / Xema активирует эпидермальную дифференцировку и репрессирует специфические гены энтодермы и мезодермы в шапочках животных (Suri et al., 2005). Предполагается, что FoxI1e активен до того, как эктодерма дифференцируется на эпидермис и центральную нервную систему.
Идентификация FoxI1e
Mir et al., 2005 идентифицировали FoxI1e (Xema) путем отбора генов, которые подавлялись под действием индуцирующих мезодерму сигналов в эктодерме по сравнению с вегетативной областью ранних эмбрионов бластулы . Кроме того, высокая экспрессия этого гена наблюдалась в шапках животных у эмбрионов, у которых отсутствует VegT, по сравнению с диким типом.
Локализация в клетке
МРНК FoxI1e экспрессируется зиготически (стадия 8.5) и достигает более высокого уровня экспрессии на ранних этапах гаструляции и поддерживает этот уровень в нейруле, хвостовой почке до ранних стадий головастика. FoxI1e имеет своеобразный мозаичный паттерн экспрессии, он сначала экспрессируется в дорсальной эктодерме, и пока гаструла прогрессирует, экспрессия проходит через вентральную сторону и ее экспрессия подавляется на дорсальной стороне, когда формируется нервная пластинка. FoxI1e зависит от сигналов BMP на стадии нейрулы, ограничивая локализацию FoxI1e на вентральной стороне эктодермы.
Функция и регуляция белков
FoxI1e / Xema принадлежит к классу FoxI1 семейства факторов транскрипции головы вилки, которые, как известно, участвуют в формировании мезодермы, развитии глаз и спецификации вентральной головки. Было высказано предположение, что Notch и / или NODAL , экспрессируемые в вегетативной / мезодермальной области раннего эмбриона бластулы , потенциально могут быть ингибиторами FoxI1e.
Потеря и усиление функции
Ингибирование созревания мРНК FoxI1e с помощью морфолино, блокирующего сплайсинг, демонстрирует пороки развития эпидермиса и проницаемой системы и подавляет экспрессию генов, специфичных для эктодермы, тогда как сверхэкспрессия FoxI1e ингибирует образование мезодермы и энтодермы. Растительные структуры образуют поздние массы бластулы, которые обычно дают начало энтодерме и мезодерме, при инъекции мРНК FoxI1e они способны экспрессировать эктодермальные специфические маркеры (панэктодермальный E-кадгерин, эпителиальный цитокератин, маркер нервного гребня Slug и нейральный маркер Sox- 2) при снижении экспрессии энтодермальных маркеров (энтодермин, Xsox17a).
XFDL156
Биологическая роль XFDL156
В р53 белок связывается с промоторов ранних генов мезодермы. p53 представляет собой депонированный от матери транскрипт, который образует комплекс транскрипционных факторов с Smad2 и управляет экспрессией генов, участвующих в индукции мезодермы и активации генов-мишеней TGFβ. Цинка (Zn) , -finger ядерного белка XFDL159, выраженная в крышке животного, действует как фактор эктодермы их определяют эктодермы пути ингибирования р53 от активации генов для дифференцировки мезодермы.
Идентификация XFDL156
Конструирование библиотеки кДНК из шапок животных на стадии 11,5 клонировали в вектор экспрессии и генерировали мРНК. Затем синтетическую РНК вводили в эмбрионы, и шапки животных этих собранных эмбрионов получали и подвергали обработке активином . Xbra был восстановлен путем отбора клона, который репрессирует мезодермальный маркер Xbra.
Локализация XFDL156
Поскольку XFDL156 является фактором, который взаимодействует с p53, локализация этого белка находится в ядре (Sasai et al., 2008). МРНК XFDL156 депонируется у матери, а затем экспрессируется зиготически. График экспрессии гена показывает более высокий уровень экспрессии на ранней стадии гаструлы, половинное снижение экспрессии на средней стадии гаструлы, а к стадии 20 экспрессия исчезает.
Белковая функция XFDL156
XFDR цинковый палец связывается с регуляторной областью p53, расположенной в C-концевом домене, и на его экспрессию не влияет присутствие активина, факторов транскрипции FoxI1e или XLPOU91.
Потеря и усиление функции в XFDL156
Утрата функции морфолино вызывает неправильную мезодермальную дифференцировку в эктодермальных областях; это вызвано десупрессией мезодермальных маркеров (Xbra, VegT и Mix.2). Увеличение функций вызывает снижение экспрессии мезодермальных маркеров.
Сохранение гомологов XFDL у других видов
Гомологи XFDR156 человека и мыши способны дополнять функцию XFDR, взаимодействуя с p53 и подавляя его действие в качестве фактора транскрипции.
Индукция эктодермы в ранней бластуле у эмбриона Xenopus .
